超聲輔助提取日本莢蒾果實(shí)總?cè)乒に噧?yōu)化及其抗氧化活性

常超，蔡海鶯，，陳瑞達(dá)，劉暢，趙敏潔，孫蓉，陳獻(xiàn)志

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.臨海市林業(yè)技術(shù)推廣和場(chǎng)圃旅游服務(wù)總站，浙江 臺(tái)州 317000）

日本莢蒾（Viburnum japonicum）是一種忍冬科、莢蒾屬植物，大多是落葉灌木或小喬木，白色花，紅色果實(shí)，果實(shí)形狀多為橢圓形或近圓形[1]。國(guó)內(nèi)零星分布在浙江臺(tái)州、舟山等地，屬于瀕危植物屬[2]。日本莢蒾較耐寒，偏好有機(jī)質(zhì)豐富的土壤，適合生長(zhǎng)在陽(yáng)光充足、低海拔的地區(qū)[1]。莢蒾屬植物含二萜、三萜、黃酮、環(huán)烯醚萜等多種化學(xué)成分，不同化學(xué)成分的功能特性不同，已有較多研究表明莢蒾屬植物具有多種藥理作用，如抗腫瘤作用[3-4]、抗氧化作用[5]、降血糖[6]、殺蟲(chóng)和抗菌作用等[7]，具有較高的藥用價(jià)值[8]。此外，莢蒾果實(shí)鮮紅光亮，具有觀賞價(jià)值，還可用于泡酒[9]。

莢蒾屬植物中存在大量的抗腫瘤活性成分三萜類(lèi)化合物[10]，主要為五環(huán)三萜[11]。從日本莢蒾中提取三萜類(lèi)化合物的研究相對(duì)較少，胡疆等[9]從日本莢蒾中分離出5 種新的三萜類(lèi)物質(zhì)。從植物中提取非揮發(fā)性化合物的傳統(tǒng)方法有微波法輔助提取、回流法提取[7]、超聲法輔助提取、沉淀吸附法、有機(jī)溶劑萃取法、索氏提取法等[11-13]。但相關(guān)研究表明，浸提法、索氏提取法與其他方法相比較所需時(shí)間更長(zhǎng)，提取效率更低[14-15]，超高頻電磁波提取法溫度改變較明顯，對(duì)提取物的生物活性有一定影響[16]，其他方法如萃取法和超高壓提取法等不僅對(duì)儀器設(shè)備具有較高要求，而且消耗的成本也相對(duì)更高[17]，相比較之下超聲波輔助法提取三萜類(lèi)物質(zhì)，所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單易得、儀器和試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單易操作且用時(shí)較短，提取效率較高[18]。因此，本研究選用超聲波輔助法提取日本莢蒾果實(shí)中三萜化合物，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法確定最佳參數(shù)，以?xún)?yōu)化日本莢蒾果實(shí)中總?cè)频奶崛」に?，并以提取物研究其抗氧化活性[19-20]，為日本莢蒾原料的合理開(kāi)發(fā)提供更多的研究方向，更大程度發(fā)揮日本莢蒾的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

日本莢蒾果：臨海市林業(yè)技術(shù)推廣和場(chǎng)圃旅游服務(wù)總站。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、香草醛、高氯酸、抗壞血酸（VC）、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-biphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-l 聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-diazobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇：成都市科隆化學(xué)品有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)所用儀器設(shè)備見(jiàn)表1。

表1 儀器與設(shè)備Table 1 Instrumentation and equipments

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

樣品剔除次果和壞果后，在50 ℃恒溫干燥箱中干燥至質(zhì)量不變，粉碎過(guò)40 目篩，收集粉末置于4 ℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熊果酸三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

