基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多組學(xué)分析腐敗希瓦氏菌冷適應(yīng)的機制

高鑫，李博*，劉小杰*

（1.上海城建職業(yè)學(xué)院，上海 201415；2.上海教育教學(xué)創(chuàng)新團隊，上海 201415）

冷藏水產(chǎn)品的特定腐敗菌種（spoilage organism，SSOs）可以在低溫下對水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)進行降解，并生成腐胺、尸胺和H2S 等異味物質(zhì)，形成生物膜導(dǎo)致水產(chǎn)品表面發(fā)黏等[1-2]，造成水產(chǎn)品在低溫運輸與貯藏過程中的腐敗，從而影響感官。在冷藏水產(chǎn)品中，絕大部分微生物生長緩慢甚至停滯，但腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）能夠在低溫下長期存活并繁殖，形成特定腐敗菌種（SSOs）[3]。農(nóng)產(chǎn)品流通產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告顯示，2022 年我國海水產(chǎn)品流通損耗率高達10%。因此，深入探究S.putrefaciens 的冷適應(yīng)機制對于延長冷藏水產(chǎn)品貨架期具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)可從RNA 水平上闡述宿主或環(huán)境對原核生物影響而產(chǎn)生的基因轉(zhuǎn)錄應(yīng)答變化，細菌通過表達單組分感應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子或雙組分系統(tǒng)感受胞外信號，激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并使下游的轉(zhuǎn)運蛋白和酶在基礎(chǔ)水平上增強或減弱表達，增加代謝途徑中間體的產(chǎn)生，進而進入各個代謝途徑調(diào)控細胞物質(zhì)和能量的分配。例如，通過RNA-seq 分析發(fā)現(xiàn)，低溫導(dǎo)致柑橘黃龍病菌（Xanthomonas citripv.Citri，Xcc）的Ⅳ型菌毛狀突系統(tǒng)及發(fā)病機制相關(guān)的基因表達產(chǎn)生差異性變化，這是Xcc 對冷應(yīng)激的重要細胞適應(yīng)反應(yīng)[4]。目前已有很多研究表明，細胞壁組分合成基因[5]、細菌趨化性相關(guān)基因[6]和群體感應(yīng)相關(guān)基因[7]等的表達對S.putrefaciens 在低溫冷適應(yīng)方面具有重要的貢獻?；谵D(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進行多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，能夠深層次挖掘大量數(shù)據(jù)，已經(jīng)成為闡述生物應(yīng)答機制的重要手段[8-11]。

本研究利用多組學(xué)聯(lián)合分析的手段，探究低溫下S.putrefaciens 在不同基因表達層面的適應(yīng)性變化，以期探索脂肪酸代謝和能量代謝通路對促進腐敗希瓦氏菌冷適應(yīng)的作用及機理，并深入探討S.putrefaciens在低溫下的代謝改變和調(diào)控機理，為低溫水產(chǎn)品的儲運提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

S.putrefaciens ATCC8071：上海海洋大學(xué)食品學(xué)院實驗室保藏；瓊脂粉、氯化鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：生工生物工程股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）、RNase/DNase free八連管：賽默飛世爾科技公司；羅氏熒光定量試劑盒：上海羅氏制藥有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司、DNA 酶活：德潤誠生物科技有限公司；熒光染料：上海翊圣生物技術(shù)有限公司；DNA marker DL2000/5000：寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷：北京德爾曼生物科技有限責(zé)任公司；溶菌酶（≥20 000 U/mg）：BBI 生命科學(xué)有限公司；Promega Eastep Super 總RNA 提取試劑盒：上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量基因擴增儀（StepOnePlusTM）、超凈工作臺（YJ）：賽默飛世爾科技公司；冰箱（4、-20 ℃和-80 ℃）：海爾集團公司；搖床（ZHTY-70）：上海知楚儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（GZP-450）：上海精宏實驗設(shè)備有限公司、聚合酶鏈式反應(yīng)儀（MastercyclerRX50）：艾本德國際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 S.putrefaciens 的培養(yǎng)

將低溫凍存的S.putrefaciens 活化于無抗大豆胨瓊脂（tryptic soytone agar，TSA）培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)過夜，次日取單菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）液體培養(yǎng)基中，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，取500 μL 菌液再次接種于35 mL TSB 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至適當OD600并進行后續(xù)試驗。

