水楊酸調(diào)控乙烯反應(yīng)因子提高雛菊切花保鮮效果

陳星星 張治平

摘要：乙烯反應(yīng)因子（ERFs）是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在乙烯釋放、脅迫防御等生理生化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。然而關(guān)于雛菊（Bellis perennis L.）ERF基因家族的組成特征及其在切花過(guò)程中的功能作用知之甚少。結(jié)果表明，在雛菊共鑒定出7個(gè)乙烯反應(yīng)因子（BpERF），其蛋白質(zhì)長(zhǎng)度110～329 aa，相對(duì)分子量2.61～5.25 ku，等電點(diǎn)4.72～8.36。系統(tǒng)發(fā)育和蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果表明，這7個(gè)BpERF可分為3個(gè)亞家族（ERF-a、ERF-b和ERF-c）并具有AP2保守結(jié)構(gòu)域和YRG、RAYD等保守序列。基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子分析表明，BpERF的啟動(dòng)子中含有許多細(xì)胞分化和植物激素相關(guān)的順式元件，其中ERF-c亞家族的BpERF005同時(shí)含有衰亡順式作用元件和水楊酸響應(yīng)元件，表明BpERF005在切花保鮮中可能響應(yīng)水楊酸（SA）的施用。轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-Seq）表明，BpERF005在SA處理下轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果高度一致；此外，SA處理下，BpERF005在花序中的表達(dá)模式與乙烯排放速率呈顯著（P=0.024 9＜0.05）線性正相關(guān)關(guān)系，表明BpERF005是SA調(diào)控雛菊乙烯合成的指示基因，且施用SA顯著增加了雛菊切花的瓶插壽命。綜上，水楊酸可通過(guò)抑制雛菊切花過(guò)程中乙烯反應(yīng)因子（BpERF005）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而降低乙烯排放速率以延長(zhǎng)雛菊切花的瓶插壽命。

關(guān)鍵詞：雛菊；瓶插壽命；水楊酸；乙烯反應(yīng)因子；全基因組；基因表達(dá)水平

中圖分類號(hào)：S682.1+10.9+3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）13-0041-08

雛菊（Bellis perennis L.）是世界花卉貿(mào)易中最具商業(yè)價(jià)值的觀賞花卉之一，由于其花色艷麗、花姿優(yōu)美、花型洋溢大方而廣受市場(chǎng)追捧［1］。然而，雛菊品種因花朵面積較寬，蒸騰失水量大造成花瓣散亂等現(xiàn)象而不耐插切花，且當(dāng)其浸在花瓶溶液時(shí)，莖端處易被微生物附生污染，使得瓶插壽命進(jìn)一步縮短［2］。采后導(dǎo)致衰老進(jìn)程加快是影響切花適銷性的關(guān)鍵因素，引起采后衰老的關(guān)鍵因素包括碳水化合物消耗嚴(yán)重、呼吸速率升高、莖部微生物附生積水、花序失水、活性氧累積、抗氧化系統(tǒng)活性降低及乙烯（ET）產(chǎn)量增加［3］，其中花朵的衰老與乙烯釋放速率、單位產(chǎn)量密切相關(guān)，衰老速率對(duì)乙烯合成高度敏感并受乙烯轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控［4］。

在植物體中，乙烯的生物學(xué)功能通過(guò)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)，乙烯反應(yīng)因子（ERF）作為乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的元件，在乙烯的生物合成及功能表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用［5］。ERF位于乙烯信號(hào)通路下游，是典型的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是植物AP2/ERF超家族的重要成員，參與植物生理生化和非生物脅迫反應(yīng)［6］。AP2/ERF家族成員的特征是存在一個(gè)AP2-DNA結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域可與下游啟動(dòng)子區(qū)域的-GCC-盒、DRE或C-重復(fù)序列的順式元件相互作用從而直接或間接作用于靶向基因，根據(jù)AP2-DNA結(jié)合域的數(shù)量和基序相似性，ERF家族可分為5個(gè)亞家族［7］。近幾十年來(lái)，從植物中分離和克隆了許多ERF基因，這些基因參與調(diào)控生物體生理發(fā)育、細(xì)胞增殖、脅迫反應(yīng)和激素合成，但有研究表明，并不是所有的ERF皆作用于乙烯的生物合成，有些ERF可能對(duì)植物相關(guān)生理途徑無(wú)任何功能［8］，目前關(guān)于菊花ERF的組成及功能鮮有研究涉及。