標(biāo)曲的制定參照景炳年等[21]的方法并稍加改動(dòng)。首先，準(zhǔn)確稱(chēng)取4.0 mg 干燥恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，放入10 mL 棕色容量瓶中，采用甲醇定容并搖勻，得到0.4 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。向6 個(gè)10 mL 容量瓶中分別精確吸取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，并將容量瓶置于60 ℃水浴鍋中，揮干甲醇溶劑，加入1 mL 高氯酸和0.4 mL 質(zhì)量濃度為5 g/100 mL 的香草醛－冰醋酸溶液[22]。將混勻后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于60 ℃水浴鍋中水浴30 min 后，冷卻至室溫，用冰醋酸定容到10 mL。向96 孔微孔板中吸取各容量瓶中配制好的溶液100 μL，使用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)品溶液在550 nm 處的吸光度。每個(gè)樣品濃度做3 組平行。橫坐標(biāo)x 為熊果酸質(zhì)量，縱坐標(biāo)y 為OD 值，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.396 3x+0.081 2，R2=0.999。

1.3.3 莢蒾總?cè)频奶崛?/p>

精確稱(chēng)取干燥至恒重的莢蒾粉末0.1 g 于離心管中，根據(jù)樣品和溶劑的比例加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，置于離心管中，按照不同的超聲溫度和超聲時(shí)間進(jìn)行總?cè)频奶崛23]，超聲完成后2 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。

1.3.4 莢蒾總?cè)坪考暗寐实臏y(cè)定

將不同條件下提取的莢蒾樣品溶液2 000 r/min離心5 min，精確吸取上清液0.2 mL，將其放入10 mL容量瓶中，60 ℃水浴揮干溶劑，后續(xù)操作步驟按照1.3.2進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算提取物中的總?cè)瀑|(zhì)量濃度，并計(jì)算出不同條件下總?cè)频奶崛÷?，?jì)算公式如下[21]。

式中：X 為總?cè)瀑|(zhì)量濃度，mg/mL；A 為吸光度；Y 為總?cè)频寐剩?；m 為粉末質(zhì)量，g；n 為稀釋倍數(shù)。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

考察乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）、料液比[1∶7.5、1∶10.0、1∶12.5、1∶15.0、1∶20.0（g/mL）]、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時(shí)間（20、40、60、80、100 min）對(duì)總?cè)频寐实挠绊憽?/p>

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，遵循響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)的設(shè)計(jì)要求[24]，以乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為影響因素，以日本莢蒾中總?cè)频寐首鳛轫憫?yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，因素水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 2 Factors and levels of the response surface design

1.3.7 日本莢蒾中總?cè)铺崛∥锟寡趸芰y(cè)定

1.3.7.1 日本莢蒾中總?cè)茖?duì)DPPH 自由基清除能力測(cè)定

精密稱(chēng)取不同質(zhì)量抗壞血酸（VC）標(biāo)準(zhǔn)品，溶于95%乙醇溶液中并定容，配制不同濃度梯度作為陽(yáng)性對(duì)照組[25]，95%乙醇溶液加0.2 mg/mL DPPH 作為空白組。將提取并離心后的樣品溶液旋蒸濃縮，測(cè)濃縮液中總?cè)坪?，并按照不同濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)罱K樣品濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL，向96孔微孔板中吸取不同濃度梯度的樣品溶液100 μL，再吸取100 μL 0.2 mg/mL DPPH 乙醇溶液，充分混合，在避光環(huán)境中靜置30 min，待反應(yīng)充分。同時(shí)，將100 μL 95%乙醇溶液加入不同濃度梯度的樣品溶液中作為對(duì)照組。測(cè)定517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度[26]。每個(gè)試驗(yàn)做3組平行，最終取3 組平行試驗(yàn)的平均值。按以下公式計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：X 為DPPH 自由基清除率，%；A1為不同濃度莢蒾樣品溶液與DPPH 混合后在517 nm 處測(cè)定得到的吸光度；A2為不同濃度莢蒾樣品溶液與乙醇溶液混合后在517 nm 處測(cè)得的吸光度；A0為與DPPH 混合的乙醇溶液在517 nm 處測(cè)得的吸光度。