1.3.2 S.putrefaciens 總RNA 的提取

培養(yǎng)過夜的S.putrefaciens 轉(zhuǎn)接到新鮮TSB 液體培養(yǎng)基中生長16 h 后，分別將細菌轉(zhuǎn)入4 ℃和30 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)48 h，并用總RNA 提取試劑盒提取總RNA，總RNA 保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(yīng)（real time quantitative polymerose chain reaction，RTqPCR）

參考檢測試劑盒說明書進行試驗，引物設(shè)計見表1。

對全部107個實驗樣本進行實驗分析，統(tǒng)計107個實驗樣本平均50 km行程中不同因素出現(xiàn)的頻數(shù)如表2所示：

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers of RT-qPCR

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測序分析

過夜培養(yǎng)的菌液取500 μL 轉(zhuǎn)接入35 mL 新鮮的TSB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4，取1 mL菌液分別置于4 ℃（樣品編號記為E）和30 ℃（樣品編號記為A）下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取總RNA。進行轉(zhuǎn)錄組測序（transcriptome sequencing，RNA-seq），分析方法采用DESeq2，篩選標準為|log2FoldChange|＞0（log2Fold-Change 是一種表達量變化比率，可以用來比較不同表達量水平的數(shù)據(jù)之間的相對變化）和padj＜0.05（padj為統(tǒng)計學(xué)差異顯著性檢驗指標）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)使用Prism 8 軟件，分別采用t-test、Oneway ANOVA 和Two-way ANOVA 進行分析，數(shù)據(jù)均使用平均值±標準差表示，當p＜0.05 時，表明數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

1.5 多組學(xué)聯(lián)合分析

對處于低溫培養(yǎng)的S.putrefaciens 脂質(zhì)組學(xué)、蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進行了多組學(xué)相關(guān)性分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析及相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析，數(shù)據(jù)采用spearman 算法進行相關(guān)性計算，以相關(guān)系數(shù)絕對值＞0.9 和p＜0.05 作為篩選顯著性相關(guān)的閾值標準進行高通量數(shù)據(jù)兩兩聯(lián)合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫條件影響S.putrefaciens 脂肪酸代謝和能量代謝通路相關(guān)基因的表達

4 ℃和30 ℃下S.putrefaciens 表達基因的韋恩圖見圖1。

圖1 4 ℃和30 ℃下S.putrefaciens 表達基因的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of S.putrefaciens expression genes at 4 ℃and 30 ℃

由圖1 可知，S.putrefaciens 只在4 ℃和只在30 ℃表達的基因分別有39 個和36 個，而有3 602 個基因在兩種條件下均表達。進一步比較4 ℃和30 ℃下的基因表達差異，結(jié)果顯示，4 ℃下生長的S.putrefaciens 相較于30 ℃共有2 142 個基因具有顯著性差異，其中上調(diào)和下調(diào)的基因分別有1 066 個和1 074 個。

RNA-seq 關(guān)鍵基因的RT-qPCR 驗證見圖2。

圖2 RNA-seq 關(guān)鍵基因的RT-qPCR 驗證Fig.2 Verification of RNA-seq by RT-qPCR

4 ℃和30 ℃下S.putrefaciens 脂肪酸代謝和能量代謝差異基因所在的KEGG 通路見表2。

表2 4 ℃和30 ℃下S.putrefaciens 脂肪酸代謝和能量代謝差異基因所在的KEGG 通路Table 2 The different genes of fatty acid metabolism and energy metabolism in S.putrefaciens at 4 ℃and 30 ℃strains according to KEGG pathway

由表2 可知，這些共同表達的差異基因在脂肪酸代謝及能量代謝相關(guān)通路富集較多，其中脂肪酸合成、代謝和降解的基因占富集基因總數(shù)的41.5%，三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）占16%，氧化磷酸化占23.6%，糖酵解/糖異生占18.9%，結(jié)果表明：與脂質(zhì)和能量代謝相關(guān)的通路在低溫下可能與S.putrefaciens 的冷適應(yīng)有密切聯(lián)系。

