基于網(wǎng)絡藥理學及體外實驗探討人參-甘草對非小細胞肺癌的作用機制

周文月，文藝儒，周森林，王夢琪，童 宇，許光亞，時 政,

（1.成都大學臨床醫(yī)學院/附屬醫(yī)院食品與生物工程學院，藥學院，基礎醫(yī)學院，四川成都 610106；2.四川大學華西醫(yī)院，四川成都 610041）

肺癌是全球發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%[1]。我國是目前世界上肺癌疾病負擔最重的國家，診斷時已經(jīng)中晚期的非小細胞肺癌（NSCLC）患者約占肺癌總發(fā)病的45%[2]。目前治療肺癌的手段主要有手術、放療、化療和靶向治療等，其中化療是最普遍的治療方式，但患者用藥后往往會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象和不同程度的副作用[3-4]。因此，開發(fā)新的防治手段非常重要。保健食品對腫瘤的防治能力已成為近年來的研究熱點，其具有安全性高、價格低廉、可長期服用等優(yōu)點，在惡性腫瘤的防治中發(fā)揮其獨特的優(yōu)勢[5]。

人參、甘草是中醫(yī)藥中常見的藥對藥材，我國衛(wèi)生部已將人參列為可用于保健食品物品，將甘草列為藥食同源物品[6-7]。近些年人參、甘草已經(jīng)被用于保健食品的開發(fā)。研究表明二者協(xié)同配伍后有優(yōu)于單味藥材的抗腫瘤作用，可表現(xiàn)出協(xié)同增效作用[8-9]。人參（Panax ginsengC. A. Mey.）為五加科植物人參的干燥根或根莖，人參含有三萜皂苷類及多糖類化合物，其中皂苷類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[10]，Liu 等[11]發(fā)現(xiàn)人參中主要成分人參皂苷Rg3可通過激活VRK1/P53BP1 通路來調(diào)節(jié)NSCLC 細胞中的DNA 損傷，達到抗腫瘤作用。甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）是一味常用大宗藥材，甘草的主要成分是三萜皂苷和黃酮類，其主要成分具有抗癌、抗?jié)?、抗炎等多種藥理作用[12-13]。Zhu 等[14]發(fā)現(xiàn)甘草提取物通過下調(diào)CDK4 細胞周期蛋白D1 復合物和增加CD8+T 細胞浸潤來抑制NSCLC 的生長。但是目前利用人參-甘草協(xié)同治療NSCLC 的分子機制尚未明確。

近年來，將系統(tǒng)生物學的思想和方法應用于中藥研究中，正成為一種新的趨勢。網(wǎng)絡藥理學已發(fā)展成一個新興學科，其包括了數(shù)據(jù)收集、靶點預測、網(wǎng)絡分析、可視化多組分相互作用和信號通路預測等多種研究方法[15-16]。而網(wǎng)絡藥理學的整體性、系統(tǒng)性特點與中醫(yī)藥學從整體的角度去診治疾病的理論不謀而合。目前，關于通過網(wǎng)絡藥理學探討人參單體及甘草單體治療NSCLC 的研究較多，但人參-甘草協(xié)同治療NSCLC 的相關網(wǎng)絡藥理學研究暫未見報道。因此，本文利用網(wǎng)絡藥理學的高效性與中醫(yī)藥治療的系統(tǒng)性，以及體外實驗驗證，探討人參-甘草治療非小細胞肺癌的潛在機制及藥效作用，為臨床上應用人參-甘草治療非小細胞肺癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

A549 細胞、Ham’s F-12K 培養(yǎng)基 Procell 公司；人參 成都吉安康藥業(yè)公司；甘草 四川和順康藥業(yè)公司；胰酶（+EDTA）、雙抗 上海源培公司；胰酶（-EDTA） BOMEI 公司；胎牛血清 HyClone公司；MTT Biofroxx 公司；二甲基亞砜（DMSO）Sigma 公司；Annexin V-APC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒 凱基公司；PBS 緩沖液 Servicebio 公司。