1.3.7.2 日本莢蒾中總?cè)茖?duì)ABTS+自由基清除能力測(cè)定

精密稱(chēng)取不同質(zhì)量抗壞血酸（VC）標(biāo)準(zhǔn)品溶于95%乙醇溶液中并定容，配制為不同濃度梯度，作為陽(yáng)性對(duì)照組[25]，95%乙醇溶液加0.2 mg/mL ABTS 為空白組。將提取并離心后的樣品溶液旋蒸濃縮，測(cè)定濃縮液中總?cè)坪?，并按照不同濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)罱K樣品濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL，向96孔微孔板中吸取不同濃度梯度下的樣品溶液100 μL，再吸取100 μL 0.2 mg/mL ABTS 乙醇溶液，充分混合，在避光環(huán)境中靜置30 min，待反應(yīng)充分。同時(shí)，將100 μL 95%乙醇溶液加入不同濃度梯度的樣品溶液中作為對(duì)照組。測(cè)定517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度[26-27]。每個(gè)試驗(yàn)做3 組平行，最終取3 組平行試驗(yàn)的平均值。按以下公式計(jì)算ABTS+自由基清除率。

式中：X 為ABTS+自由基清除率，%；A1為不同濃度莢蒾樣品溶液與ABTS 混合后在517 nm 處測(cè)定得到的吸光度；A2為不同濃度莢蒾樣品溶液與乙醇溶液混合后在517 nm 處測(cè)得的吸光度；A0為與ABTS 混合的乙醇溶液在517 nm 處測(cè)得的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素過(guò)程所得到的數(shù)據(jù)利用Origin2021 進(jìn)行分析，Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

乙醇濃度對(duì)總?cè)频寐实挠绊懸?jiàn)圖1。

圖1 不同乙醇濃度對(duì)日本莢蒾總?cè)频寐实挠绊慒ig.1 Effects of different ethanol concentrations on the yield of total triterpenes from Viburnum japonicum

由圖1 可看出，乙醇濃度對(duì)日本莢蒾中總?cè)频寐视杏绊懀側(cè)频寐试?.75%～6.75%，乙醇濃度僅在極低或極高時(shí)對(duì)總?cè)频寐视绊戄^大，說(shuō)明乙醇濃度高于某一范圍或者低于某個(gè)閾值均會(huì)降低某些三萜類(lèi)化合物的溶解度，或增加莢蒾中一些醇溶性、脂溶性、色素等物質(zhì)溶出量，達(dá)到影響總?cè)苹衔锏寐实男Ч?，乙醇濃度處?0%～80%影響較平穩(wěn)，當(dāng)處于40%時(shí)獲得率呈最高水平，之后呈下降趨勢(shì)，所以將40%乙醇濃度選作較佳提取條件。

2.1.2 料液比對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

料液比對(duì)總?cè)频寐实挠绊懸?jiàn)圖2。

圖2 不同料液比對(duì)日本莢蒾總?cè)频寐实挠绊慒ig.2 Effect of different ratio of material to liquid on the yield of total triterpenes from Viburnum japonicum

由圖2 可知，不同料液比對(duì)日本莢蒾中總?cè)频寐视兄^為明顯的影響，總?cè)频寐试?.10%～8.78%，料液比為1∶7.5～1∶15.0（g/mL）時(shí)總?cè)频寐食噬仙隣顟B(tài)，之后總?cè)频寐士焖俳档?，可能是隨著乙醇用量的增加，溶液稀釋?zhuān)瑵舛冉档?，超聲波?duì)莢蒾粉末的作用減弱，乙醇提取的作用也相對(duì)減弱，最終導(dǎo)致總?cè)频寐式档?。因此選擇1∶15.0（g/mL）作為提取日本莢蒾的較佳料液比。

2.1.3 超聲溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

超聲溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊懸?jiàn)圖3。

圖3 不同超聲溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊慒ig.3 Effects of different ultrasonic temperatures on the extraction rate of total triterpenes from Viburnum japonicum