水楊酸（SA）是一種廣泛存在于植物中的酚類化合物，是被廣泛使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在高等植物中，SA通過(guò)莽草酸循環(huán)的苯丙氨酸途徑和異分支酸途徑合成，苯丙氨酸途徑在細(xì)胞質(zhì)中起作用，而異分支酸途徑在葉綠體中表達(dá)［9］。SA可介導(dǎo)植物的防御反應(yīng)并調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，如種子發(fā)芽、激活免疫系統(tǒng)、開(kāi)花和衰老［10］。近年來(lái)，由于SA在水果和蔬菜采后質(zhì)量保持方面表現(xiàn)出良好效果，受到了越來(lái)越多的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，SA可通過(guò)抑制乙烯前體物的轉(zhuǎn)化以介導(dǎo)乙烯的生物合成，從而影響花卉采后的衰老代謝進(jìn)程［11］。以上研究為水楊酸應(yīng)用植物保鮮提供了一定的理論依據(jù)，然而關(guān)于水楊酸如何介導(dǎo)乙烯合成的機(jī)制尚不清楚，且關(guān)于水楊酸如何作用于菊花的采后保鮮更是鮮有涉及?；诖耍狙芯客诰蛄藢?duì)雛菊ERF的組成與特征，并探索了水楊酸對(duì)雛菊靶向ERF的影響。研究結(jié)果可為揭示水楊酸應(yīng)用切花保鮮提供分子理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2022年1—3月在河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝培養(yǎng)室中進(jìn)行。供試雛菊品種為塔索BEL0201，來(lái)自河南省洛陽(yáng)千卉谷農(nóng)業(yè)有限公司。

選擇發(fā)育相近、舌狀花完全開(kāi)放、花朵健壯、花莖硬挺的雛菊作為試材，將雛菊根莖于水中剪切成斜口型，保留花梗長(zhǎng)度約20 cm，將切花插入裝有100 mL常規(guī)培養(yǎng)液（無(wú)水楊酸）的三角錐形瓶（250 mL），雛菊花莖切口懸于培養(yǎng)液中，每瓶5株，插瓶深度約5 cm，瓶口采用透氣薄膜封住，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，并在0、3、6、12、24、48、96、120 h取樣保存于-80 ℃環(huán)境。

水楊酸處理即更換培養(yǎng)液時(shí)噴施5 mL的 100 mg/L 水楊酸溶液，該水楊酸質(zhì)量濃度已被證明是菊花切花保鮮的最佳濃度［12］，對(duì)照加入相同體積蒸餾水。

1.2 BpERF基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

從菊科基因組庫(kù)（http：//www.amwayabrc.com/）中下載菊花全基因組數(shù)據(jù)，基于HMMER（v3.1）平臺(tái)檢索菊花ERF家族成員［13］，將搜索結(jié)果提交到NCBI保守域搜索平臺(tái)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。手動(dòng)篩選含AP2結(jié)構(gòu)域序列，初步篩選得到229條序列，分別依次命名為AP2/ERF001～AP2/ERF229。去除殘缺及未定義序列，共得到7條完整序列，分別命名為BpERF001～BpERF007，將BpERF提交至蛋白質(zhì)理化性質(zhì)程序（https：//zenodo.org/record/）以預(yù)測(cè)全長(zhǎng)氨基酸序列的理化性質(zhì)，同時(shí)BpERF蛋白質(zhì)序列提交WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.3 BpERF系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和順式作用元件分析