DMI1 倒置生物顯微鏡 LEICA 公司；TDZ4-WS 臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；MCO-15AC 二氧化碳培養(yǎng)箱 三洋電機國際貿(mào)易有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；SYQ-DSX-280B 壓力蒸汽滅菌器 上海宜川儀表廠；HH-1 水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司；UPH-‖-10T 優(yōu)譜超純水制造系統(tǒng) 成都超純科技有限公司；TS-A 脫色搖床 常州普天儀器制造有限公司；spectra max PLUS 384 酶標儀 Molecular Device 公司；cytoflex 流式分析儀Beckman 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 收集人參-甘草活性成分和靶點 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），選擇“Herb Name”選項，分別將“人參”、“甘草”作為關鍵詞，將類藥性（DL）≥0.18、口服利用度（OB）≥30%作為篩選標準，獲得人參、甘草的活性成分和相關靶點。

1.2.2 構建藥物-活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡圖 可視化網(wǎng)絡構建與分析軟件Cytoscape 是構建與研究中藥網(wǎng)絡的常用軟件。把人參-甘草的活性成分與潛在靶點導入軟件Cytoscape 中，構建藥物-活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡圖。

1.2.3 非小細胞肺癌靶點獲取 在TTD、CTD 及Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中，以“Non-small cell lung cancer”為檢索詞，分別收集非小細胞肺癌的靶點，整合結果，去除重復，得到非小細胞肺癌的疾病靶點。

1.2.4 構建蛋白相互作用網(wǎng)絡（PPI） 利用Draw Veen Diagam（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）制作藥物-疾病交集靶點Veen 圖，并得到交集靶點。把交集靶點導入STRING，將物種定義為“Homo sapiens”，最后將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 軟件進行可視化，繪制PPI 網(wǎng)絡圖[15]。

1.2.5 GO 和KEGG 富集分析 將交集靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫中，進行GO 和KEGG 富集分析，以P＜0.05 為標準，獲得相關結果。將數(shù)據(jù)導入R 軟件進行可視化分析。

1.2.6 細胞培養(yǎng) 將人非小細胞肺癌A549 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%雙抗的1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7 人參-甘草溶液制備 將人參、甘草藥材烘干粉碎，將人參、甘草于4:1 比例稱質(zhì)量，置于圓底燒瓶中，加入8 倍量去離子水，浸泡8 h，待煮沸后加熱回流提取30 min，4 層紗布濾過，回流提取2 次，合并提取液。

1.2.8 MTT 比色法測定細胞增殖 參考廖景光等[16]的方法，取對數(shù)生長期的人非小細胞肺癌A549 細胞以2000 個/孔接種于96 孔板，每組6 個復孔，分別用0、12.5、25、50、100、200、300、400、600、800 μg/mL濃度的人參-甘草溶液（人參:甘草=4:1）處理12 h/24 h后每孔加入200 μL 終濃度為0.5 mg/mL 的MTT 溶液，37 ℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150 μL低速振蕩10 min，置酶標儀于570 nm 測定各孔的光密度（OD）值。4 次重復實驗，取其平均值。

1.2.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡 參考張春晶等[17]的方法，取人非小細胞肺癌A549 細胞，以2×105個每孔接種于6 孔板，用0、1、2、4 mg/mL 濃度人參-甘草溶液處理24 h 后，經(jīng)預冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗，用500 μL 的Binding Buffer 重懸細胞。加入Annex-in V-FITC 輕輕吹勻，再加入5 μL的PI 混勻，室溫避光反應15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有檢測均至少測定3 次，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 軟件進行分析，以均值±標準差（±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析評估，P＜0.05 表示其具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 人參-甘草中活性成分的篩選

檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，得到了人參活性成分22 個，甘草活性成分92 個，其中山柰酚（kaempferol）是人參、甘草共有的成分。人參的活性成分主要為谷甾醇（beta-sitosterol）、二醇（diop）、人參萜二醇（panaxadiol）、蘇齊內(nèi)酯（suchilactone）；甘草的活性成分主要為槲皮素（quercetin）、甘草寧B（Gancaoning B）、7-甲氧基-4'-羥基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、甘草寧A（Gancaoning A）、黃烷酮（licoisoflavanone）等，表1 列舉出了OB 值前15的有效成分。