由圖3 可知，不同超聲溫度對(duì)日本莢蒾總?cè)频寐视忻黠@影響，總?cè)频寐试?.48%～8.91%，在50 ℃之前隨著溫度的上升總?cè)祁?lèi)化合物的得率也隨之增加，這可能是由于分子間運(yùn)動(dòng)速度隨溫度升高而加快，分子間滲透和擴(kuò)散能力增強(qiáng)，從而加大了三萜物質(zhì)的溶出，但溫度繼續(xù)上升三萜物質(zhì)得率降低，可能是溫度升高會(huì)導(dǎo)致三萜物質(zhì)發(fā)生分解，或有其他物質(zhì)溶出影響總?cè)频暮?，因此，最終選擇超聲溫度50 ℃作為較佳提取溫度。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

超聲時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊懸?jiàn)圖4。

圖4 不同超聲時(shí)間對(duì)日本莢蒾總?cè)频寐实挠绊慒ig.4 Effect of different ultrasonic time on the extraction rate of total triterpenes from Viburnum japonicum

從圖4 可以看出，超聲時(shí)間對(duì)總?cè)频牡寐视绊懖淮?，總?cè)频寐试?.30%～6.15%，在60 min 之前隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總?cè)频牡寐室苍谥饾u增加，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而導(dǎo)致總?cè)频寐式档?，?yīng)該是在前期隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)組織破碎增加，導(dǎo)致內(nèi)容物溶出增多，總?cè)坪吭黾?，繼續(xù)超聲會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)增加，且會(huì)影響總?cè)频姆€(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致總?cè)坪拷档?，因此，最終選擇60 min 為較佳超聲時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化莢蒾總?cè)频奶崛」に?/h3>

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3 所示。

表3 莢蒾中總?cè)铺崛№憫?yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results of total triterpenoids extraction from Viburnum japonicum

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

由響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6 分析表3 數(shù)據(jù)，得出以日本莢蒾中總?cè)频寐剩╕）為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為Y=8.78+0.34A+0.31B-0.014C+0.8D+1.39AB-0.18AC+0.31AD+0.22BC+0.29BD-0.26CD-1.7A2-1.46B2-0.36C2-0.58D2。

方差分析結(jié)果如表4 所示。

表4 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of quadratic regression model

由表4 可知，該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.979 2，決定系數(shù)說(shuō)明總?cè)频寐实淖兓?7.92%來(lái)自試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的4 種不同因素，表明該模型有效，模型擬合顯著，校正決定系數(shù)R2Adj=0.935 4 表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)93.54%的變化均可用該試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒忉?。一次?xiàng)D、交叉項(xiàng)AB、二次項(xiàng)A2、B2、D2對(duì)日本莢蒾總?cè)频寐实挠绊懕憩F(xiàn)為極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)D2對(duì)日本莢蒾總?cè)频寐实挠绊懕憩F(xiàn)為顯著（P＜0.05）。其他相關(guān)因素的影響不顯著。試驗(yàn)因素的F 值反映不同組合對(duì)響應(yīng)值的影響程度，F(xiàn) 檢驗(yàn)表明各因素對(duì)總?cè)频寐视绊懘笮槌晻r(shí)間（D）＞料液比（B）＞乙醇濃度（A）＞超聲溫度（C）。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)曲面圖可以用來(lái)評(píng)價(jià)任意兩因素間交互作用對(duì)日本莢蒾中總?cè)铺崛〉挠绊?，并能確定出不同因素的最佳水平范圍。由試驗(yàn)所得到的回歸模型得到響應(yīng)曲面圖如圖5 所示。

圖5 任意兩因素的交互作用與日本莢蒾總?cè)频寐赎P(guān)系的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface map of the relationship between the interaction of two factors and the extraction rate of total triterpenes from Viburnum japonicum

響應(yīng)曲面坡度表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件改變的敏感程度，曲面越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾衃28]；反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小[29]。從圖5 可以看出，乙醇濃度與料液比的交互作用顯著，即這2 個(gè)因素的交互作用對(duì)總?cè)频寐实挠绊戯@著；此外，乙醇濃度與超聲溫度，乙醇濃度與超聲時(shí)間，料液比與超聲溫度，料液比與超聲時(shí)間，超聲溫度與超聲時(shí)間的交互作用不顯著。