2.2 低溫影響S.putrefaciens 脂肪酸代謝基因的表達

S.putrefaciens 低溫下與脂肪酸代謝相關(guān)基因表達情況見表3。S.putrefaciens 低溫下與甘油酯代謝相關(guān)基因表達情況見表4。

表3 S.putrefaciens 低溫下與脂肪酸代謝相關(guān)基因表達情況Table 3 Expression of genes related to fatty acid metabolism of S.putrefaciens at low temperature

表4 S.putrefaciens 低溫下與甘油酯代謝相關(guān)基因表達情況Table 4 Expression of genes related to glyceride metabolism of S.putrefaciens at low temperature

由表3～表4 可知，通過分析RNA-seq 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與脂肪酸代謝相關(guān)的fadA、fadB、SPUTCN32_RS09215以及參與脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運的外在膜蛋白基因SPUTCN32_RS02420 出現(xiàn)顯著性下調(diào)（表3）。參與細胞膜甘油酯代謝相關(guān)的基因出現(xiàn)顯著性上調(diào)（表4），表明在低溫會抑制S.putrefaciens 脂肪酸的降解和轉(zhuǎn)運途徑。此外，RNA-seq 結(jié)果顯示，S.putrefaciens 的多種控制3-ketoacyl-ACP synthases 的基因在低溫下出現(xiàn)顯著性上調(diào)，例如fabF、SPUTCN32_RS02215、SPUTCN32_RS08050、SPUTCN32_RS12145、SPUTCN32_RS -02200，激活了低溫下的脂肪酸合成途徑，增加細胞脂質(zhì)含量，可能防止了細胞在低溫下的損傷；除了多種3-ketoacyl-ACP synthases 基因顯著性上調(diào)，與鏈延長中還原反應(yīng)相關(guān)的trans-2-enoyl-CoA reductase 家族蛋白基因SPUTCN32_RS07620、負責(zé)合成長鏈不飽和脂肪酸的fabA 和負責(zé)將丙二酰CoA 轉(zhuǎn)移到?；d體蛋白ACP 上的fabD 基因同樣顯著性上調(diào)，這些結(jié)果均證明了低溫激活了S.putrefaciens 的脂肪酸合成。

2.3 多組學(xué)聯(lián)合分析低溫條件影響S.putrefaciens 脂肪酸代謝促進其冷適應(yīng)的機制

為了深入分析參與S.putrefaciens 冷適應(yīng)相關(guān)的基因表達的變化，進一步了解低溫下S.putrefaciens維持存活和生長的關(guān)鍵機制，基于前期掌握的低溫下S.putrefaciens 冷適應(yīng)相關(guān)蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)[12]，對蛋白組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，進而挖掘差異蛋白和差異基因的相關(guān)性，篩選出S.putrefaciens 在低溫下顯著上調(diào)的蛋白并將其定位到KEGG 途徑上。通過整理聯(lián)合分析得到的S.putrefaciens 映射通路，發(fā)現(xiàn)S.putrefaciens 甘油酯代謝（spc00564）中CDP-二酰基甘油-絲氨酸O-磷脂酰轉(zhuǎn)移酶出現(xiàn)顯著性上調(diào)，CDP-二?；视?絲氨酸O-磷脂酰轉(zhuǎn)移酶能夠參與細胞膜中磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines，PE）的生成，首先該酶催化由CDP-二?；视秃蚅-絲氨酸產(chǎn)生的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），隨后PS經(jīng)磷脂酰絲氨酸脫羧酶催化脫羧形成PE，PE 含量的增加有利于維持細胞膜通透性，促進細胞在低溫下進行有效的物質(zhì)交換。此外，基于試驗前期掌握的低溫下S.putrefaciens 冷適應(yīng)相關(guān)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)[13]，進一步對脂質(zhì)組學(xué)與蛋白組學(xué)聯(lián)合分析差異脂質(zhì)和差異蛋白的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)S.putrefaciens 脂肪酸代謝途徑（spc01212）中乙酰輔酶A 脫氫酶結(jié)構(gòu)域蛋白出現(xiàn)顯著性上調(diào)。酯酰基輔酶A 脫氫酶作為脂肪酸β 氧化過程中第一個限速酶參與長鏈脂肪酸的脫氫步驟，產(chǎn)物再經(jīng)加水、脫氫和硫解步驟，每循環(huán)一次產(chǎn)生一分子的乙酰輔酶A，對于β 氧化至關(guān)重要。除了參與β 氧化外，酯?；o酶A 脫氫酶能夠增加細菌體內(nèi)不飽和脂肪酸的含量，而不飽和脂肪酸增加降低了磷脂雙分子層的堆積密度，導(dǎo)致液相至凝膠相變溫度的降低，對于低溫下維持細胞膜流動性、保證細胞正常的生理功能具有重要的生理意義。

