響應(yīng)面法優(yōu)化低共熔溶劑提取迷迭香中迷迭香酸和鼠尾草酸的工藝

李凌娜，楊繼威，張麗芬，趙夢健，王振華，馬成俊

（煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005）

迷迭香（Rosmarinus officinalisL.）是唇形科迷迭香屬植物[1]，原產(chǎn)于地中海地區(qū)[2]，我國多地均有種植，藥食兩用，是一種重要的香料，亦常用作化妝品、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的原料[3]，在我國“迷迭香提取物”作為天然抗氧化食品添加劑（GB 1886.172-2016，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，食品添加劑）[4]，廣泛應(yīng)用于油脂、肉類及海鮮等的運輸、貯藏和加工過程中的抗氧化和保鮮[5-9]。迷迭香提取物中抗氧化活性成分以萜類物質(zhì)為主[10]，包括迷迭香酚、迷迭香酸、鼠尾草酚、鼠尾草酸等[11]，其中代表性成分為水溶性的迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）和脂溶性的鼠尾草酸（Carnosic acid，CA）（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1）[12]，在“迷迭香提取物”國家標(biāo)準(zhǔn)中，將迷迭香酸和鼠尾草酸的含量作為迷迭香提取物質(zhì)量控制的成分，許多研究也表明迷迭香酸和鼠尾草酸具有預(yù)防糖尿病和肥胖[13]、抗腫瘤[14]、神經(jīng)保護(hù)[15]、保肝[16]和抗菌[17]等作用。

圖1 鼠尾草酸和迷迭香酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formulae of carnosic acid and rosmarinic acid

目前，做為食品添加劑的“迷迭香提取物”提取方法主要有乙醇熱回流法、正己烷冷浸法和超臨界流體萃取法[4]。超臨界流體萃取法和正己烷冷浸提取法僅獲得脂溶性成分[18]；乙醇加熱回流提取容易使其中鼠尾草酸氧化成中間產(chǎn)物鼠尾草酚，迷迭香酸也易氧化降解，使得提取物抗氧化性能顯著降低[19]?？傊?，現(xiàn)有的提取方法存在設(shè)備成本高、提取耗能耗時、所用溶劑易燃易爆、提取效率低等問題[20-22]。

低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DESs）這一概念最早在2003 年由Abboot 等[23]提出，它是由氫鍵受體（Hydrogen Bond Acceptors，HBAs）和氫鍵供體（Hydrogen Bond Donors，HBDs）混合而成的兩組分或三組分低共熔混合物[24]，因其具有無毒、易于合成、成本低、提取效率高、保護(hù)活性物質(zhì)、可回收降解、安全性高、節(jié)約能耗等特點[25-26]，已被廣泛應(yīng)用于多酚[27-28]、黃酮[29-30]、有機(jī)酸[31]等天然活性物質(zhì)的提取。

Wojeicchowski 等[31]研究了疏水性DESs 提取迷迭香中的脂溶性成分鼠尾草酸和鼠尾草酚。Vladimir-Kne?evi?等[32]研究了親水性DESs 提取迷迭香中的水溶性成分迷迭香酸等。Vieira 等[33]研究了兩相（疏水性和親水性）DESs 同時提取迷迭香中脂溶性和水溶性成分。到目前為止，未見采用單相DESs 同時提取迷迭香中脂溶性和水溶性有效成分的報道。本研究以同時提取迷迭香中的代表成分迷迭香酸和鼠尾草酸為目標(biāo)，從多種可能的DESs 組合中，篩選出組成和組分比例最優(yōu)的DESs 作為提取試劑，通過單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化探索迷迭香中主要抗氧化活性成分的提取工藝，為高效快速提取迷迭香抗氧化物及其資源開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香藥材 購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)煙臺大學(xué)藥學(xué)院生藥室李桂生博士鑒定為迷迭香枝葉（Rosmarinus officinalisL.）；迷迭香酸對照品 純度98.9%，中國食品藥品檢定研究院；鼠尾草酸對照品純度≥99%，成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；乳酸、檸檬酸、氯化膽堿、甜菜堿、1,2-丙二醇、尿素、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、蘋果酸、葡萄糖、異丙醇、丙三醇、乙二醇、L 脯氨酸、L 精氨酸、薄荷醇、月桂酸、壬酸、癸酸、無水乙醇 均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（配DAD 檢測器） 美國Agilent 公司；DF-101T 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；AR1140型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS-12Pro 高速離心機(jī) 群安實驗儀器有限公司；AHA-A 數(shù)顯恒溫振蕩器 常州天瑞儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低共熔溶劑的制備及篩選

