伏牛山區(qū)六妹羊肚菌揮發(fā)性呈香物質(zhì)分析

劉娜娜，程曉，潘珍珍，楊曉冰，3，李秀紅*

（1.三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 三門峽 472000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.河南科技大學(xué)應(yīng)用工程學(xué)院，河南 三門峽 472000）

羊肚菌（Morchella esculenta）是一種真菌，又稱羊肚菜、羊蘑等，因其形狀類似羊肚而得名，是名貴食材“草八珍”之一，富有“素中之葷”的美稱，羊肚菌生長分布遍布世界各地，因產(chǎn)量較少而愈顯珍貴。羊肚菌的食用歷史悠久，具有化痰理氣、補腦提神、潤胃健脾、補腎強身等功效?，F(xiàn)代研究表明，羊肚菌含有多種氨基酸、脂肪酸、多糖和核苷酸等營養(yǎng)物質(zhì)為人體所需，具有增強免疫力、抗腫瘤、抗疲勞以及抗氧化等功效[1-2]，研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌中生物活性物質(zhì)具有抗炎、降血糖、預(yù)防動脈粥樣硬化等生理功效[3]。羊肚菌除了具有較高的營養(yǎng)價值，同時還擁有獨特的風(fēng)味，經(jīng)過熬制后的羊肚菌湯色澤良好，味道鮮美[4]。通過炒醬和熬制等加工工藝，可將羊肚菌與其它食材進行合理配比制成風(fēng)味食品，如羊肚菌牛肉醬，羊肚菌豬骨湯等，有利于更大程度發(fā)揮羊肚菌的子實體風(fēng)味價值。

通常食用菌風(fēng)味由香味和滋味組成，分別作用于嗅覺和味覺器官，食用菌的香味來源于酸類、醛類、酮類、酯類等揮發(fā)性物質(zhì)，因這些物質(zhì)易于揮發(fā)到空氣中，進而引起嗅覺反應(yīng)，另一些非揮發(fā)性滋味物質(zhì)，主要成分包括呈味氨基酸、可溶性糖、糖醇、5'-核苷酸、有機酸等，可引起舌頭的味覺反應(yīng)[5-6]。有文獻報道我國川藏地區(qū)與長白山地區(qū)所產(chǎn)羊肚菌的揮發(fā)性和非揮發(fā)性呈味物質(zhì)的組成，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)羊肚菌的呈味物質(zhì)有所不同，研究表明氣相-離子遷移譜檢測技術(shù)對羊肚菌的風(fēng)味化合物分析可區(qū)分羊肚菌的不同產(chǎn)地[7-9]。為了分析我國中原地區(qū)羊肚菌的風(fēng)味組成，本試驗選取產(chǎn)自秦嶺北麓河南三門峽伏牛山地區(qū)的六妹羊肚菌品種為試驗材料，通過多種頂空吸附萃取條件對羊肚菌的揮發(fā)性成分進行收集，再進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，以明確本地區(qū)羊肚菌的揮發(fā)性呈香物質(zhì)組分，為該地區(qū)六妹羊肚菌的功能性食品藥品開發(fā)與產(chǎn)業(yè)的精深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六妹羊肚菌：三門峽九龍山農(nóng)業(yè)科技有限公司。將羊肚菌干品粉碎處理，過40、100、200 目篩，-20 ℃保存。

3-壬酮：武漢浩榮生物科技有限公司；氯化鈉、濃硫酸：西隴科學(xué)股份有限公司；葡萄糖、無水乙醇、無水乙醚：天津永大化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸、苯酚：成都科隆化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

SZ-TR320 型消解爐：德國默克公司；KL-SWCK6型馬弗爐：鶴壁科力測控技術(shù)有限公司；KjeltecTM 8400 型全自動凱氏定氮儀：丹麥福斯集團公司；ISQ&TRACEISQ 型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；DP-D501 型冷凍干燥機：深圳德普儀器有限公司；AUY200 型分析天平：上海精密儀器儀表有限公司；GFL-230 型烘箱：天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；HC-3018 型高速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌基本成分鑒定