2.4 低溫影響S.putrefaciens 能量代謝基因的表達

S.putrefaciens 低溫下與糖酵解和糖異生相關(guān)基因表達情況見表5。

表5 S.putrefaciens 低溫下與糖酵解和糖異生相關(guān)基因表達情況Table 5 Expression of genes related to glycolysis and gluconeogenesis of S.putrefaciens at low temperature

續(xù)表5 S.putrefaciens 低溫下與糖酵解和糖異生相關(guān)基因表達情況Continue table 5 Expression of genes related to glycolysis and gluconeogenesis of S.putrefaciens at low temperature

糖酵解和糖異生是影響細菌持續(xù)供能和抵抗外部不良環(huán)境的關(guān)鍵因素。由表5 可知，在4 ℃下，S.putrefaciens 與糖酵解相關(guān)的乙醇脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸激酶和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶等基因表達上調(diào)，表明在低溫條件下S.putrefaciens 的糖酵解過程增強，為細胞抵抗低溫環(huán)境和維持正常的生理代謝提供更多的能量，同時為其它代謝提供三磷酸腺苷和中間產(chǎn)物。此外，S.putrefaciens 與糖異生相關(guān)的基因也有個別上調(diào)，如磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶等產(chǎn)物的基因表達（表5），該酶能夠在細胞高糖水平下啟動磷酸烯醇丙酮酸的羧化過程并將其氧化到羧酸，提供細胞有利的熱能量，維持細胞正常運轉(zhuǎn)。

S.putrefaciens 低溫下與三羧酸循環(huán)相關(guān)基因表達情況見表6。S.putrefaciens 低溫下與氧化磷酸化相關(guān)基因表達情況見表7。

表6 S.putrefaciens 低溫下與三羧酸循環(huán)相關(guān)基因表達情況Table 6 Gene expression of S.putrefaciens related to the TCA cycle at low temperature

表7 S.putrefaciens 低溫下與氧化磷酸化相關(guān)基因表達情況Table 7 Expression of genes related to oxidative phosphorylation of S.putrefaciens at low temperature

通過分析RNA-seq 結(jié)果，在4 ℃下S.putrefaciens與三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化相關(guān)的諸多基因出現(xiàn)顯著性上調(diào)，例如琥珀酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸還原酶、檸檬酸合酶、細胞色素c1、黃酮類化合物c、泛醌氧化酶亞基II、細胞色素c、b 氧化酶亞基、細胞色素o 泛醌氧化酶亞基I 等產(chǎn)物的基因表達（表6、表7），這些基因表達的上調(diào)均有利于S.putrefaciens 能量的產(chǎn)生和中間產(chǎn)物的積累，可能用于S.putrefaciens 在冷適應(yīng)狀態(tài)下物質(zhì)的生物合成和能量獲取。

2.5 多組學(xué)聯(lián)合分析低溫條件影響S.putrefaciens 能量代謝促進其冷適應(yīng)的機制

為了深入分析冷適應(yīng)與能量代謝之間的關(guān)聯(lián)，從而了解低溫下S.putrefaciens 繁殖和水產(chǎn)品腐敗關(guān)鍵機制，研究對脂質(zhì)組學(xué)與蛋白組學(xué)進行了聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)與S.putrefaciens 氧化磷酸化（spc00190）相關(guān)的還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）脫氫酶、琥珀酸脫氫酶亞基B、細胞色素c1、琥珀酸脫氫酶亞基C、琥珀酸脫氫酶亞基D、泛醌-細胞色素c還原酶/鐵硫亞單位、細胞色素b/b6/N 末端結(jié)構(gòu)域和細胞色素杜比奎醇氧化酶亞基II 在低溫下出現(xiàn)顯著性上調(diào)。此外，還發(fā)現(xiàn)S.putrefaciens 的三羧酸循環(huán)（spc00020）中琥珀酸脫氫酶亞基B 和O-氧戊二酸脫氫酶成分2 出現(xiàn)顯著性上調(diào)。