通過(guò)擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）獲取擬南芥的ERF基因家族的氨基酸序列。將BpERF與同源擬南芥氨基酸序列（AtERF）數(shù)據(jù)共同整合為特定的fasta文件，并借助MEGA-X在線軟件（https：//www. megasoftware.net/）采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap設(shè)置為2 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值［14］。

基因結(jié)構(gòu)文件取自菊花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Gff3文件，利用MEME在線工具（https：//meme-suite.org/meme）對(duì)保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，簡(jiǎn)介模體（Motif）設(shè)置為6，其余參數(shù)默認(rèn)?；赑lant CARE線上工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be）以預(yù)測(cè)BpERF的啟動(dòng)子順式調(diào)控作用元件。

1.4 BpERF轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取與分析

通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載的7個(gè)BpERF轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和NCBI的序列讀取數(shù)據(jù)庫(kù)（SRA）下載雛菊的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA548462），將下載的SRA默認(rèn)格式文件轉(zhuǎn)換為fastq文件，再導(dǎo)入fastqc軟件獲取質(zhì)控報(bào)告。fastq文件利用trim galore、kallisto軟件指令去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)并進(jìn)行序列對(duì)比，以獲取TPM表達(dá)量［15］，通過(guò)TBtools在線工具對(duì)提取的AP2/ERF家族成員表達(dá)量數(shù)據(jù)構(gòu)建熱圖。

1.5 染色體定位和同線性分析

使用TBtools的Map Genes On Genome From Sequence Files方法定位7個(gè)BpERF的染色體位置。使用的預(yù)序列從Phytozome在線平臺(tái)獲?。╤ttps：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。采用TBtools的Circos-plots工具鏈接多組連鎖群（LG）之間的關(guān)系進(jìn)行共線性可視化，使用默認(rèn)參數(shù)的MCScanX并設(shè)置為pBLAST≤10-5［16］。

1.6 RT-qPCR、RNA-Seq驗(yàn)證表達(dá)數(shù)據(jù)及乙烯排放速率測(cè)定

利用氣相色譜儀同步測(cè)定雛菊花瓣的乙烯釋放速率，具體步驟參考史國(guó)安等的方法［5］。RNA測(cè)序用于交叉驗(yàn)證RT-qPCR的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。每次處理完成后，分別從3株植株中收獲莖、葉和花序組織，立即冷凍在液氮中，并儲(chǔ)存在-80 ℃環(huán)境用于RNA分離和RT-qPCR分析，提取、純化雛菊RNA，將純化基因分為2個(gè)部分，一部分用于RT-qPCR分析，其看家基因、反應(yīng)程序及條件參照李菲等的研究［17］，目標(biāo)基因序列相關(guān)引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)（F：5′-ATCATCTCTCTCTTCTCTGT-3′、R：5′-CAAACCAAACCGAAACGA-3′），其相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCT斷層掃描方法算法表示。另一部分運(yùn)送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用Illumina Novaseq 3000進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和數(shù)據(jù)分析，基因轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果以每百萬(wàn)讀數(shù)（TPM）的轉(zhuǎn)錄物水平表示。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

借助Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用DPS 14.0進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)，Origin 9進(jìn)行相關(guān)圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpERF基因家族理化性質(zhì)特征分析

將BpERF基因序列與擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中的ERF蛋白序列進(jìn)行BLAST對(duì)比，結(jié)果表明，在雛菊的基因組中共鑒定出7個(gè)ERF基因，分別命名為BpERF001、BpERF002、BpERF003、BpERF004、BpERF005、BpERF006和BpERF007（表1）。由表1可知，BpERF家族蛋白質(zhì)長(zhǎng)度范圍為110～329 aa，蛋白質(zhì)相對(duì)分子量在2.57～5.25 ku之間，等電點(diǎn)范圍為4.72～8.36，其中BpERF001、BpERF002、BpERF004為酸性蛋白，其他則為堿性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，BpERF001、BpERF004位于細(xì)胞質(zhì)中，BpERF002、BpERF003、BpERF006位于細(xì)胞核中，BpERF005、BpERF007位于線粒體中。

