腌制芥菜細菌多樣性的分析及優(yōu)勢乳酸菌的篩選與鑒定

唐睿，鄧放明，趙艷玲，田艷

（1.新疆理工學院，新疆 阿克蘇 843100；2.湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南 長沙 410125）

腌制芥菜是我國傳統(tǒng)美食之一，新鮮芥菜的葉、莖和根均可作為發(fā)酵原料[1]，經(jīng)發(fā)酵加工制成的芥菜口感鮮爽脆嫩，具有增強腸胃消化、提高食欲的功能，深受大眾喜愛[2]，其中比較典型的加工產(chǎn)品有榨菜、酸菜、泡菜等[3]。芥菜在高鹽腌制過程中，其含有的硫代葡萄糖苷被水解，產(chǎn)生揮發(fā)性芥子油、硫酸氫鉀等物質(zhì)，使其具有獨特風味[4-5]。此外，腌制芥菜在一定程度上延長了產(chǎn)品的貨架期。

芥菜傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝比較簡單，將新鮮的芥菜切碎，適當烘干，添加適量的鹽和香料，隨后放入發(fā)酵罐進行發(fā)酵，使芥菜在復雜的環(huán)境下不斷發(fā)酵。由于各地區(qū)采用的原料品種和生產(chǎn)工藝不同，所以產(chǎn)品的口味、儲存周期等都具有一定的差異[6]。芥菜腌制過程中起主要作用的是鹽和微生物，在高鹽腌制的作用下，細胞內(nèi)的鹽濃度與細胞外的鹽濃度需要達到滲透壓平衡[7]，造成細胞水分流失，使芥菜組織緊密，從而達到延長產(chǎn)品保質(zhì)期的目的。細胞脫水會導致細胞破裂，芥菜細胞破裂后，其細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不斷流出，芥菜上的微生物可以利用這些物質(zhì)進行繁殖[8]。在一定的條件下，微生物會將原料中的大分子物質(zhì)降解為一些小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)可以使產(chǎn)品產(chǎn)生獨特的風味，還有益于身體健康。王一淇等[9]對湖南芥菜腌制發(fā)酵過程的研究表明，不管是在芥菜發(fā)酵的初始階段還是在后期，乳酸桿菌都是芥菜發(fā)酵中最為主要的優(yōu)勢菌。除此之外，泡菜在經(jīng)過發(fā)酵處理之后，可以產(chǎn)生大量的益生菌，使其表現(xiàn)出抗氧化特性[10]。

目前，對發(fā)酵芥菜的研究側(cè)重于減少發(fā)酵芥菜中含鹽量[11]、芥菜的品質(zhì)研究[12]、芥菜工藝的改良[13]、香氣成分探究[14]以及傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)[15]方面，而對于發(fā)酵芥菜中微生物多樣性的研究較少。隨著微生物探究技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的生物學領(lǐng)域出現(xiàn)了巨變，可以廣泛應用于多種組學中。如對大部分微生物類群進行精準識別，拓寬微生物研究范圍。除此之外，多樣性的測序方法還常被運用于探索環(huán)境微生物與人類微生物生態(tài)系統(tǒng)的多樣性分析中[16]，如今已逐漸演變?yōu)樵u析微生物多樣性的一種常用技術(shù)[17-19]。因此，采用高通量測序法測定16Sr DNA 中的V4 區(qū)域，從門、屬水平分析不同含鹽量的天然發(fā)酵芥菜的菌落組成和相對含量，確定腌制芥菜發(fā)酵后的優(yōu)勢菌，比較3 種不同發(fā)酵工藝和不同含鹽量的發(fā)酵芥菜的細菌菌落組成和相對含量的差異，并對優(yōu)勢乳酸菌進行分離鑒定，旨在探究不同發(fā)酵工藝和不同含鹽量的腌制芥菜對微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)帶來的影響，同時尋找適合直投式發(fā)酵芥菜且能工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢菌株，以期為芥菜發(fā)酵工藝生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌制芥菜：采集于湖南岳陽；乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA 抽提試劑盒：美國奧美嘉生物技術(shù)公司；西班牙瓊脂糖：北京艾普立邦科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒：美國愛思進公司；高保真DNA 聚合酶:北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