表1 15 種成分的基本信息Table 1 Basic information of 15 optimal components

2.2 交集靶點信息

檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，得到人參和甘草的成分靶點1989 個，使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行校正，將靶點名（Target name）轉換為基因名（Gene Name）；使用數(shù)據(jù)庫CTD、TTD、Gene Cards 獲取非小細胞肺癌靶點，去除重復靶點；最后整合藥物與疾病的靶點，利用Draw Veen Diaram 對交集靶點進行可視化處理，可知藥物-疾病交集靶點共170 個，如圖1 所示。

圖1 藥物疾病交集靶點Veen 圖Fig.1 Veen diagram of intersection targets of drug diseases

2.3 構建藥物-疾病交集靶點PPI 網(wǎng)絡圖

把170 個交集靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，所得結果導入Cytoscape 軟件進行可視化。PPI 網(wǎng)絡中共包含節(jié)點169 個，邊3128 條，節(jié)點越大，顏色越深，則degree 越高，表明這些靶點占據(jù)網(wǎng)絡核心[18]，因此本文列舉出了前15 的交集靶點及其相關信息（表2）。如圖2 所示，度值排在前列的靶點包括蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、細胞性腫瘤抗體P53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL6）、半胱天冬酶3（CASP3）、Myc 原癌基因蛋白（MYC）、等，表明這些靶點與藥對人參-甘草作用非小細胞肺癌有著直接的關系。

圖2 交集靶點相互作用網(wǎng)絡圖Fig.2 Key gene protein interaction network map

表2 15 個甘草、人參成分的潛在靶點信息Table 2 Potential targets of Radix Glycyrrhizae and ginseng

2.4 構建GO 和KEGG 通路富集結果網(wǎng)絡圖

將所得交集靶點導入到DAVID 數(shù)據(jù)庫中，進行GO 和KEGG 富集分析，以P＜0.05 為篩選標準。得到GO 富集分析條目共821 條：BP 條目629條，主要涉及RNA 聚合酶Il 啟動子的轉錄正調(diào)控、轉錄陽性，DNA 模板化、凋亡過程的負調(diào)控、藥物反應、凋亡等生物過程；CC 條目65 個，涵蓋了內(nèi)核、胞質(zhì)、細胞質(zhì)、核漿、細胞外空隙等細胞成分；MF 條目127 個，主要涉及蛋白結合、酶結合、轉錄因子等。KEGG 通路富集分析包含KEGG 通路169 條，如圖3 其中涉及與癌癥相關的17 條，主要包括非小細胞肺癌通路、肺癌通路、癌癥通路、TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路等。

圖3 人參-甘草GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of GO and KEGG pathways for potential targets of ginseng and licorice active ingredients

2.5 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

將人參-甘草活性成分以及成分對應靶點輸入Cytoscape 3.7.1 軟件，構建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡中節(jié)點（Node）代表藥對人參-甘草成分與靶點，其中黃色菱形代表藥對人參-甘草的成分，綠色圓形代表成分靶點；網(wǎng)絡中的邊（Edge）用于連接成分與靶點，整個網(wǎng)絡展示藥物-成分-靶點之間的聯(lián)系，分析網(wǎng)絡圖（圖4），可知網(wǎng)絡圖中包含節(jié)點（node）362 個，邊（edge）20 條。證明人參-甘草通過多個藥效成分調(diào)控多個靶點發(fā)揮抗非小細胞肺癌作用。

圖4 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig.4 Active ingredient - key target gene network map

2.6 人參-甘草對腫瘤細胞增殖的影響

與對照組相比，人參-甘草溶液對細胞人非小細胞肺癌A549 細胞具有抑制作用。前人研究表明，細胞增殖是腫瘤生長和發(fā)展的基礎，而人參與甘草提取物溶液對A549 細胞均有不同程度抑制作用[17,19-20]。處理12 h 后，600、800 μg/mL 組抑制率與對照組相比顯著性降低（P＜0.05，P＜0.01）。處理24 h 后，100、200、300、400、600、800 μg/mL 組與對照組相比，抑制率降低，有極顯著性差異（P＜0.01），如表3。這種抑制作用在實驗范圍內(nèi)與溶液濃度、作用時間均呈正相關，會隨著作用時間的增加或作用濃度的升高而增長。以上結果說明人參-甘草顯著抑制人非小細胞肺癌A549 細胞增殖，并呈時間-劑量依賴性。這一結果與前人的研究基本一致。