1.2.1.1 低共熔溶劑的制備 分別選取氫鍵受體和氫鍵供體，二者混合后加入適量水，采用加熱震蕩方式進(jìn)行制備，在80 ℃水浴下進(jìn)行震蕩使其形成穩(wěn)定、均一體系的DESs[31]，冷卻備用，不能互溶或者分層則不能形成DESs。

1.2.1.2 低共熔溶劑的篩選 分別以氯化膽堿、甜菜堿、檸檬酸和乳酸為HBA 和選擇的HBD 按照摩爾比1:2，含水量30%共計37 種組合（表1），組合包含親水性DESs 和疏水性DESs[34-35]，以相同的提取條件進(jìn)行迷迭香中RA 和CA 的提取，考察不同DESs對RA 和CA 的提取得率，選擇提取得率最高的DESs做后續(xù)工藝優(yōu)化研究。

表1 不同組分DESs 的制備Table 1 Preparation of DESs with different components

1.2.2 迷迭香中RA 和CA 的提取 稱取經(jīng)粉碎過60 目篩的迷迭香粉末約0.1 g，按液固比20:1（mL/g）加入DESs，45 ℃加熱提取40 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速12000 r/min），取上清液稀釋，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即待測樣品。

1.2.3 RA 和CA 含量的測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.2.3.1 RA 和CA 含量的測定 參考文獻(xiàn)[4]，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定RA 和CA 的含量。色譜柱Symmetry C18（4.6×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，柱溫35 ℃；流動相：A 相為0.2%磷酸水溶液，B 相為乙腈，梯度洗脫見表2。DAD 檢測器掃描范圍為230～360 nm。將待測樣品以上述色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，按照下式計算RA 和CA 的得率。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient elution procedure

RA（CA）得率（mg/g）=提取液中RA（CA）濃度×提取液體積/迷迭香粉質(zhì)量（g）

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品20.87 mg 和鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品34.78 mg，置于25 mL容量瓶中，以甲醇稀釋定容作為母液。分別吸取1、2、3、4、5 mL 于10 mL 容量瓶中并以甲醇稀釋定容，作為系列混合對照品溶液。分別吸取20 μL 上述混合對照品溶液，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰面積。

1.2.4 單因素實驗 使用選擇的DESs 最優(yōu)組合，依照1.2.2 提取方法，固定提取溫度35 ℃，提取時間30 min，含水量30%，液固比20:1 g/mL，考察不同摩爾比（1:1、1:2、1:3、1:4）對RA 和CA 提取得率的影響，確定最佳摩爾比。分別設(shè)定含水量，液固比，提取時間，提取溫度4 個影響提取得率的因素在以下條件進(jìn)行單因素實驗：含水量0、10%、20%、30%、40%、50%（提取溫度35 ℃，提取時間30 min，液固比20:1 g/mL，摩爾比1:2）；液固比10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 g/mL（提取溫度35 ℃，提取時間30 min，摩爾比1:2，含水量10%）；提取時間30、60、90、120 min（提取溫度35 ℃，含水量10%，液固比為20:1 g/mL，摩爾比1:2）；提取溫度25、35、45、55、65 ℃（提取時間60 min，含水量10%，液固比20:1 g/mL，摩爾比1:2）。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)選提取方法 參考單因素實驗結(jié)果，以提取時間（A），DESs 含水量（B），液固比（C），提取溫度（D）作為考察因素，以RA 和CA 的得率為考察指標(biāo)，利用Box-Behnken Design（BBD）法設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表3。

表3 響應(yīng)面因素水平設(shè)計Table 3 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取迷迭香中的抗氧化成分參考文獻(xiàn)[3,36]，采用80%乙醇回流提取和正己烷冷浸法提取迷迭香中的有效成分RA 和CA，和DESs提取液比較其提取率和體外清除DPPH 自由基的能力。取迷迭香0.5 g，加入80%乙醇25 mL，回流提取1 h，放冷后過濾，用80%乙醇定容至25 mL，作為乙醇回流提取液；取迷迭香0.5 g，用25 mL 正己烷室溫下浸提24 h，過濾，旋蒸除去溶劑，用80%乙醇溶解并定容至25 mL，作為正己烷冷浸提取液。按照1.2.3 項下“含量測定”方法，分別測定不同方法提取RA 和CA 的得率。