雷磁PHSJ-3F 型pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司；UV759 型紫外線可見分光光度計：深圳市三莉科技有限公司；illumina MiSeq 臺式DNA 測序儀：因美納科學器材有限公司；2720PCR 型擴增儀、NC2000 Nanodrop 型超微量分光光度計：賽默飛世爾科技有限公司；FLX800T 型酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；DYY-6C 型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；QL-901 型旋渦混合機：海門其林貝爾儀器制造公司；Quantus Fluorometer 型微量熒光計：普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；BJPX-400-II 型微生物恒溫培養(yǎng)箱：山東博科醫(yī)療器械有限公司；FastPrep-24 5G 型研磨儀：北京畢特博生物有限公司；5424R 型高速臺式冷凍離心機、N13462C 型移液器：艾本德國際貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集和預處理

將采集的3 種腌制芥菜進行編號：A 組為岳陽華容縣密封池腌制的芥菜，含鹽量16%；B 組為岳陽華容縣大壇腌制的芥菜，含鹽量10%；C 組為岳陽君山區(qū)發(fā)酵壇腌制的芥菜，含鹽量5%。在無菌環(huán)境下，將腌制芥菜剪碎處理成長寬約為0.5 cm 的樣品，分別放入塑封袋和凍存管中保存?zhèn)溆?，塑封袋置? ℃冷藏，凍存管于-80 ℃儲存。

1.3.2 基于16S rDNA 的V4 區(qū)的高通量測序分析腌制芥菜中的微生物組成

對3 組腌制芥菜樣本中的全部DNA 進行提取，隨后進行16S rDNA 在V4-V5 可變區(qū)的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增,再用正向引物對菌株16S rRNA 基因組完成PCR 擴增,其正、反向的引物序列為338F（5'-baRcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）、806r（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。將對檢測樣品中的特異的7-bp 條形碼融合在引物上,實現(xiàn)多重檢測。

1.3.3 統(tǒng)計分析

通過FASTP 程序和FLASH 軟件對原始測序序列進行質(zhì)量管理和拼接,對尾部平均質(zhì)量值小于或等于20 的堿基進行篩選和讀取，并建立門戶。一旦窗口的平均質(zhì)量值小于20，則截取其后端堿基，并過濾小于50 bp 的讀取片段，剔除含有N 個堿基的讀取片段；成對的片段拼接根據(jù)PE 閱讀片段間的重復情況而定，最少重復長度為10 bp 的序列；0.2 的拼接順序根據(jù)重疊范圍的最大程度規(guī)定錯配數(shù)，以便篩查出不合格的序列；區(qū)分樣本的排序序列則依據(jù)在順序開端和終點上的條形碼和引物來確定。

找出所需要的數(shù)據(jù)序列后根據(jù)優(yōu)化的序列進行常規(guī)研究，最后通過Uparse 程序，按照97%的相似率對相關(guān)數(shù)據(jù)進行聚類，從而研究數(shù)據(jù)的Alpha 多樣性。然后通過分類學對從門到屬的生物種類進行研究，從而獲取分類學資料，并從門和屬的層次上計算樣本的種群組成。

1.3.4 優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選

對腌制芥菜樣品取樣，進行梯度定量稀釋（10-2、10-3、10-4），從以上每個梯度的稀釋樣品中取1 mL 樣品稀釋液均勻涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑選單個菌落，在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，在MRS 固體培養(yǎng)基重復劃線3 次以上，直至油鏡下菌落形態(tài)一致，記錄其菌落形態(tài)，對已純化過的菌株進行過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色試驗，將過氧化氫酶陰性，而革蘭氏酶染色試驗陽性的菌株暫定標記為篩選出來的乳酸菌株并編號。

將細菌的產(chǎn)酸能力和耐鹽能力作為對細菌的主要篩選指標，篩選出優(yōu)良菌株。利用pH 計對發(fā)酵芥菜發(fā)酵液的pH 值進行檢測，每組樣品做3 次平行。耐鹽能力的測定：分別在鹽濃度為4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%的鹽水中加入新篩選出的單個菌種，在培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h 后，用紫外線可見分光光度計在波長600 nm 處測量菌體密度，并將每個樣品做3 次平行。對已篩選出的優(yōu)勢菌株開展生理生化試驗，具體方法參考文獻[20]。