2.2 BpERF系統(tǒng)發(fā)育、保守基序和氨基酸序列比對(duì)分析

采用鄰接法分析7個(gè)BpERF和5個(gè)擬南芥直系同源物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)BpERF全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比，根據(jù)結(jié)構(gòu)域分析，將7個(gè)BpERF基因分為3個(gè)亞家族（ERF-a、ERF-b和ERF-c），其中BpERF002、BpERF003、BpERF006屬于ERF-a亞家族，BpERF007屬于ERF-b亞家族，BpERF001、BpERF004、BpERF005屬于ERF-c亞家族。

分析了7個(gè)BpERF的非翻譯區(qū)（UTR）、編碼序列（CDS）和內(nèi)含子的基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，除 ERF-a 亞家族的BpERF003、ERF-b亞家族中的BpERF007均具有1個(gè)內(nèi)含子外，其他同一亞家族的BpERF基因內(nèi)含子數(shù)目相同，且外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相似（圖1-B）。MEME預(yù)測(cè)的保守基序顯示，motif-1在7個(gè)BpERF蛋白中都表現(xiàn)出保守性（圖1-B）。此外，Motif-3只存在于ERF-a亞家族成員中，而motif-5只存在于ERF-c亞家族成員中，且ERF-c亞家族的BpERF001不具有motif-5。結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行的多重比對(duì)表明，全長(zhǎng)氨基酸序列相似的BpERF在AP2結(jié)構(gòu)域上存在高度相似性（圖1-C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，BpERF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能具有相似性，尤其是屬于同一亞家族的BpERF轉(zhuǎn)錄因子。

2.3 BpERF共線性分析

本研究中，基于ERF基因序列特征共得到19個(gè)連鎖群（LG），7個(gè)BpERF基因分別被定位在Chr02、Chr03、Chr04、Chr05、Chr06、Chr011、Chr018中，且各BpERF的分布無(wú)重合定位現(xiàn)象（圖2）?；贛CScanX對(duì)菊科和擬南芥包含的ERF基因進(jìn)行了同線性分析，鑒定出21 519個(gè)菊科ERF基因與擬南芥ERF基因具有相似性；而在21 519個(gè)菊科ERF基因中發(fā)現(xiàn)209個(gè)ERF基因全基因組復(fù)制現(xiàn)象；在209個(gè)ERF基因中發(fā)現(xiàn)了83個(gè)共線基因（占比3971%），表明該83個(gè)BpERF基因存在全基因組復(fù)制事件，它們主要分布在2個(gè)LG（Chr01、Chr03）上，且BpERF001隸屬于這83個(gè)共線基因之一。此外，共線性分析顯示雛菊中的BpERF002、BpERF004和BpERF006隸屬于30個(gè)串聯(lián)共線的ERF基因，表明BpERF002、BpERF004、BpERF006存在基因串聯(lián)重復(fù)序列（圖2）。

2.4 BpERF基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析

基于PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)分析了7個(gè)BpERF基因的啟動(dòng)子的順式作用元件。分析結(jié)果表明，BpERF包含10個(gè)順式作用元件：Me JA響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、低溫順式作用元件、下降過(guò)程順式元件、衰亡順式作用元件、水楊酸響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、 防御和應(yīng)激反應(yīng)元件、創(chuàng)傷脅迫響應(yīng)元件；但不同的BpERF在啟動(dòng)子順式元件組成上存在差異。例如，僅BpERF007存在創(chuàng)傷脅迫響應(yīng)元件，僅BpERF001、BpERF005、BpERF007特異性存在防御和應(yīng)激反應(yīng)元件，僅BpERF002、BpERF003、BpERF005含有衰亡順式作用元件；BpERF001、BpERF004、BpERF006、BpERF007不含水楊酸響應(yīng)元件。以上結(jié)果表明，BpERF002、BpERF003、BpERF005同時(shí)具有水楊酸響應(yīng)原件和衰亡衰亡順式作用元件，意味著這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能在切花保鮮中發(fā)揮作用。