水分含量測定：參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》中直接干燥法。

粗脂肪含量測定：參考GB5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》中酸水解法。

灰分含量測定：參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》中灰分測定法。

蛋白質(zhì)測定：取樣品0.2 g 于消化管中，再加入3 g催化劑（硫酸銅∶硫酸鉀=1∶9，質(zhì)量比）和5 mL 硫酸后，于消解爐進行消化。當(dāng)溫度達(dá)到420 ℃后，繼續(xù)消化3 h，使其自然冷卻至室溫，將消化管取出，隨后在全自動凱氏定氮儀上測定。

粗多糖測定：采用苯酚-濃硫酸法，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將10 mg 葡萄糖溶解并定容于100 mL 容量瓶（葡萄糖濃度0.1 g/L），取試管6 支，分別裝入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖溶液，補充蒸餾水至2.0 mL，然后各試管再分別加入1 mL 5%苯酚、5 mL 濃硫酸，將試管置于沸水浴中處理15 min 后，取出試管，水浴降溫至室溫，在490 nm 下測定樣品吸光值。采用Origin 回歸分析，得到線性回歸方程，并繪制方程曲線，橫坐標(biāo)為多糖濃度X（μg/mL），縱坐標(biāo)為吸光值Y，即得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.005 2X-0.004 1，R2=0.998 7。

稱取1 g 羊肚菌粉，按料液比1∶51（g/mL）混合，水浴恒溫46 ℃提取，提取時間3.5 h，4 000 r/min 離心10 min，得到上清提取液，將提取液于100 mL 容量瓶定容得樣品液。樣品液取0.1 mL 放入試管，處理方法與標(biāo)準(zhǔn)液相同，獲得處理液在490 nm 處的吸光值后，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出多糖濃度，帶入公式（1），經(jīng)計算即可獲得羊肚菌中粗多糖的含量。

式中：W 為多糖含量，%；C 為多糖濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2 揮發(fā)性呈味物質(zhì)測定

參考殷朝敏等[10]的方法稍作修改，試驗通過選取多種萃取條件，以達(dá)到充分獲取揮發(fā)性物質(zhì)的目標(biāo)。羊肚菌子實體經(jīng)破碎為不同粒度（40、100、200目），分別稱取不同粒度羊肚菌干粉樣品1.5 g 置于40 mL 采樣瓶中，加蒸餾水10 mL、NaCl 1.5 g，再加入32.64 μg/mL 3-壬酮10 μL 作為內(nèi)標(biāo)。樣品混勻，使用聚四氟乙烯隔熱墊密封瓶口，在試驗設(shè)置的溫度下（50、60、70 ℃）分別采用磁力攪拌平衡10 min，再用預(yù)先老化好的萃取頭頂空吸附，吸附完成后，將萃取頭置于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進樣口解吸，解吸溫度250 ℃，時間2.5 min，然后進行GC-MS 分析。

GC 條件：色譜柱為Innowax 極性毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序中初始溫度40 ℃，保持2 min；升溫速度3 ℃/min，升至180 ℃時保持2 min，然后升溫速度為10 ℃/min，升至260 ℃保持1 min；載氣為高純度氦氣，氣體流速為1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃，不分流。

MS 條件：使用電子電離源；電子能量為70 eV，電壓350 V，質(zhì)量掃描范圍50～450 m/z；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃。

1.2.3 關(guān)鍵風(fēng)味化合物評定

采用相對氣味活度值（relative odor activity value,ROAV）評定羊肚菌樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，參考劉登勇等[11]的方法，首先計算各揮發(fā)性組分的氣味活度值（odor activity value，OAV），確定對香氣貢獻最大的組分，其公式如下。

式中：O 為各揮發(fā)組分的氣味活度值，%；C 為風(fēng)味物質(zhì)的含量，μg/kg；T 為該物質(zhì)的嗅覺閾值，μg/kg。

根據(jù)OAV 結(jié)果，值最大的定義對香氣貢獻最大，該物質(zhì)組分相對氣味活度值為100，其它風(fēng)味物質(zhì)按下列公式計算相對氣味活度值。