1.2.7 抗氧化活性測定 比較不同提取方法所得提取液DPPH 自由基清除能力。參考文獻(xiàn)[37]，用無水乙醇配制0.1 mmol/L DPPH 溶液，避光備用，精密稱取3.0 mg 維生素C 定容于100 mL 容量瓶中，避光保存。取4 支試管，分別加入DESs、乙醇、正己烷提取液各1 mL，并加入3 mL 的DPPH 溶液，避光反應(yīng)30 min，此為樣品組，記為A1；取1 mL 提取液并加入3 mL 無水乙醇，此為空白組，記作A2；取1 mL 雙蒸水加入3 mL 的DPPH 溶液，此為對照組，記為A0。在517 nm 測吸光度。按照下列公式計算各自對DPPH 自由基清除率：

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗中所有實驗均重復(fù)3 次，單因素實驗數(shù)據(jù)處理使用SPSS 20.0 和Origin 8.0，響應(yīng)面試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理使用Design expert 12。

2 結(jié)果與分析

2.1 RA 和CA 標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品檢測

以對照品濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到的迷迭香酸的回歸方程為：y=16593x+305.29，R2=0.9978，表明在0.03843～0.8348 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好；鼠尾草酸的回歸方程為：y=16593x+305.29，R2=0.9978，表明在0.6956～1.39120 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。圖2 為高效液相含量測定色譜圖。

圖2 正己烷（A）、乙醇（B）和DESs（C）提取所得RA（1）和CA（2）及標(biāo)準(zhǔn)品（D）的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of RA (1) and CA (2) and standards (D) obtained by extraction with n-hexane (A), ethanol(B), and DESs (C)

2.2 DESs 的篩選

經(jīng)過篩選舍去不能形成DESs 的組合，采用其余37 種組合以相同的方法提取迷迭香中的RA 和CA，以二者得率為考察指標(biāo)，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 得知，以乳酸作為氫鍵受體，1,4-丁二醇作為氫鍵供體，RA 和CA 的得率最高，分別達(dá)到11.78 和21.14 mg/g。因此選擇以乳酸/1,4-丁二醇構(gòu)成的DESs 體系提取迷迭香中的RA 和CA。

圖3 Ss 組合篩選Fig.3 DESs combination screening

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 摩爾比對提取的影響 以乳酸/1,4-丁二醇構(gòu)成的DESs 體系，考察二者摩爾比對RA 和CA 提取得率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4 得知，隨著氫鍵受體乳酸和氫鍵供體1,4-丁二醇摩爾比的增加，RA 和CA 的得率均呈現(xiàn)先增加后略降低的趨勢。DESs 是由HBA 和HBD 通過分子間氫鍵形成的一種在室溫下均一穩(wěn)定的液態(tài)混合物，二者摩爾比影響DESs 的電導(dǎo)率和凝固點[28]，從而影響到DESs 的形成和提取效果，在摩爾比1:2 時，RA 和CA 的得率均較高，可能是1,4-丁二醇增強(qiáng)了溶劑離子對RA 和CA 的親和力，從而增強(qiáng)了其溶出速率；隨著供體的增加，DESs 中氫鍵受體的比例降低，相對減弱了其對RA和CA 的分子作用力，使得兩者的得率均下降。因此選擇乳酸/1,4-丁二醇的摩爾比為1:2。

圖4 摩爾比對提取的影響Fig.4 Effect of molar ratio on extraction

2.3.2 含水量對提取的影響 含水量對RA 和CA提取得率的影響見圖5。由圖5 得知，當(dāng)DESs 的含水量從0%至10%時，RA 和CA 得率均逐漸提高，當(dāng)含水量達(dá)到10%，RA 和CA 的得率分別達(dá)到最大值17.24 和29.88 mg/g，之后隨著含水量的繼續(xù)增加，RE 和CA 的得率均下降，其中CA 的下降明顯快于RA。乳酸/1,4-丁二醇為親水性DESs，本身具有一定的流動性，適當(dāng)增加含水量，可以進(jìn)一步降低DESs 的黏度從而增加了溶劑的傳效率，有利于CA和RA 的溶出，然而隨著含水量的不斷增加，DESs的極性進(jìn)一步增強(qiáng)，極性過大會引起分子間氫鍵的斷裂，降低了DESs 和CA 及RA 之間的相互作用[34]，這種影響對脂溶性的CA 最為突出。因此選擇含水量10%作為提取條件。