NADH 脫氫酶作為電子傳遞鏈的第一個質(zhì)子泵，其上調(diào)表達能夠在增強S.putrefaciens 在低溫下的呼吸鏈，使細胞在低溫等不利因素下仍然能持續(xù)供能，這可能是S.putrefaciens 在低溫下大量繁殖的重要原因。除了NADH 脫氫酶，琥珀酸脫氫酶在低溫下的上調(diào)對于S.putrefaciens 的三羧酸循環(huán)供能也起著重要作用。細胞色素c 氧化酶、細胞色素還原酶以及細胞色素c1、細胞色素b 作為電子傳遞鏈末端的酶和中間電子載體，具有質(zhì)子泵和電子傳遞的功能，其上調(diào)對于S.putrefaciens 氧化磷酸化和電子傳遞鏈具有增強作用，促使細胞處于低溫環(huán)境的同時能夠保證其進行營養(yǎng)的獲取、代謝酶促反應(yīng)、生物合成及繁殖，增強抗逆性。2-氧戊二酸脫氫酶E2 是二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的組分，二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶是α-酮戊二酸脫氫酶系之一，構(gòu)成α 酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的核心酶，同時也負責(zé)腺苷三磷酸的產(chǎn)生，對于能量的產(chǎn)生具有重要作用。該酶的上調(diào)促進了琥珀酰CoA 的產(chǎn)生，從而增強三羧酸循環(huán)和腺苷三磷酸的產(chǎn)生。

3 討論

S.putrefaciens 在低溫中具有很強的可持續(xù)存活、增殖和致腐能力，對全球水產(chǎn)品的物流和銷售造成了很大的經(jīng)濟損失。為克服寒冷環(huán)境對微生物存活的多重脅迫，微生物演化出了多種復(fù)雜的協(xié)作適應(yīng)能力，從細胞膜和酶的適應(yīng)到低溫保護劑及其伴侶的產(chǎn)生，甚至進化出新的代謝能力[14-17]。利用多組學(xué)聯(lián)合分析微生物對于環(huán)境適應(yīng)的基因應(yīng)答變化是有效的研究手段，將基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等組學(xué)試驗數(shù)據(jù)進行綜合分析已成為人們探索生物應(yīng)答機制的一種有效方法。本文為探究S.putrefaciens 在低溫下的存活和增殖機制，對4 ℃和30 ℃條件下的S.putrefaciens RNA-seq 結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)S.putrefaciens 在低溫下參與調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、脂肪酸生物合成和降解、糖酵解和糖異生、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、碳代謝等相關(guān)基因的表達，這與Liao 等[4]在探究低溫對微生物的冷刺激有相似的結(jié)果，同時，RT-qPCR 的驗證結(jié)果與RNA-seq 的數(shù)據(jù)具有一致性。

脂肪酸是細胞膜的重要組成部分，根據(jù)脂肪酸的含量來決定脂肪酸的降解和合成，對于維持膜脂穩(wěn)態(tài)具有重要作用。楊勝平等[18]對不同培養(yǎng)溫度下S.putrefaciens DSM6067 差異蛋白質(zhì)組學(xué)進行了分析，發(fā)現(xiàn)溫度越低，S.putrefaciens 細胞膜脂肪酸代謝相關(guān)酶的表達量越高。在細菌中，大多數(shù)脂肪酸都可以酯化成脂質(zhì)，如磷脂（phospholipid，PL）和糖脂（glycolipid，GL）等[19]，而且在低溫脅迫下，脂質(zhì)構(gòu)成變化對細菌生存的重要性也是普遍性認同的[20-21]。通過對S.putrefaciens 脂肪酸代謝基因的研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件可以調(diào)控脂肪酸代謝產(chǎn)物和代謝酶的表達，例如，與脂肪酸代謝相關(guān)的fabF 和fabD 可以促進?；D(zhuǎn)移到?；d體蛋白上。質(zhì)膜長鏈不飽和脂肪酸的減少會影響細胞膜流動性、通透性和物質(zhì)交換速率[22]，因此與長鏈脂肪酸拮抗的脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因fadR 出現(xiàn)顯著性上調(diào)，其拮抗機制是由于環(huán)境中存在14 個碳以上的長鏈脂肪酸，它們被降解成?；o酶A 并結(jié)合到fadR上，導(dǎo)致fadR 從fad 基因簇上釋放并解除對fad 基因簇的轉(zhuǎn)錄抑制，促進長鏈脂肪酸降解[23]，維持質(zhì)膜流動性等功能。