式中：Ri代表各組分ROAV；Oi和Omax分別為各化合物組分的OAV；Ci為各組分的含量，μg/kg；Ti為各組分的感覺閾值，μg/kg。

樣品中某種風(fēng)味物質(zhì)ROAV 越大，那么在總體風(fēng)味該物質(zhì)的貢獻也越大。一般認(rèn)為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)為1≤ROAV≤100 的組分。此外，對總體風(fēng)味具有重要修飾作用的物質(zhì)為0.1≤ROAV＜1.0 的組分。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

儀器檢索系統(tǒng)利用標(biāo)準(zhǔn)譜庫對GC-MS 總離子流圖的各峰進行比對分析，以對比度90%為基準(zhǔn)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖和保留時間來確認(rèn)各揮發(fā)性化合物的種類和總量。數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析使用Microsoft Excel 2007進行，柱形圖的繪制使用GraphPad Prism 9 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌常規(guī)組分分析

羊肚菌常規(guī)組分含量如表1 所示。

表1 羊肚菌（干品）常規(guī)組分含量Table 1 Basic nutrients in Morchella sextelata（dried）

從表1 可以看出，羊肚菌的蛋白質(zhì)含量較高，為36.33%，粗多糖和粗脂肪含量較低，粗脂肪含量僅有1.34%。

2.2 萃取結(jié)果分析

不同萃取條件下有效峰面積占比見表2。

表2 不同萃取條件下有效峰面積占比Table 2 Ratio of effective peak area under different extraction conditions

由表2 可知，鑒定出揮發(fā)性物質(zhì)最多的條件為100 目60 ℃40 min 和100 目50 ℃60 min，均鑒定出43 種物質(zhì)。相同溫度、相同萃取時間下，樣品破碎至40目萃取富集揮發(fā)物的效果較差，鑒定出的物質(zhì)種類和含量較少，樣品粉碎目數(shù)越高，萃取獲得的揮發(fā)物含量越高。在100 目粉碎條件下，萃取溫度60 ℃，萃取40 min 或60 min 的有效峰面積差異不大，在40 min 時已基本完成對有效物質(zhì)的采樣、富集，但隨著時間的延長，總峰面積稍有增加，但同時也使雜質(zhì)被萃取的可能性增加。在100 目粉碎條件下，萃取相同時間，隨著萃取溫度的變化有效峰面積也隨之變化，50 ℃和60 ℃的有效峰面積差異較小。由于高溫能夠促使一些化合物降解，進而產(chǎn)生小分子揮發(fā)物，試驗中以70 ℃條件下的有效峰面積最大，推測70 ℃條件下有部分高分子物質(zhì)分解，但高溫條件下的數(shù)據(jù)有助于分析烹飪條件下的揮發(fā)性物質(zhì)組成。

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)組分分析

不同萃取條件下羊肚菌干品揮發(fā)性成分的組成和含量見表3。各類組分總量統(tǒng)計圖見圖1。

圖1 揮發(fā)性物質(zhì)組分與含量統(tǒng)計圖Fig.1 Content of volatile components

表3 不同萃取條件下羊肚菌干品揮發(fā)性成分組成及含量Table 3 Content of volatile components of dried Morchella sextelata extracted under different conditions

由表3 可知，試驗總共鑒定出的62 種化合物，包括18 種醛類、12 種醇類、2 種酸類、4 種酯類、8 種酮類、1 種烯烴類、11 種烷烴類、2 種炔類、3 種芳香烴類、1 種呋喃類，并經(jīng)過色譜軟件的計算獲得了相應(yīng)化合物的精確含量。經(jīng)統(tǒng)計分析，圖1 顯示出揮發(fā)性化合物中含量較多的化合物主要是醛類化合物與烷烴類化合物。由表3 可知，在100 目60 ℃40 min 的萃取條件下，烷烴類與醛類化合物總含量均達(dá)到5 000 μg/kg，揮發(fā)性化合物中1，3-二溴丙烷含量最多，含量為6 954.59 μg/kg。在幾種萃取方案中，烷烴類、醛類均為揮發(fā)性化合物的主要組分，且以1，3-二溴丙烷含量最多。綜合色譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1，3-二溴丙烷在羊肚菌干品分離的保留時間為31.00 min 左右，含量在4207.86～8304.31 μg/kg 之間。1，3-二溴丙烷是重要的揮發(fā)性成分之一，由于該物質(zhì)無嗅而口感略帶甜味，因此對嗅覺風(fēng)味沒有明顯影響。此外在本試驗條件下，鑒定出了幾種含量較高且對羊肚菌風(fēng)味有潛在影響的化合物，如正己醛、正壬醛、癸醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇、正己醇、正己酸、2-壬酮、香葉基丙酮、1-溴-3-氯丙烷等，這些化合物對風(fēng)味的貢獻本試驗采用相對氣味活度值進行了評價。