圖5 含水量對提取的影響Fig.5 Effect of water content on extraction

2.3.3 液固比對提取的影響 考察了不同液固比對CA 和RA 提取效率的影響，結(jié)果如圖6 所示，隨著液固比的增加，DESs 對CA 和RA 的提取得率均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)液固比達(dá)到40:1 g/mL時，RA 和CA 的得率達(dá)到最高，分別為18.81 和30.02 mg/g，以后隨著溶劑的增加，二者得率逐步下降?？赡苁请S著提取液增加，逐步增大了迷迭香粉末及細(xì)胞與提取液的接觸機(jī)會，有利于CA 和RA 的溶出；但當(dāng)液固比增加到一定程度后，二者在DESs 中的溶解達(dá)到飽和，繼續(xù)增加液固比會降低它們的濃度，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓下降，影響其溶出[28,35]，進(jìn)而使CA 和RA 的得率下降，提取量降低，故選擇液固比40:1 g/mL 進(jìn)一步優(yōu)化。

圖6 液固比對提取的影響Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on extraction

2.3.4 提取時間對提取的影響 一般來說，提取時間長短決定被提取物能否充分溶出。提取時間對CA 和RA 的影響見圖7。由圖7 可知，提取時間短時，RA 和CA 的溶出量少，得率低，當(dāng)提取時間增加到60 min 時，RA 和CA 的得率分別為22.18 和37.49 mg/g，達(dá)到最大值，以后隨著提取時間的延長，二者得率呈現(xiàn)下降趨勢。這種現(xiàn)象可能是隨著提取時間的增加，溶劑透過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使得目的物在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生濃度差，目的物溶出度加大，提取時間達(dá)到60 min 時，大多數(shù)目的物溶出，繼續(xù)延長提取時間，會造成大量雜質(zhì)溶出而使目標(biāo)物溶出受限；另外，由于CA 和RA 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，過長的提取時間造成其氧化降解[28]。因此，提取時間選擇為60 min。

圖7 提取時間對提取的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction

2.3.5 溫度對提取的影響 溫度是影響提取效果的重要因素，因為溫度影響DESs 的擴(kuò)散系數(shù)、黏度，從而影響DESs 對RA 和CA 的得率。不同溫度對RA 和CA 得率的影響結(jié)果如圖8 所示，隨著溫度的升高，RA 和CA 的得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)溫度從25 ℃上升到45 ℃時，RA 和CA 的提取得率隨著溫度提高而上升，可能是因為溫度升高降低了DESs 的黏度同時增加了RA 和CA 的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)[28]，使得RA 和CA 的得率增加，溫度在45 ℃時，得率最高，分別為18.79 和32.54 mg/g。當(dāng)溫度超過45 ℃，RA 的得率基本保持不變，但CA 的得率逐步降低，這可能是由于CA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)相對于RA 不穩(wěn)定，溫度的升高加速了CA 的氧化從而導(dǎo)致CA 的得率下降[36]。

圖8 提取溫度對提取的影響Fig.8 Effect of extraction temperature on extraction

2.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 回歸模型建立與方差分析 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定以提取時間（A）、含水量（B）、液固比（C）和提取溫度（D）4 個因素，每個因素3 水平，以RA 和CA 的得率為指標(biāo)，共計29 組進(jìn)行BBD 實驗，通過Design-Expert 12 軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，其結(jié)果見表4～表6。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Response surface experimental design and results

根據(jù)表4 得出的RA 得率的回歸方程如下：

方差分析結(jié)果如表5 所示，模型P＜0.01，表示模型顯著有效；R2=0.9590，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9180，失擬項P＞0.05 不顯著，表明模型擬合度好，預(yù)測值與真實值偏差不大，實驗誤差對于實驗結(jié)果影響較小。在設(shè)定的四個因素中，各因素對RA 的提取影響：含水量（B）＞液固比（C）＞提取時間（A）＞提取溫度（D），說明在所設(shè)因素范圍內(nèi)，含水量和液固比對RA 的提取影響是極顯著的，其次是提取時間，提取溫度對其影響不顯著。