與S.putrefaciens 在低溫下保持其穩(wěn)定存活和繁殖相關(guān)的重要因素是脂肪酸合成相關(guān)的諸多基因出現(xiàn)上調(diào)，這與脂肪酸降解相關(guān)基因的下調(diào)相反。在脂肪酸生物合成中，乙酰CoA 通過碳碳縮合、還原、脫水和還原的循環(huán)反應(yīng)來產(chǎn)生長鏈脂肪酸，細菌的這些反應(yīng)是通過II 型合成酶催化，反應(yīng)的中間體以小的?；d體帶白的硫酯形式存在于胞內(nèi)，而鏈的延長是通過多種3-酮脂酰-ACP 合成酶將酰基CoA 或?；?ACP與丙二酰-ACP 縮合形成。脂肪酸合成相關(guān)基因上調(diào)說明細胞膜中脂質(zhì)組成變化對于細菌在低溫脅迫下存活具有重要作用，聯(lián)合脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果可表明S.putrefaciens 脂質(zhì)代謝的變化可以更好地適應(yīng)低溫的環(huán)境。

除了脂質(zhì)代謝，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)、蛋白組學(xué)的聯(lián)合分析結(jié)果表明，與糖酵解/糖異生相關(guān)的乙醇脫氫酶adhE 和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶SPUTCN32_RS18530、與三羧酸循環(huán)/氧化磷酸化相關(guān)的琥珀酸脫氫酶SPUTCN32_RS01815 和細胞色素c SPUTCN32_RS17000 等能量代謝相關(guān)基因的差異表達對于細胞在低溫下保持正常代謝、從環(huán)境中獲取能源物質(zhì)以及維持正常增殖有著不可或缺的功能。葡萄糖作為微生物主要的碳源物質(zhì)能夠被優(yōu)先利用，當胞外葡萄糖被攝取進入胞內(nèi)后，首先通過糖酵解途徑形成6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸等產(chǎn)物，中間過程產(chǎn)生大量的腺苷三磷酸和NADH 等能源物質(zhì)，產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和CO2，隨后乙醛在ADH I 和NADH 的作用下轉(zhuǎn)化為乙醇和NAD+，經(jīng)糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA 后進入三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化進一步被氧化為細胞供能。糖異生涉及葡萄糖-6-磷酸酶、丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶等關(guān)鍵酶的催化，促進菌體降解乳酸、協(xié)調(diào)氨基酸代謝、維持菌體正常代謝[24-25]。因此，這些與能量代謝相關(guān)的基因差異性表達對于S.putrefaciens 在低溫下能量的產(chǎn)生和繁殖具有不可忽視的作用。

4 結(jié)論

本文深入探究了S.putrefaciens 在低溫下脂肪酸代謝和能量代謝通路關(guān)鍵基因的差異性變化，確定了S.putrefaciens 在低溫下代謝水平的改變，4 ℃和30 ℃培養(yǎng)的S.putrefaciens 脂肪酸生物合成和代謝、三羧酸循環(huán)、能量代謝等相關(guān)的部分基因出現(xiàn)顯著性差異，在4 ℃下與脂肪酸降解的相關(guān)基因出現(xiàn)下調(diào)，而與脂肪酸合成的相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)，這能夠促使S.putrefaciens 在低溫下維持一定的細胞膜脂質(zhì)成分，進而維持其流動性和物質(zhì)交換；在4 ℃下S.putrefaciens 能量代謝過程的關(guān)鍵基因表達上調(diào)，這能夠為菌體抵抗低溫環(huán)境和維持正常的生理代謝提供更多的能量，對于S.putrefaciens 維持低溫下的生理狀態(tài)和能量代謝具有重要作用。本文為研究S.putrefaciens 冷適應(yīng)機制和靶向抑制低溫S.putrefaciens 的繁殖提供了新的思路和靶點。