2.2.4 最佳試驗(yàn)條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度40.77%、料液比1∶12.5（g/mL）、超聲溫度50.02 ℃、超聲時(shí)間73.64 min，在該理論條件下，日本莢蒾總?cè)频牡寐蕿?.16%。為更加方便實(shí)現(xiàn)操作過(guò)程，改進(jìn)了理論條件下的最優(yōu)提取工藝，并確定最終提取工藝為乙醇濃度40%、料液比1∶12.5（g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間74 min，在改進(jìn)后的最優(yōu)工藝條件下總?cè)茖?shí)際得率為9.07%。該值接近理論條件下總?cè)频寐?，說(shuō)明該改進(jìn)后的工藝參數(shù)可靠。

2.3 總?cè)瓶寡趸钚缘脑囼?yàn)結(jié)果

DPPH 自由基和ABTS+自由基清除率測(cè)定結(jié)果如圖6 和圖7 所示。

圖6 莢蒾總?cè)艱PPH 自由基清除率影響Fig.6 Scavenging rate of total triterpene from Viburnum japonicumto DPPH free radical

圖7 莢蒾總?cè)茖?duì)ABTS+自由基清除率影響Fig.7 Scavenging rate of total triterpenoids from Viburnum japonicum to ABTS+free radicals

由圖6 可以看出，VC清除DPPH 自由基效果較好，且質(zhì)量濃度的變化對(duì)其影響較小。從日本莢蒾提取的總?cè)祁?lèi)化合物清除DPPH 自由基的效果低于VC?？?cè)频馁|(zhì)量濃度在0.5～2.0 mg/mL，日本莢蒾總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH 自由基清除率隨著總?cè)瀑|(zhì)量濃度的增加而增加，但是在質(zhì)量濃度高于2.5 mg/mL 后日本莢蒾中總?cè)茖?duì)DPPH 自由基清除率趨于穩(wěn)定。穩(wěn)定后的日本莢蒾中總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH 自由基的清除率為89%，具有相對(duì)較好的抗氧化性能。

從圖7 可以看出，VC對(duì)ABTS+自由基的清除效果較好且相對(duì)穩(wěn)定，不隨質(zhì)量濃度的改變而發(fā)生較大改變?？?cè)瀑|(zhì)量濃度在0.5～2.0 mg/mL 時(shí)，隨著總?cè)瀑|(zhì)量濃度的增加，日本莢蒾總?cè)铺崛∥飳?duì)ABTS+自由基的清除效果逐漸增強(qiáng)，質(zhì)量濃度如果持續(xù)增加，對(duì)ABTS+自由基清除效果趨于穩(wěn)定，在總?cè)瀑|(zhì)量濃度高于2.5 mg/mL 后日本莢蒾中總?cè)铺崛∥飳?duì)ABTS+自由基的清除率穩(wěn)定在78%，日本莢蒾提取物中總?cè)茖?duì)ABTS+自由基有較好的清除效果。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)，應(yīng)用響應(yīng)面對(duì)數(shù)據(jù)處理及優(yōu)化，建立提取過(guò)程的二次項(xiàng)多項(xiàng)式理論模型，結(jié)合實(shí)際操作情況確定最優(yōu)提取條件為乙醇濃度40%、料液比1∶12.5（g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間74 min，在改進(jìn)后的工藝條件下總?cè)频寐蕿?.07%。進(jìn)一步對(duì)莢蒾中總?cè)铺崛∥锏目寡趸钚赃M(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表示，日本莢蒾總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH 自由基及ABTS+自由基的清除作用雖略低于VC，但也表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抗氧化活性。本文為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用日本莢蒾中總?cè)苹衔锏裙δ芑钚猿煞痔峁﹨⒖肌?/p>