表3 不同濃度人參-甘草溶液對細胞抑制率的影響（ ±SD）Table 3 Effect of different concentrations of ginseng-licorice solution on cell inhibition rate ( ±SD)

表3 不同濃度人參-甘草溶液對細胞抑制率的影響（ ±SD）Table 3 Effect of different concentrations of ginseng-licorice solution on cell inhibition rate ( ±SD)

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別N12 h24 h對照組300 12.5 μg/mL組30.07±0.020.12±0.04 25 μg/mL組30.19±0.010.47±0.03 50 μg/mL組30.35±0.020.92±0.02 100 μg/mL組30.39±0.024.49±0.01**200 μg/mL組30.40±0.038.85±0.04**300 μg/mL組30.95±0.0112.63±0.06**400 μg/mL組31.30±0.0313.56±0.01**600 μg/mL組31.81±0.02*14.22±0.03**800 μg/mL組33.38±0.02**15.50±0.05**

2.7 人參-甘草對腫瘤細胞凋亡的影響

細胞凋亡是指細胞在特定基因的控制下，受到多個基因嚴格控制而發(fā)生的自動死亡過程[21]。誘導細胞凋亡是消除腫瘤細胞的有效治療方法。不同濃度人參-甘草溶液（1、2、4 μg/mL）處理人非小細胞肺癌A549 細胞24 h 后，采用流式細胞術檢測其對細胞凋亡的影響。圖5 中左上象限代表壞死細胞，左下象限代表正常細胞，右上象限代表晚期凋亡細胞，右下象限代表早期凋亡細胞。與對照組相比，1、2、4 μg/mL 組中凋亡細胞明顯增多，正常細胞明顯減少，凋亡率分別為6.11%、10.69%、84.16%（表4）。與對照組相比，隨濃度增加人非小細胞肺癌A549 細胞凋亡率明顯上升。結果表明人參-甘草誘導腫瘤細胞凋亡，呈明顯濃度依賴性。本文的研究結果與現(xiàn)有文獻報道一致[17,19-20]。

圖5 不同濃度人參-甘草溶液對細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of different concentrations of Ginseng-Licorice solution on cell apoptosis

表4 不同濃度人參-甘草溶液對細胞凋亡率的影響（ ±SD）Table 4 Effect of different concentrations of ginseng-licorice solution on cell apoptosis rate ( ±SD)

表4 不同濃度人參-甘草溶液對細胞凋亡率的影響（ ±SD）Table 4 Effect of different concentrations of ginseng-licorice solution on cell apoptosis rate ( ±SD)

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別N凋亡率（%）對照組33.07±0.38 1 mg/mL組36.11±0.30**2 mg/mL組310.69±0.51**4 mg/mL組384.16±0.41**

3 討論與結論

近年來中藥對NSCLC 治療的顯著療效受到了科研工作者的關注，中藥配伍作用于NSCLC 療效機制的現(xiàn)代研究也越來越多。Hu 等[22]研究發(fā)現(xiàn)紅花巖黃耆-莪術可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號通路，有效抑制NSCLC 細胞增殖和遷移；趙粵[23]研究發(fā)現(xiàn)黃芪-半枝蓮通過改善NSCLC 模型小鼠炎癥狀態(tài)，調(diào)節(jié)腸道菌群組成來發(fā)揮抗腫瘤作用；趙夢倩[24]研究發(fā)現(xiàn)黃芪-半枝蓮可通過影響NSCLC 相關因子TNF-α、TGF-β及IL-6 的表達水平而發(fā)揮抗腫瘤作用，抑制NSCLC 細胞增殖。藥食同源中藥在抗腫瘤作用中存在巨大的潛力，因此本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法分析人參-甘草對非小細胞肺癌的有效成分、潛在靶點和作用機制，并結合體外細胞實驗MTT 比色法檢測活性及流式細胞術檢測凋亡對藥理作用進行驗證。

