新醫(yī)學科學與技術綜合實驗設計：光熱-光動力協(xié)同抗菌納米涂層制備

＊邱云峰 李信哲 陳歌輝 惠建博 果崇申 劉紹琴*

（1.哈爾濱工業(yè)大學醫(yī)學與健康學院 黑龍江 150080 2.哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院 黑龍江 150001）

鈦合金憑借其優(yōu)異的生物相容性、機械強度、耐腐蝕性等優(yōu)點已經廣泛用作骨骼、關節(jié)、牙齒等替代物。然而鈦植入物表面由于細菌粘附極易引發(fā)細菌感染，造成植入失效或面臨二次手術，已經發(fā)展成為臨床上亟待解決的醫(yī)學難題[1]?；诖?，鈦植入物表面抗菌納米涂層制備是近年來納米醫(yī)學領域的重要研究熱點之一[2]。

無機納米抗菌劑具有廣譜抗菌性能，可以殺滅耐藥細菌[3]。研究發(fā)現(xiàn)光熱-光動力、光熱-化療等聯(lián)合療法比單獨療法具有更優(yōu)異的協(xié)同抗菌效果，可以減少藥物用量和高熱對正常組織的損傷[4]。在鈦植入物表面制備聯(lián)合抗菌涂層是納米醫(yī)學領域重要的發(fā)展方向，但是目前高校在相關領域的教學中主要依賴于科技前沿導論等理論課程，即使開設抗菌類實驗也僅僅是圍繞平板計數(shù)法等實驗操作，忽視與國際研究熱點的聯(lián)系[5-6]。遵循此思路，有必要將聯(lián)合抗菌納米涂層引入到本科實驗教學中，提高學生的科研創(chuàng)新能力，把握前沿學術方向[7]。本綜合實驗抗菌涂層制備工藝成熟便捷，實驗參數(shù)容易控制，學院分析測試技術平臺和微生物平臺完善，實驗周期較短，適合本科生的專業(yè)實驗教學。

1.實驗目的

（1）了解光熱效應和光照產生活性氧物種的原理。（2）掌握聚多巴胺/Ag@AgCl涂層的制備方法。（3）了解XRD、SEM、FTIR等設備結構、原理和使用方法。（4）掌握抑菌性能研究方法。

2.實驗原理

（1）聚多巴胺的光熱治療抗菌原理。聚多巴胺是一種具有近紅外吸收特性的仿生高分子材料，在弱堿性水相條件下即可發(fā)生自聚合反應，具有優(yōu)異的生物安全性。其光熱轉換效率可以高達40%，遠遠大于文獻中廣泛使用的金納米棒（20%）。聚多巴胺可以迅速將光能轉化為熱能破壞細菌細胞膜，進而殺滅細菌[8]。并且對于已經形成生物被膜的結構也可以利用高熱破壞外層菌膜結構殺滅深層細菌。基于此物理殺菌機制可以避免耐藥細菌的產生。

（2）Ag@AgCl光動力治療抗菌原理。光敏劑在特定波長的光激發(fā)下，激發(fā)態(tài)的光敏劑將能量傳遞給周圍的O2分子形成高活性氧物種,引起細菌氧化應激，導致細菌死亡。光動力殺菌技術能夠選擇性地治療局部感染病灶，對健康組織和周邊細胞損害小。Ag@AgCl包含AgCl半導體（帶隙：3.25eV）光吸收和Ag的表面等離激元共振吸收，吸收光譜范圍覆蓋可見區(qū)到近紅外波段，可以在光激發(fā)下產生活性氧物種，已經廣泛用于光動力抗菌和抗腫瘤等。

（3）聚多巴胺/Ag@AgCl涂層的光熱-光動力協(xié)同抗菌原理。光熱效應顯著改變細菌細胞膜的通透性，光動力生成的ROS可以更加容易的進入到細菌的內部，造成DNA損傷和蛋白質變性，大量蛋白質等流失后引起細菌的死亡。因此光熱-光動力協(xié)同抗菌劑可以比單一抗菌療法具有更加優(yōu)異的抗菌效果。