1.3.5 優(yōu)良菌種的16S rDNA 鑒定

對初步篩選出來的優(yōu)勢菌株進行基因載體DNA提取，再進行16S rDNA 基因序列的PCR 擴增。利用正向引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和反向引物907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）進行擴增，對兩個擴增步驟完的序列進行1%瓊脂糖凝膠的毛細管電泳檢驗。使用DNA 測序儀對其進行最后提純，制出相應的PCR 標記產(chǎn)物來完成DNA 測序。將已測序菌株的16S rDNA 順序與NCBI 中的blast 相似的同源序列加以對比，可以確定帶有較高同源性的模型菌株中的16S rDNA 序列，并通過mega-6.0 程序繪制菌株種源關(guān)系發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌制芥菜樣本中的細菌群落高通量測序分析

2.1.1 基于OTUs 聚類

樣品OTUs 分布韋恩圖如圖1 所示。

圖1 3 個樣品OTUs 聚類Fig.1 OTUs of three samples

由圖1 可知，A、B 兩組腌制芥菜樣品的OUTs 數(shù)量明顯高于C 組，說明含鹽量較高的腌制芥菜的細菌數(shù)量比含鹽量較低的腌制芥菜的細菌數(shù)量要多；B 組樣品的OTUs 數(shù)量高于A 組，說明含鹽量適中的腌制芥菜樣品其細菌數(shù)量最多。A、B、C 3 組腌制芥菜樣品中高相似度的OTUs 有375 個，分別占A、B、C 3 組樣品OTUs 數(shù)量的37.39%、36.66%、44.17%，這些微生物對芥菜發(fā)酵益處較大，不同樣本之間細菌群落組成既存在差異又有相似性。

2.1.2 Alpha 多樣性分析

3 個樣品的多樣性指數(shù)見表1。

表1 多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indexes

由表1 可知，A、B、C 覆蓋率都大于0.99，說明腌制芥菜中幾乎所有細菌群落的類型都得到了覆蓋。A、B、C 3 組樣品的Chao 值分別為778.13、762.80、530.21，Chao 值越大其豐富度越高，由此可見，A 組樣品的細菌豐富度略大于B 組樣品，C 組樣品細菌豐富度最低；A、B、C 3 組樣品的Shannon 值分別為3.33、3.12、4.16，Shannon 值越高表明其多樣性越高，結(jié)果表明，細菌多樣性排序為C＞A＞B。

2.1.3 基于門水平的細菌群落多樣性分析

基于門水平的細菌構(gòu)成及其分析結(jié)果如圖2 所示。

圖2 基于門水平的相對含量Fig.2 Relative abundance of different phyla

由圖2 可知，在3 個發(fā)酵微生物組中的所有基于門水平上的菌落系統(tǒng)組成中，厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門是其中主要優(yōu)勢菌門，其余菌門的相對含量較少。在A 組中，相對含量較高的主要是厚壁菌門（62.94%）、放線菌門（18.15%）、變形菌門（12.37%）、擬桿菌門（3.83%），這4 個主要優(yōu)勢菌門相對含量共占細菌總量的97.29%；在B 組中，相對含量較高的是厚壁菌門（63.99%）、放線菌門（16.57%）、變形菌門（13.24%）、擬桿菌門（3.76%），這4 個優(yōu)勢菌門相對含量共占細菌總量的97.56%；在C 組中，相對含量較高的是變形菌門（45.61%）、擬桿菌門（29.37%）、厚壁菌門（16.67%）、放線菌門（5.36%），這4 個優(yōu)勢菌門相對含量共占細菌總數(shù)的97.01%，除此之外，C 組的蛭弧菌門占比也較高,相對含量為2.02%。

在門水平上，A、B 兩組樣品的細菌菌落組成相似，與C 組樣品的細菌菌落組成相差較大，厚壁菌門的菌落相對含量低于A、B 兩組，但變形菌門、擬桿菌門、蛭弧菌門的占比要遠遠高于其他兩組樣品。這可能是因為C 組樣品含鹽量較低，加鹽發(fā)酵后能存活的細菌種數(shù)較多，因此其細菌多樣性比A、B 組要高。