從PPI 網(wǎng)絡圖結果分析，可初步確定蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、細胞性腫瘤抗體P53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL6）、半胱天冬酶3（CASP3）、Myc 原癌基因蛋白（MYC）等是人參-甘草治療非小細胞肺癌的關鍵靶點。其中靶點AKT1 是一種蛋白激酶，AKT1 基因位點的突變與腫瘤的發(fā)生及生成關系密切，對細胞的增殖和生長均有影響[25-26]。TP53 是公認的抑癌基因，TP53 蛋白調(diào)節(jié)有多種細胞功能，如DNA 合成和修復、細胞周期阻滯、衰老和凋亡[27]。IL-6 是一種細胞因子，主要與炎癥反應相關，白細胞介素現(xiàn)在被認為是連接炎癥和癌癥的重要介質(zhì)[28]。TNF 則是癌癥誘導炎癥主要介質(zhì)[29]。CASP3 是細胞凋亡中重要的蛋白酶，在細胞凋亡過程中被激活，并可通過多種作用機制影響腫瘤細胞的增殖凋亡[30-31]。MYC 基因由3 個副同源物C-MYC、N-MYC 和L-MYC 組成，是人類癌癥中最常失調(diào)的驅動基因之一，MYC 表達和阻斷已被證明參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[32]。綜上，人參-甘草可通過調(diào)控上述包括核心靶點在內(nèi)的眾多靶點起到治療的NSCLC 作用。

KEGG 代謝通路富集分析結果顯示，人參-甘草可能對非小細胞肺癌通路、肺癌通路、TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路具有調(diào)控作用。在腫瘤的表達中，活化的AKT1 磷酸化下游底物，可調(diào)節(jié)細胞的凋亡、血管生成和藥物反應[33]。且有數(shù)據(jù)表明AKT1 是不吸煙肺癌患者中最常見的單基因突變之一[34]。這提示，AKT 信號通路可能進一步作為癌癥治療的潛在分子通路。TNF 能控制免疫系統(tǒng)的發(fā)育，細胞存活信號通路，增殖并調(diào)節(jié)代謝過程，已經(jīng)被證明具有選擇性抗腫瘤活性[29,35]。TNF 中相關的凋亡配體TRAIL 可通過磷脂酰肌醇3'-激酶（PI3-K）激活AKT，從而阻斷線粒體依賴凋亡通路中細胞色素c 釋放的上游的Bid 裂解，誘導NSCLC 細胞存活[36]。以上體現(xiàn)了人參-甘草中的活性成分的多個靶點可通過多條代謝通路來干預NSCLC 的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過MTT 比色法檢測人參-甘草抑制人非小細胞肺癌A549 細胞增殖活性，結合抑制率的變化趨勢可知，人參-甘草抑制A549 細胞活性對濃度和作用時間有依賴性。在一定范圍內(nèi)，其抑制作用與提取物濃度和作用時間均呈正相關。隨后用細胞凋亡術測定人參-甘草誘導腫瘤細胞凋亡作用，結果表明人參-甘草誘導腫瘤細胞凋亡，呈明顯濃度依賴性。從而進一步確定了人參-甘草對NSCLC 細胞的藥效學作用。

綜上所述，人參-甘草可能的抗非小細胞肺癌機制為，其中的活性成分山柰酚、槲皮苷、甘草寧B、7-甲氧基-4'-羥基異黃酮、甘草寧A、黃烷酮等多種活性物質(zhì)通過AKT1、TP53、TNF、IL6、CASP3、MYC等靶點作用于NSCLC，通過TNF/AKT 信號通路、非小細胞肺癌通路、肺癌通路、T 細胞受體信號通路等多重信號通路最終干預NSCLC 的發(fā)生發(fā)展。體外實驗進一步驗證人參-甘草對NSCLC 有顯著抑增殖、促凋亡作用。這為進一步深入的研究提供了新的理論基礎，為臨床上人參-甘草治療NSCLC 提供了新思路。