2.5 基于RNA-Seq分析切花中BpERF的表達(dá)模式

由圖4可知，就BpERF在不同組織的表達(dá)水平而言，以花序（Flower）和側(cè)芽（Shoot）中的表達(dá)量高于莖稈（Stem）和葉片（Leaf），其中地上部組織中，各基因在花序中的表達(dá)水平相對(duì)較高，尤其是BpERF001、BpERF002和BpERF003，而B(niǎo)pERF001、BpERF003和BpERF007在莖、葉中皆超低表達(dá)。就基因表達(dá)總量來(lái)看，BpERF002和BpERF005較高。就水楊酸處理（SA）和無(wú)水楊酸處理（CK）的表達(dá)量對(duì)比結(jié)果來(lái)看，各基因在莖稈中的表達(dá)量差異較??；在葉片中除BpERF005外，其他基因在SA處理與CK的表達(dá)量差異也較??；而在側(cè)芽中，BpERF001、BpERF002和BpERF004的SA處理與CK間的差異較??；同理，花序中的BpERF001、BpERF002和BpERF006的SA處理與CK間的差異較小?？傮w來(lái)看，在任一組織中，僅BpERF005基因的SA處理與CK間差異較大，且均為CK大于SA處理，即SA處理可誘導(dǎo)BpERF005基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)，初步表明BpERF005基因可能是雛菊切花過(guò)程中調(diào)控植株衰老的潛在基因，應(yīng)在后續(xù)研究中予以重視。

2.6 基于RT-qPCR分析目標(biāo)基因的表達(dá)模式對(duì)水楊酸處理的響應(yīng)

由圖5-A可知，BpERF005在各組織中的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為莖稈＜葉片＜花序＜側(cè)芽，而施用水楊酸處理總體上沒(méi)有改變BpERF005在各組織中的表達(dá)模式，僅顯著或極顯著降低了各組織的相對(duì)表達(dá)量，尤其在花序中。由圖5-B可知，在切花后的120 h中，BpERF005在花序中的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，其表達(dá)峰值為切花后的12 h，此后開(kāi)始逐漸降低，但任一時(shí)間點(diǎn)中，水楊酸處理均顯著或極顯著降低了BpERF005的表達(dá)水平，尤其在切花后的12 h。

2.7 水楊酸處理對(duì)雛菊切花乙烯排放速率及瓶插壽命的影響

由圖6-A可知，切花后雛菊花序的乙烯排放速率與BpERF005在花序中的表達(dá)模式基于趨于一致，均呈先升高后降低模式，均在切花后的12 h達(dá)到峰值；而在水楊酸處理后期的排放速率與CK相比在任一切花時(shí)間點(diǎn)均降低；同時(shí)水楊酸處理后雛菊的瓶插壽命為9.1 d（218.4 h），CK為6.5 d（156 h），瓶插壽命顯著延長(zhǎng)了62.4 h。對(duì)切花后雛菊花序的乙烯排放速率和BpERF005表達(dá)量進(jìn)行線性分析（圖6-B）發(fā)現(xiàn)，兩者存在顯著（P=0.024 9<0.05）的線性正相關(guān)關(guān)系，這進(jìn)一步顯示BpERF005可能是調(diào)控乙烯排放的靶基因。