2.1.4 基于屬水平的細菌群落多樣性分析

基于屬水平的細菌構(gòu)成及其分析結(jié)果如圖3 所示。

圖3 基于屬水平的相對含量Fig.3Relative abundance of different genera

如圖3 所示，基于屬水平上菌落組成中3 組樣品的乳桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、不動桿菌屬、鹽單胞菌屬都是重要的優(yōu)勢菌種屬，但在含量構(gòu)成上存在顯著不同。在A 組中，占比相對較多的是乳桿菌屬（38.20%）、片球菌屬（16.94%）、棒桿菌屬（12.01%）、短桿菌屬（1.78%）、鹽單胞菌屬（1.78%）、考克氏菌屬（2.54%），占總量的73.25%。在B 組中，占比較多的種類主要乳桿菌屬（53.17%）、棒狀桿菌屬（6.72%）、短桿菌屬（3.89%）、不動桿菌屬（1.72%）、鹽單胞菌屬（2.02%）、考克氏菌屬（2.02%）、芽孢桿菌屬（2.16%），占總量的71.70%。在C 組中，占比較多的有不動桿菌屬（16.41%）、乳桿菌屬（10.41%）、類香味細菌屬（11.30%），占總量的38.12%，除此之外，占比較高的還有穩(wěn)桿菌屬（9.53%）、Fluviicola（4.65%）、叢毛單胞菌屬（4.3%）、短波單胞菌屬（3.35%）、寡養(yǎng)單胞菌屬（3.47%）、假單胞菌屬（2.48%）、氣單胞菌屬（2.11%）、嗜冷桿菌屬（2.17%）。

曾維友等[21]通過傳統(tǒng)分離培育的方法，對自然發(fā)酵樣品中的乳酸菌進行分離培育，并利用16S rDNA同源性序列分析篩選出了消化乳桿菌、植株乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、棒狀乳桿菌、有害片球菌，且植株乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌都是重要的優(yōu)勢菌種。肖甜甜等[22]利用高通量測序的方法對貴州苗家白酸湯樣本的微生物多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、醋酸桿菌屬。張奶英等[23]利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對葉用芥菜鹽漬發(fā)酵過程中的細菌多樣性進行了研究，并通過對獲得的網(wǎng)絡變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）圖譜進行解析，發(fā)現(xiàn)葉用鹽漬芥菜的優(yōu)勢菌屬為鹽單胞菌屬、嗜鹽乳酸菌屬、泡菜乳酸菌屬、色鹽桿菌屬。此結(jié)果表明，在發(fā)酵芥菜的過程中優(yōu)勢細菌種屬主要是乳酸桿菌屬，與本試驗結(jié)果相似，但在種水平上具有相當?shù)牟町悾a(chǎn)生這些差別的因素可能與發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵工藝、含鹽量以及原材料等因素有關(guān)。

在3 組腌制芥菜樣品中，含鹽量較低的C 組所含屬遠遠多于其他兩組。這是因為高鹽抑制了大多數(shù)細菌的生長，導致許多不耐鹽的細菌在發(fā)酵過程中無法生存，而剩余的細菌具有一定的耐鹽性，如A 組和B組的鹽單胞菌，它可以在絕對鹽度為0%～32%的條件下生長[24]。乳桿菌的相對含量最高，分別占C 組、A 組和B 組的10.41%、38.2%和53.17%。在高鹽的情況下控制其他菌群的繁殖，可以促進乳酸菌的繁殖。乳酸菌在大自然中廣泛分布，主要分布在植物和發(fā)酵產(chǎn)物的表面。乳酸菌是果蔬發(fā)酵的重要菌群，在水果發(fā)酵進程中通過乳酸發(fā)酵，使原料中的糖類分解成乳酸以及其他風味產(chǎn)物。A、B 和C 組樣品中棒狀桿菌相對含量較高，分別占12.01%、6.72%和1.64%，A 組相對含量最高，推測在含鹽量約10%的條件下，有利于棒狀桿菌下某些發(fā)酵細菌的生長。

2.2 腌制芥菜中優(yōu)良菌株的篩選

3 組樣品中又分別篩選出了9 株滿足革蘭氏菌染色鑒定呈陽性、過氧化氫酶試驗結(jié)果呈陰性、不含芽孢體的菌株并分別編號為Z-1～Z-9。觀察發(fā)現(xiàn)大部分的菌種多為棒型和短桿型，除此之外還有圓球形。通過測定菌株發(fā)酵液pH 值和不同含鹽量下的發(fā)酵液菌株的生長密度來篩選優(yōu)良菌種，結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 單菌株發(fā)酵48 h 的pH 值Fig.4 pH values of leaf mustard fermented with single strains for 48 h

圖5 單菌株在不同含鹽量發(fā)酵液中的菌體密度Fig.5 Cell density of single strains in fermentation broths with different salt content