表5 迷迭香酸得率的方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance of rosmarinic acid

圖9 為不同因素交互作用對RA 得率影響的響應(yīng)面，由圖9 可知，各因素之間的交互作用對RA 的得率有著較大的影響，對模型中的各因素進(jìn)行交互分析發(fā)現(xiàn)，AB、AC、CD 之間交互作用對響應(yīng)值的影響是顯著的，只改變提取時間時，RA 的得率先上升再趨于平緩，可見隨著時間的增加RA 已經(jīng)基本提取完全。當(dāng)固定其他因素時，RA 的得率隨著含水量的增加呈現(xiàn)先上升再平緩再下降的趨勢，原因是RA 是水溶性良好的成分，在一定范圍內(nèi)含水量的增加會使得RA 的得率增加，但過多的水會破壞DESs 體系從而影響RA 的得率。當(dāng)其他因素不變時，RA 的得率隨著液固比的改變變化較小，原因可能是RA 在DESs 溶劑中達(dá)到飽和。當(dāng)其他因素固定時，提取溫度改變時，RA 的得率先增加后減小但總體變化不大，原因是溫度升高可以降低DESs 的粘度，增加其與迷迭香的接觸和分子間的碰撞，但溫度過高會導(dǎo)致RA 不穩(wěn)定，可能會影響得率，但變化不大可能是RA 已經(jīng)飽和。影響RA 得率的交互作用影響順序AC＞AB＞CD＞AD＞BD＞BC。

圖9 迷迭香酸得率各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.9 Rosmarinic acid response surface of interaction of various factors

根據(jù)表4 得出的CA 的回歸方程如下：

方差分析如表6 所示，模型P＜0.01，表示模型顯著可靠，R2=0.9422，校正決定系數(shù)R2Adj=0.8844，失擬項P＞0.05，不顯著，證明模型相關(guān)度良好，擬合度良好。由上表可知，四種因素中，料液比和提取溫度對鼠尾草酸的提取影響是顯著的，各因素對鼠尾草酸提取的影響：提取溫度（D）＞含水量（B）＞液固比（C）＞提取時間（A）。對模型中各因素交互作用分析發(fā)現(xiàn)，各因素交互作用對鼠尾草酸提取的影響順序BC＞AB＞AC＞AD＞CD＞BD，其中BC、AB 和AC 的交互作用對鼠尾草酸的提取效果影響顯著。

表6 鼠尾草酸得率的方差分析Table 6 Analysis of variance of carnosic acid

圖10 為不同因素交互作用對DESs 提取迷迭香中CA 得率的影響的響應(yīng)面圖，當(dāng)其他因素固定不變時，CA 得率隨著提取時間的增加呈現(xiàn)輕微的先增后降的趨勢，這可能是因為DESs 具有高效的提取效率，能夠短時間溶解迷迭香中的有效成分，但隨著時間的延長，CA 具有的不穩(wěn)定性和強(qiáng)氧化性會使得自身轉(zhuǎn)變成為其他成分，從而降低得率。當(dāng)其他因素不變時，CA 的得率隨著含水量的增加而減少，因為CA 本身為脂溶性物質(zhì)，水的增多不利于CA 的提取[38]。當(dāng)其他因素不變時，液固比對CA 得率的影響較小，但隨著液固比的增加，CA 的得率也有所增加，因為DESs 溶劑的增多更能夠?qū)⒚缘阒械腃A 有效提取，但過多的溶劑反而可能將其余雜質(zhì)提出。當(dāng)其他因素不變，提取溫度改變時，對CA 得率，呈現(xiàn)隨著溫度的上升先升后降的情況，原因是CA 對于溫度比較敏感，過高的溫度可能會破壞CA 的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致得率的下降。