2.4 關(guān)鍵風(fēng)味化合物評定

根據(jù)試驗方法中的計算公式，本試驗統(tǒng)計和分析了羊肚菌中所有揮發(fā)性化合物的相對氣味活度值，具有風(fēng)味影響的揮發(fā)性化合物見表4。

表4 羊肚菌中ROAV＞0.1 的揮發(fā)性物質(zhì)及其氣味特征Table 4 Odor characteristics of M.sextelata volatile substances with ROAV＞0.1

由表4 可知，羊肚菌（干制品）中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物有14 種，分別為2-甲基丁醛、異戊醛、正己醛、正壬醛、E-2-辛烯醛、癸醛、苯乙醛、椰子醛、反-2-壬烯醛、正己醇、1-辛烯-3-醇、正己酸、2-壬酮、香葉基丙酮。其中ROAV 最大的化合物為癸醛，其次為反-2-壬烯醛、香葉基丙酮、正己醇。癸醛的風(fēng)味在稀釋時有甜橙和橘子香氣，并帶有油脂氣息，其成分天然存在于柑橘、檸檬、園柚、西紅柿、草莓中[12]，本試驗不同萃取條件下的樣品中癸醛的含量均較高（612.78～1 134.45 μg/kg）。反-2-壬烯醛帶有一些黃瓜味和柑橘味，因其氣味閾值很低而在本試驗中呈現(xiàn)較高的ROAV。香葉基丙酮具有新鮮、清、淡的花香香氣，而正己醇具有特殊香味。此外，對總體風(fēng)味具有重要修飾作用的風(fēng)味物質(zhì)主要有2-庚烯醛、甲基壬基甲酮、2-戊基呋喃。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于羊肚菌中的常規(guī)組分含量，試驗對六妹羊肚菌基本組分的分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)含量達(dá)36.33%，是名副其實的高蛋白食品。一些食用菌的研究表明，真菌類食品中普遍含有較高的蛋白質(zhì)，文獻報道的幾種食用真菌蛋白質(zhì)含量，如香菇（21.90%）、金針菇（18.30%）、茶樹菇（26.07%）、黑木耳（11.20%）[13]、順昌菌草竹蓀（24.01%）、竹屑竹蓀（19.47%）[14]、雞杉（24.2%）、松靈芝（26.6%）、冬蟲夏草（29.1%）等[15]，相比之下，本試驗羊肚菌的蛋白質(zhì)含量屬于真菌食品中較高的一類。另外本試驗中所測定羊肚菌的粗脂肪、粗多糖含量僅有1.34%、6.93%，屬于低脂低糖食品。

食用菌中的嗅覺致香物質(zhì)即風(fēng)味因子來自于主體揮發(fā)性香氣成分，是食用菌的決定性風(fēng)味因子。不同生態(tài)環(huán)境造成的生物代謝差異可導(dǎo)致食用菌的風(fēng)味因子不同，例如同一品種羊肚菌，來自川西高原的含有二十烷，來自成都平原的含有1-辛烯-3-醇，而丘陵地區(qū)樣品含二硫化合物等[16]。長白山、林芝羊肚菌風(fēng)味化合物特征峰與青川、香格里拉產(chǎn)地的羊肚菌差異較大[7]。本試驗的羊肚菌樣品來自華北平原西部的秦嶺北麓（三門峽市伏牛山區(qū)），樣品中也檢測出與成都平原羊肚菌樣品相同的1-辛烯-3-醇是關(guān)鍵風(fēng)味化合物成分之一。