3 討論與結(jié)論

改變遺傳生理、改善瓶插環(huán)境及將生物化學(xué)策略應(yīng)用于切花保鮮，以延緩或抑制乙烯的生物合成是延緩切花衰老的主要策略［18］。探索乙烯反應(yīng)因子組成特征及響應(yīng)機(jī)制，有望提高切花保鮮效果，從而提高觀賞性及經(jīng)濟(jì)效益。本研究中基于HMMER檢索和蛋白質(zhì)Blast對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在雛菊中共鑒定出7個(gè)乙烯反應(yīng)因子（ERF），ExPASy和WoLF PSORT預(yù)測(cè)表明，BpERF基因蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為110～329 aa，相對(duì)分子量為2.61～5.25 ku，等電點(diǎn)為 4.72～8.36；其中BpERF001、BpERF002、BpERF004為酸性蛋白，其他則為堿性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，BpERF在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體中均有分布。

基于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，7個(gè)BpERF共歸屬于3個(gè)亞家族（ERF-a、ERF-b和ERF-c），其中BpERF002、BpERF003、BpERF006屬于ERF-a亞家族，BpERF007屬于ERF-b亞家族，BpERF001、BpERF004、BpERF005屬于ERF-c亞家族。這與之前研究中得出的結(jié)論存在差異：一般而言，高等植物中ERF1往往與ERF4、ERF5基因結(jié)構(gòu)存在差異，所以不歸屬于同一亞家族中［19］；造成差異的原因可能是菊科植物早期基因組發(fā)生變異分化的結(jié)果［20］。此外，同源性分析表明，這7個(gè)基因中只有4個(gè)擬南芥同源直系物，雛菊基因數(shù)量的增加表明在雛菊進(jìn)化史中經(jīng)歷了基因復(fù)制事件［21］。在漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化史中，全基因組復(fù)制事件和串聯(lián)復(fù)制事件對(duì)菊科ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的增加具有重要影響。同線性分析顯示，BpERF001存在全基因組重復(fù)，而B(niǎo)pERF002、BpERF004和BpERF006與基因串聯(lián)重復(fù)相關(guān)（圖2）。

本研究中，基因結(jié)構(gòu)分析表明，同一亞家族的基因具有相對(duì)相似和保守的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)和基序，本研究確定了7個(gè)BpERF基因中的6個(gè)保守基序，AP2結(jié)構(gòu)域中的保守motif 1存在于所有7個(gè)BpERF基因中；而motif 3和motif 5分別在ERF-a和ERF-c亞家族中保守，這個(gè)結(jié)果支持了系統(tǒng)發(fā)育分析和亞科分類的可靠性。多重比對(duì)顯示，這7個(gè)BpERF蛋白具有AP2結(jié)構(gòu)域和其他保守序列，例如YRG和RAYD元件。大量研究表明，ERF-c亞家族中的蛋白質(zhì)含有一個(gè)保守的第14順序列纈氨酸殘基，AP2結(jié)構(gòu)域中的保守纈氨酸殘基往往決定著DNA與AP2結(jié)構(gòu)域元件的特異性［22］?？傊陨辖Y(jié)果表明，7個(gè)BpERF基因均高度保守，而ERF-c亞家族的成員可能在雛菊脅迫耐受與發(fā)育生理中發(fā)揮作用。

基因的翻譯、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)受順式作用元件和反式作用因子調(diào)節(jié)［23-24］。本研究結(jié)果表明，不同BpERF基因的啟動(dòng)子包含多種脅迫應(yīng)激反應(yīng)元件，如厭氧誘導(dǎo)元件、防御和應(yīng)激反應(yīng)元件及創(chuàng)傷脅迫響應(yīng)元件（圖3）。一些BpERF基因啟動(dòng)子包含下降過(guò)程順式元件、衰亡順式作用元件以及激素（Me-JA、ABA、SA、IAA）響應(yīng)元件，這表明ERF基因也可能通過(guò)調(diào)節(jié)激素分泌與凋亡代謝網(wǎng)絡(luò)從而調(diào)控植物的表型衰老［7，25］。此外，啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，BpERF002、BpERF003、BpERF005同時(shí)含有衰亡順式作用元件和水楊酸響應(yīng)元件，意味著該3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能在水楊酸應(yīng)用于切花保鮮中發(fā)揮作用。