由圖4 可知，Z-1 和Z-3 的pH 值過低，酸味過重對腌制芥菜的味道產(chǎn)生不良的影響，但Z-2、Z-4、Z-6、Z-7、Z-9 的pH 值均在3.7 左右。由圖5 可知，Z-1、Z-2、Z-5、Z-6、Z-9 在低鹽濃度的芥菜發(fā)酵液中的分子間密度的OD 值較高，而Z-1、Z-5 隨著鹽濃度的提高菌體密度OD 值急劇下降，而Z-2、Z-6、Z-9 菌株在較高鹽濃度的發(fā)酵液中存活密度仍高于其他菌株，表明這3 株菌能在芥菜發(fā)酵過程中良好地存活，具有較強的耐鹽能力。綜上所述，篩選出的3 株產(chǎn)酸能力強且耐鹽度高的菌株為Z-2、Z-6、Z-9，接下來對篩選出的優(yōu)勢菌進行進一步的鑒定。

2.3 菌株的生理生化試驗結(jié)果分析

3 株產(chǎn)酸能力強且耐鹽度高的菌種同時進行生理與生化試驗，結(jié)果見表2。

表2 菌株生理生化試驗Table 2 Physiological and biochemical tests of strains

由表2 可知，3 株細菌均不產(chǎn)生硫化氫和吲哚類，接觸酶測定為陰性，硝酸鹽測定為陽性，但有一定的耐酸性。

2.4 菌株的16S rDNA 鑒定

篩選得到的3 株乳酸菌Z-2、Z-6、Z-9 的16S rDNA 序列長度分別為1448、1438、1450 bp，Z-2 株菌與的16S rDNA 與庫中的戊型乳桿菌菌株相似度均在99%以上，Z-6 株菌的16S rDNA 與庫中的植物乳桿菌菌株相似度均在99%以上，Z-9 株菌的16S rDNA 與庫中的希臘魏氏菌菌株相似度均在99%以上?；?6S rDNA 基因序列，3 株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6。

圖6 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strains

由圖6 可知，Z-2 的親緣性與NR 029133.1 Lactobacillus pentosus strain 最接近，Z-6 的親緣性與NR 115605.1 Lactobacillus plantarum strain 最接近，Z9 的親緣性與NR 136437.1 Weissella bombi strain 最接近，經(jīng)過采用傳統(tǒng)菌種鑒定檢測方法、生理及生化綜合試驗方法結(jié)合現(xiàn)代分子生物學篩選方法分析可以準確得出經(jīng)過篩選純化的3 株菌體分別是為戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、希臘魏氏菌。

3 結(jié)論

利用高通量測序分析技術(shù)分別對不同發(fā)酵工藝和食鹽用量的3 組發(fā)酵芥菜中產(chǎn)生的細菌在16S rDNA 的V4-V5 區(qū)進行測序與分析，發(fā)現(xiàn)不同腌制工藝和不同食鹽用量的發(fā)酵芥菜中細菌結(jié)構(gòu)組成具有一定的差異性。通過OTUs 聚類分析，A、B 兩組腌制芥菜樣品的OUTs 數(shù)量明顯高于C 組，且A、B 兩組的細菌豐富度也高于C 組，但C 組的多樣性高于A、B 兩組。結(jié)果表明3 組發(fā)酵芥菜在細菌門類組成上屬于主要的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門；優(yōu)勢菌群屬又劃分為乳桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、不動桿菌屬、鹽單胞菌屬，其中，A、B 兩組樣品的細菌菌落組成相似，與C 組樣品的細菌菌落組成相差較大。這可能是因為高鹽抑制了大部分菌的生長，導致許多不耐鹽的菌在發(fā)酵過程中無法存活，而在含鹽量較低的C 組中存在的細菌種數(shù)更多，在含鹽量到達10%以上鹽漬芥菜所存在的菌群基本都是耐鹽的細菌，其細菌多樣性和豐富度基本相似，而較高的含鹽量使芥菜的細胞壁受損，流出更多的營養(yǎng)物質(zhì)，因而A、B 組的細菌豐富度偏高，同時加工工藝的不同也會造成腌制芥菜菌群結(jié)構(gòu)的差異。

為尋找適合腌制芥菜直投式發(fā)酵的乳酸菌，根據(jù)產(chǎn)酸能力和耐鹽性篩選出3 株乳酸菌。通過菌落形態(tài)觀察、生理生化試驗和16S rDNA 鑒定出3 株優(yōu)勢菌株分別為戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus strain）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum strain）和希臘魏氏菌（Weissella hellenica strain），為乳酸菌在發(fā)酵芥菜的工藝生產(chǎn)提供新的理論依據(jù)。