羊肚菌的揮發(fā)性物質(zhì)會在不同的烹制條件下逐步揮發(fā)出來，付瑞青等[17]對羊肚菌在煮制過程中共收集到49 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，一些風(fēng)味物質(zhì)在煮制的不同時間出現(xiàn)?？紤]到在不同的溫度條件下，食用蕈揮發(fā)出的香氣成分會受到影響并發(fā)生變化[18]，因此本試驗嘗試通過改變的條件參數(shù)，盡可能完全地把同一種羊肚菌中所存在的揮發(fā)性呈味物質(zhì)全部檢測出來，結(jié)果顯示本試驗共鑒定出62 種揮發(fā)性物質(zhì)，單一條件下獲得羊肚菌揮發(fā)性物質(zhì)最多達(dá)到43 種。

李翔等[8]在野生和人工栽培羊肚菌菌蓋干品中，共檢測出42 種揮發(fā)性成分，其中野生品種中以正己醛（17.99%）含量最高，人工栽培羊肚菌中以甲酸己酯（7.86%）含量最高。謝麗源等[19]對栽培品種川羊肚菌的分析發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性物質(zhì)主要包括7 類，以醛類化合物比例最高，其次是酯、醇、烴化合物、含硫化合物等，并有少量酮、呋喃。本試驗獲得的GC-MS 圖譜中，鑒定出的風(fēng)味化合物以醛類總含量最高，其次還有醇類、酸類、酯類、酮類和烴類。揮發(fā)性化合物對風(fēng)味組成的貢獻是由該揮發(fā)性物質(zhì)的含量和氣味閾值共同決定，所以相對含量高的揮發(fā)性化合物不一定是對香氣貢獻大的化合物。如本試驗中揮發(fā)性物質(zhì)以1，3-二溴丙烷的含量最高，但此物質(zhì)在羊肚菌風(fēng)味中的貢獻在于味覺。研究表明食用菌鮮味主要來源于氨基酸類鮮味物質(zhì)和呈味核苷酸，例如蘑菇的鮮味一部分來自5'-核苷酸，當(dāng)蘑菇與其他食材一起烹飪，5'-核苷酸不僅提供鮮味來源，還對其他食材的甜味、肉味有增效作用，同時抑制食材中的不愉快味道如咸、酸、苦味等[20]。因此對于羊肚菌的風(fēng)味分析，除了揮發(fā)性香味物質(zhì)，其入口滋味的組成也值得進一步研究。

本試驗以羊肚菌為研究對象，通過測定羊肚菌基本物質(zhì)組分含量，結(jié)果顯示羊肚菌具有富含蛋白質(zhì)、低脂肪、低糖的特點。通過不同前處理結(jié)合頂空固相微萃取，對羊肚菌的揮發(fā)物成分進行收集，再使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對收集到的羊肚菌揮發(fā)性物質(zhì)進行分析，共鑒定出62 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括18 種醛類、12 種醇類、2 種酸類、4 種酯類、8 種酮類、1 種烯烴類、11 種烷烴類、2 種炔類、3 種芳香烴類和1 種呋喃類。經(jīng)ROAV 評價方法分析，認(rèn)為試驗羊肚菌的關(guān)鍵風(fēng)味化合物有14 種，貢獻最大的是癸醛，有甜橙和橘子香氣，其次是反-2-壬烯醛、香葉基丙酮、正己醇，具有修飾作用的化合物有3 種。

羊肚菌的開發(fā)與利用離不開對羊肚菌的基礎(chǔ)研究，探究羊肚菌香氣和滋味的關(guān)鍵組成，有助于發(fā)掘羊肚菌風(fēng)味的形成機理，進而對羊肚菌關(guān)鍵組分的提取與利用提供基礎(chǔ)，促進羊肚菌的產(chǎn)品深加工，形成羊肚菌特有的風(fēng)味產(chǎn)品。本試驗解析了羊肚菌風(fēng)味特征中的呈香化合物，有助于理解羊肚菌的風(fēng)味特點，對羊肚菌的深加工、羊肚菌的定向種植有一定的理論指導(dǎo)意義。