基于RNA轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)性熱圖分析表明，不同的BpERF基因在不同組織中的表達(dá)模式存在差異，且對(duì)施用水楊酸的響應(yīng)程度也不同。整體而言，不同組織中各BpERF基因的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為花序＞側(cè)芽＞葉片＞莖稈，施用水楊酸條件下，BpERF005的轉(zhuǎn)錄水平顯著或極顯著下調(diào)，qRT-PCR基因表達(dá)結(jié)果與RNA-Seq轉(zhuǎn)錄結(jié)果高度一致，表明該結(jié)果可靠。qRT-PCR分析表明，BpERF005的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，其表達(dá)峰值為切花后的12 h，且乙烯排放速率與BpERF005表達(dá)模式趨于一致，線性相關(guān)分析表明，二者呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P=0.024 9＜0.05）。此外，外源施用水楊酸使得雛菊的瓶插壽命顯著延長(zhǎng)了62.4 h。本研究?jī)H基于轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果驗(yàn)證了雛菊花序中BpERF005的表達(dá)模式及表型生理，然而在不同組織中不同的BpERF的功能租用可能存在差異，通過(guò)過(guò)表達(dá)和基因沉默技術(shù)檢測(cè)這7個(gè)BpERF的具體分子機(jī)制是下一步的研究方向。

本研究通過(guò)全基因組綜合分析結(jié)果表明，在雛菊中共鑒定得到7個(gè)乙烯反應(yīng)因子（BpERF），ExPASy和WoLF PSORT預(yù)測(cè)表明，BpERF蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為110～329 aa，相對(duì)分子量為2.61～5.25 ku，等電點(diǎn)為4.72～8.36，且在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體中均有分布。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和蛋白質(zhì)序列的多重比對(duì)表明，這7個(gè)BpERF可歸屬于3個(gè)亞家族（ERF-a、ERF-b和ERF-c）并攜帶AP2保守結(jié)構(gòu)域和YRG、RAYD等保守序列，因此可能受植物激素調(diào)節(jié)?；蚪Y(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子分析表明，不同BpERF的啟動(dòng)子中存在許多與細(xì)胞分化反應(yīng)和植物激素相關(guān)的順式元件，其中BpERF002、BpERF003、BpERF005同時(shí)含有衰亡順式作用元件和水楊酸響應(yīng)元件，意味著這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能在水楊酸應(yīng)用于切花保鮮中發(fā)揮作用。BpERF轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-Seq）表明，與不施用水楊酸處理（CK）相比，水楊酸處理后不同組織中BpERF005的轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，初步表明BpERF005是SA調(diào)控雛菊乙烯生物合成的潛在基因，qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果高度一致。此外，施用水楊酸處理下，BpERF005在花序中的表達(dá)模式與乙烯排放速率存在顯著線性正相關(guān)關(guān)系，證實(shí)了BpERF005是調(diào)控雛菊乙烯合成的指示基因，且水楊酸顯著延長(zhǎng)了雛菊切花的瓶插壽命。研究結(jié)果為揭示乙烯反應(yīng)因子在雛菊切花衰老過(guò)程中的功能提供了分子基礎(chǔ)，也為水楊酸應(yīng)用切花保鮮提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Karahan F. Morphology，anatomy，palynology and achene micromorphology of Bellis L.（Asteraceae） species from Turkey［J］. Acta Botanica Croatica，2020，79（1）：59-67.

［2］趙 莉. 茶多酚與海藻酸鈉膜對(duì)鮮切雛菊保鮮的影響［J］. 北方園藝，2015（11）：124-129.

［3］ul Haq A，Lone M L，F(xiàn)arooq S，et al. Efficacy of salicylic acid in modulating physiological andbiochemical mechanisms to improve postharvest longevity in cut spikes of Consolida ajacis （L.） Schur［J］. Saudi Journal of Biological Sciences，2022，29（2）：713-720.