3.實驗儀器

（1）實驗試劑。醫(yī)用鈦片、硝酸銀、鹽酸多巴胺、Tris-HCl、蒸餾水、氫氧化鉀、肉湯、瓊脂、pH試紙、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、Syto 9綠色熒光染料和碘化丙啶（PI）。

（2）實驗儀器。燒杯、錐形瓶、移液槍、磁力加熱攪拌器、烘箱、XRD、SEM、FTIR、CLSM、近紅外光源激光器、紅外攝像儀、超聲波清洗器、潔凈臺、滅菌鍋、紫外燈、酒精燈、涂布棒。

（3）實驗表征。采用Quanta 200FEG型號SEM表征鈦片形貌。通過PANalytical Empyrean型號XRD測定結構。采用賽默飛FTIR表征聚多巴胺分子結構。采用菲利爾E8紅外成像儀測試光熱轉換溫度。采用808nm近紅激光器進行抗菌性能研究。采用尼康A1R激光掃描共聚焦顯微鏡觀察活死細胞。

4.實驗過程

（1）醫(yī)用鈦片的表面處理。將1mm厚度鈦片裁剪為1cm×1cm，乙醇和水分別超聲清洗5min待用。配置4mol/L氫氧化鉀水溶液50mL，將上述鈦片浸入裝有堿液的燒杯中，室溫刻蝕24h，反應結束后用大量去離子水清洗去除表面殘留，pH試紙測試水溶液pH為7左右，放入50℃烘箱烘干。采用SEM觀察堿刻蝕鈦片形貌。如圖1所示，4mol/L堿溶液可以在鈦片表面刻蝕多孔納米結構。

圖1 （a）純水和（b）4mol/L氫氧化鉀溶液刻蝕醫(yī)用鈦片表面的SEM圖

（2）聚多巴胺/Ag@AgCl涂層。將0.05g多巴胺鹽酸鹽和0.05g AgNO3加入到7mL Tris-HCl緩沖溶液（pH8.5，0.01mol/L）中，將多孔鈦片浸泡在上述混合溶液，連續(xù)機械攪拌24h，獲得聚多巴胺/Ag@AgCl。通過XRD進行測定結構。采用FTIR表征聚多巴胺的酰胺基、芳香環(huán)和鄰苯二酚中羥基官能團的伸縮振動。

（3）光熱性能評價。激光功率（1W/cm2），距離10cm，使用熱成像儀每分鐘記錄溫度變化和熱圖像，輻照時間20min，利用Origin軟件繪制曲線。如圖2所示，在808nm激光輻照下溫度逐漸升高，20min后溫度達到56.5℃，高于對照組。

圖2 （a）涂層修飾鈦片在激光輻照下的熱成像圖；（b）純水、鈦片和涂層修飾鈦片升溫曲線

（4）光熱-光動力抗菌性能和機理研究。使用滅菌鍋對錐形瓶、肉湯和瓊脂培養(yǎng)基等進行滅菌。選擇革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和陰性菌（大腸桿菌）作為研究對象，復蘇冷凍細菌，將對數(shù)期菌懸液稀釋至108CFU/mL待用。選擇24孔板作為反應器，將50μL細菌培養(yǎng)物加入450μL肉湯中，將修飾涂層的鈦片浸泡在上述肉湯中，37℃條件下培養(yǎng)6h。使用808nm激光輻照，采用紅外熱像儀監(jiān)測溫度。殺菌完成后，將對照組和實驗組的菌懸液稀釋，瓊脂板37℃培養(yǎng)12h。采用ImageJ軟件對菌落計數(shù)，實驗平行三次。如圖3所示，涂層修飾鈦片表面菌落數(shù)目最少，其抑菌率為99.7%，遠遠大于無光照組，以及光照純鈦片和聚多巴胺修飾鈦片對照組。