2.4.2 驗證實驗 通過Design Expert 12.0 軟件優(yōu)化得到的最佳的DESs 提取RA 和CA 的工藝為：提取時間59.44 min，含水量11.54%，液固比43.84:1 mL/g，提取溫度39.23 ℃，預(yù)測RA 理論上的得率是20.761 mg/g，CA 理論上的得率是34.357 mg/g。但考慮實際情況，最后設(shè)定提取時間60 min，含水量12%，液固比為44:1，提取溫度為40 ℃，平行三組實驗最后測得RA 的得率是20.247 mg/g，與軟件預(yù)測誤差為2.476%，CA 的實際得率為34.086 mg/g，與軟件預(yù)測誤差為0.795%，實際與模型誤差較小，證明模型的有效性。

2.5 不同提取方法得率比較

在相同的液固比條件下，比較了80%乙醇回流提取1 h、正己烷冷浸提取24 h 和優(yōu)選出的DESs提取迷迭香中的RA 和CA，結(jié)果見表7。

表7 傳統(tǒng)提取方法提迷迭香中RA 和CA 的得率Table 7 Yields of RA and CA from Rosmarinus officinalis L.by traditional extraction methods

由表7 可知，傳統(tǒng)的正己烷冷浸提取僅能提出脂溶性的CA，根據(jù)相似相溶原理，作為非極性有機(jī)溶劑的正己烷很難提出水溶性的RA。DESs 是依靠氫鍵供體和氫鍵受體結(jié)合產(chǎn)生的氫鍵作用力，并且不同的組合對提取物具有不同的選擇性，十分靈活。Vieira 等[33]研究了親水性和疏水性DESs提取迷迭香中化學(xué)成分的差異，以薄荷醇/月桂酸（摩爾比2:1）組成的疏水性DESs 從迷迭香中提到的是脂溶性的鼠尾草酸和鼠尾草酚；以乳酸/葡萄糖（摩爾比5:1）組成的親水性DESs 從迷迭香中提取得到的是水溶性的迷迭香酸；將兩種DESs 溶劑按照1:1 比例混合形成雙相DESs，可以將迷迭香中的鼠尾草酸和迷迭香酸同時提出，分別分布在上下兩相中。本試驗采用的乳酸/1,4-丁二醇（摩爾比1:2）單相DESs體系，能夠?qū)⑹笪膊菟岷兔缘闼嵬瑫r提出，表明極性和80%乙醇相近，但是相較于DESs 提取，80%乙醇回流因其過高的提取溫度，RA 和CA 不同程度的氧化，使得得率顯著低于DESs 提取。

2.6 抗氧化能力測定結(jié)果

不同提取方法所得提取液DPPH 自由基清除能力實驗結(jié)果見圖11。由圖11 可知，迷迭香DESs 提取物、80%乙醇回流提物、正己烷冷浸提取物（三者均為0.625 mg/mL 迷迭香提取液）和維生素C（0.03 mg/mL）的DPPH 清除率分別為73.17%、66.93%、62.57%和89.77%。從抗氧化方面進(jìn)一步驗證了建立的DESs 提取工藝相較于傳統(tǒng)的迷迭香提取方法，更好的保留了抗氧化活性成分RA 和CA。

圖11 不同提取方法所得提取液與維生素C 的DPPH 清除能力Fig.11 DPPH scavenging capacity of extracts obtained by different extraction methods

3 結(jié)論

本實驗研究建立了DESs 同時提取迷迭香中水溶性成分RA 和脂溶性成分CA 的新工藝。以RA和CA 的最高提取得率為指標(biāo)，從合成的37 種DESs體系中，篩選出以乳酸/1,4-丁二醇（摩爾比1:2）構(gòu)成的最適DESs 體系。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化出了同時提取迷迭香中RA 和CA 的最佳提取工藝（含水量12%、液固比44:1 mL/g、提取時間60 min，提取溫度40 ℃），在此條件下，RA 和CA 的得率分別為20.247 和34.086 mg/g，相較于乙醇回流和正己烷冷浸傳統(tǒng)提取工藝，DESs 提取RA 和CA 總得率分別提高了1.4 倍和1.5 倍；通過DPPH 自由基清除實驗，進(jìn)一步驗證了DESs 提取迷迭香所得迷迭香抗氧化物，其質(zhì)量明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取。和已有文獻(xiàn)[31-33]報道的DESs 提取迷迭香抗氧化物成分工藝相比，能夠?qū)崿F(xiàn)單相DESs同時將水溶性迷迭香酸和脂溶性鼠尾草酸提出。本研究為高效快速提取迷迭香抗氧化物及其資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。