［4］Min T，Xie J，Yi Y，et al. Expression of ethylene response factor genes during fresh-cut lotus root storage and browning［J］. Journal of the American Society for Horticultural Science，2018，143（6）：462-469.

［5］史國(guó)安，王 依，史 田，等. 納米銀和乙烯利預(yù)處理調(diào)控伊藤牡丹‘巴茨拉切花瓶插品質(zhì)［J］. 林業(yè)科學(xué)，2022，58（9）：79-89.

［6］董亞茹，李茹霞，趙東曉，等. 7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)及表達(dá)分析［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，54（1）：7-13.

［7］許世達(dá)，耿興敏，王露露. 植物乙烯響應(yīng)因子（ERF）的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展［J］. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，38（3）：624-633.

［8］悅曼芳，張 春，吳忠義.植物轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF家族蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2022，38（12）：11-26.

［9］Sharma A，Sidhu G P S，Araniti F，et al. The role of salicylic acid in plants exposed to heavy metals［J］. Molecules，2020，25（3）：540.

［10］胡小京，趙 云，關(guān)元靜.水楊酸對(duì)金魚(yú)草切花保鮮效果的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（8）：213-218.

［11］蘇金龍，王小璐，李素方，等. 水楊酸延緩獼猴桃果實(shí)采后衰老與精氨酸分解代謝的關(guān)系［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2020，40（10）：1714-1721.

［12］Budiarto K，Zamzami L，Endarto O.Effect of salicylic and ascorbic acids on post-harvest vase life of Chrysanthemum cut flowers［J］. Horticultural Science，2022，49（1）：38-47.

［13］王昊寧，周 佩，劉 燕，等. 菊花AP2/ERF家族全基因組分析［J/OL］. 分子植物育種. ［2023-02-16］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20211224.1611.008.html.

［14］Kumar S，Stecher G，Li M，et al. MEGA X：molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms［J］. Molecular Biology and Evolution，2018，35（6）：1547-1549.

［15］Bray N L，Pimentel H，Melsted P，et al. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification［J］. Nature Biotechnology，2016，34（5）：525-527.

［16］Chen C J，Xia R，Chen H，et al. TBtools，a toolkit for biologists integrating various biological data handling tools with a user-friendly interface［J］. BioRxiv. （2018-03-27）［2023-05-07］. https：//www.biorxiv.org/content/10.1101/289660vl.ful.pdf.

［17］李 菲，戶 倩，翟怡雯，等. 菊花CmERA1基因的克隆與表達(dá)模式分析［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，45（2）：254-260.

［18］陳 進(jìn)，劉小林. 鮮切花采后生理變化特征及保鮮技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2017（15）：136-137，139.

［19］Yao W J，Zhou B R，Zhang X M，et al. Transcriptome analysis of transcription factor genes under multiple abiotic stresses in Populus simonii×P. nigra［J］. Gene，2019，707：189-197.

［20］Wong E L Y，Hiscock S J，F(xiàn)ilatov D A.The role of interspecific hybridisation in adaptation and speciation：insights from studies in Senecio［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13：907363.

［21］Wang S J，Huang J J，Wang X D，et al. Expression analysis of the NAC transcription factor family of Populus in response to salt stress［J］. Forests，2019，10（8）：688.

［22］Djemal R，Khoudi H.Isolation and molecular characterization of a novel WIN1/SHN1 ethylene-responsive transcription factor TdSHN1 from durum wheat （Triticum turgidum L. subsp. durum）［J］. Protoplasma，2015，252（6）：1461-1473.

［23］徐金龍，張文靜，向鳳寧. 植物鹽脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其順式作用元件研究進(jìn)展［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2021，57（4）：759-766.

［24］顧鵬鵬，馬鑫磊，姚 銳，等. 谷子HSP90基因家族鑒定及干旱脅迫下表達(dá)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（6）：45-52.

［25］劉暢宇，陳 勛，龍雨青，等. 乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中介導(dǎo)花衰老相關(guān)基因的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2019，35（3）：171-182.