圖3 （a）鈦片和涂層修飾鈦片表面在光照下大腸桿菌落生長情況（b）鈦片、聚多巴胺修飾鈦片和涂層修飾鈦片的抑菌率

使用移液槍稱取熒光染料滴加到PBS溶液中，將染料滴加到覆蓋菌落的鈦片，避光吸附15min，沖洗3次，利用激光共聚焦顯微鏡表征活死細菌?？咕鷮嶒灲Y束，4%多聚甲醛溶液低溫固定，乙醇梯度脫水10min，自然晾干，噴金處理后測試SEM。

（5）其它協(xié)同抗菌涂層的制備方法。為了提高學生抗菌納米涂層研發(fā)能力，除了上述聚多巴胺/Ag@AgCl涂層，鼓勵學生分組設計抗菌涂層，例如選擇碳材料、半導體等抗菌材料，通過調研文獻，撰寫實驗方案和實驗可行性分析，依據(jù)光熱-光動力基本原理，設計抗菌涂層，對比抗菌效果，總結設計規(guī)律和抗菌機制，為研究生階段的科研課題設計打下堅實的理論基礎。

5.實驗教學內容設計

(1)實驗前準備

本實驗涉及材料、抗菌、表征等多個領域的基礎知識，將提前2周安排學生查閱光熱-光動力抗菌研究的文獻，并建議學生掌握以下知識：①了解鈦片堿刻蝕、聚多巴胺合成和Ag@AgCl制備方面的知識；②了解光熱治療和光動力治療的原理；③了解耐藥菌的產生機制以及殺滅耐藥菌的主要方法；④了解活死細菌染色機理；⑤了解儀器和制圖軟件的原理和操作方法。

(2)實驗課程安排

本綜合實驗擬為醫(yī)學與健康學院的新醫(yī)學科學與技術綜合實驗開設，累計72學時，本部分16學時，4～6人一組。為保障實驗順利進行，每次操作至少2人在場，教師現(xiàn)場指導，共同完成實驗。

具體安排如下：①理論課2學時。講授鈦片刻蝕原理、聚多巴胺形成機制、一步法制備Ag@AgCl原理、光熱和光動力抗菌原理、活死細菌染色和死菌表征方法。②鈦片預處理2學時，包括清洗鈦片、配置堿液、稱量藥品等。③聚多巴胺/Ag@AgCl涂層修飾鈦片制備2學時，包括配置Tris溶液、稱量藥品、準備攪拌器等。④形貌和組成表征3學時。大二本科生通過大學生科創(chuàng)項目熟悉常用表征設備，根據(jù)準備樣品、上機操作等安排3學時。⑤抗菌研究7學時。根據(jù)器皿滅菌、制備瓊脂、細菌復蘇、光照等安排7學時。⑥實驗結束后2周以內上交實驗論文。包括原理、圖表和分析、結論、創(chuàng)新點、文獻等內容。

(3)思考題

設計如下問題供學生思考：①為什么要設計協(xié)同抗菌納米催化劑？②單質Ag的作用是什么？③除了聚多巴胺/Ag@AgCl涂層，還可以設計哪些新穎的協(xié)同抗菌劑？

6.結束語

本綜合實驗通過理論和實驗教學的有機結合，實現(xiàn)了光熱-光動力協(xié)同抗菌納米材料的應用。在本實驗中，通過文獻調研，使學生們了解抗菌納米材料的前沿進展，培養(yǎng)學生們查詢文獻、整理資料、總結前沿熱點的能力。本實驗中聚多巴胺在堿性條件下就可以聚合，并且使用的化學試劑包含氯離子，可以同時制備Ag@AgCl，一步法就可以方便的在鈦片表面形成穩(wěn)定的納米抗菌涂層，制備方法簡便可控，適合本科生教學實驗。在抗菌性能研究和材料表征過程中，學生們的理論知識可以在實踐操作中得到有效的檢驗，有利于提高學生的科研創(chuàng)新能力。