蕎麥槲皮素改善脂代謝異常肝原代細(xì)胞的作用機(jī)制

程菲兒，要子妍，云少君，曹瑾玲，程艷芬，馮翠萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030001）

隨著健康中國建設(shè)的推進(jìn)，更多的人開始關(guān)注飲食健康。《健康中國行動（2019-2030 年）》提示“關(guān)注血糖水平”，緩解血糖異常是營養(yǎng)學(xué)研究領(lǐng)域的前沿問題之一[1]。高油脂、高熱量的方便食品攝入過多，會造成機(jī)體肥胖、氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂等一系列健康問題，極易造成機(jī)體胰島素抵抗的發(fā)生，而這一現(xiàn)象被普遍認(rèn)為是引發(fā)2 型糖尿病、肥胖癥和心血管疾病等代謝綜合征的重要原因[2]。胰島素抵抗是影響葡萄糖利用率的主要因素，從而引發(fā)血糖穩(wěn)態(tài)失衡甚至是糖尿病[3]。然而，當(dāng)肝臟中的供需平衡被打破而產(chǎn)生過量的葡萄糖即可引發(fā)高血糖，肝胰島素抗性可增強(qiáng)脂質(zhì)積累并促進(jìn)葡萄糖產(chǎn)生，導(dǎo)致血脂異常和高血糖癥。因此，靶向肝胰島素抗性的天然活性成分可以有效改善2 型糖尿病和肝脂肪變性[4]。

自然界中，槲皮素大量存在于植物中，其中苦蕎（Fagopyrum tataricum）為蓼科蕎麥屬作物，是一種藥食兩用的假谷物，其種子是槲皮素的主要來源[5]。日常補(bǔ)充槲皮素大都需要通過食物攝取。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在我國以蕎麥為主食的產(chǎn)區(qū)人群中，血糖、血脂、血壓水平均低于非蕎麥產(chǎn)區(qū)居民[6]?？嗍w對慢性病的治療效果引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注[7]?？嗍w中最重要的生物活性成分為黃酮[8]，槲皮素是具有多種生物活性的植物黃酮類物質(zhì)，多數(shù)情況下以甙的形式存在，如金絲桃甙、槲皮甙等，經(jīng)過水解后可以得到槲皮素。有抗糖尿病活性、抗炎活性、抗疲勞性，可用于治療微血管病，預(yù)防肝炎癥損傷[9-11]。很多研究者已經(jīng)在肝基因表達(dá)和脂代謝的調(diào)控中揭示了槲皮素的作用[12-13]。研究表明，槲皮素可預(yù)防高脂肪飲食誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠的肥胖，槲皮素改變了與脂代謝有關(guān)的基因圖譜，包括法尼基轉(zhuǎn)移酶α、對氧磷酶1、過氧化物酶體增殖物激活受體、載脂蛋白、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶/CD36[14]。槲皮素的抗糖尿病特性包括通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)胰島素依賴型機(jī)制刺激葡萄糖的吸收，在肝臟中它可以通過抑制關(guān)鍵的葡萄糖生成酶來減少葡萄糖的產(chǎn)生[15-16]。

基于此，本研究建立離體組織的胰島素抵抗模型，探索槲皮素對脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用及其具體的生物學(xué)機(jī)制，以期為槲皮素成為高效的、緩解高脂造成的肝臟胰島素抵抗的膳食補(bǔ)充劑奠定科研基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

5 周齡潔凈健康級的C57BL/6J 雄性小鼠：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，所有操作嚴(yán)格遵守實驗動物護(hù)理和使用指南以及山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物管理辦法。

異氟烷：上海玉燕科技有限公司；膠原酶IV 型：美國Gibco 公司；胰蛋白酶（≥250 U/mg）：南京建成生物工程研究所有限公司；杜氏改良低糖培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）：美國HyClone 公司；RNAiso Plus 試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒：大連TaKaRa 生物工程公司；Ⅳ型膠原酶（≥100 U/mg）、溴化乙錠：北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Illumina HiSeqTM 2500 型測序儀：廣州基迪奧生物有限公司；MA-6000 型基因擴(kuò)增儀：杭州博日科技有限公司；Multishan Go 型多功能酶標(biāo)儀：香港伯齊科技有限公司；ABI 7500 型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理及測序樣品準(zhǔn)備

異氟烷麻醉小鼠（C57BL/6），迅速解剖，完全暴露肝臟門靜脈和下腔靜脈。門靜脈插入插管灌流70 mL含膠原酶Ⅳ型濃度0.03%的培養(yǎng)基，1～3 min 終止消化。取得完整的肝放到培養(yǎng)皿中，輕微撕拉肝臟培養(yǎng)基變成云狀，肝大部分溶解到培養(yǎng)基里，輕搖釋放殘存的細(xì)胞，將懸液過70 μm 濾膜。4 ℃、600 r/min 離心5 min，棄掉上清液，加入25 mL 4 ℃培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。接板后37 ℃培養(yǎng)45～60 min，待細(xì)胞黏附后，用培養(yǎng)基洗1 次，再加培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)3～4 h。預(yù)先將細(xì)胞與10 μmol/mL 槲皮素孵育0.5 h 后加棕櫚酸（100 μmol/mL）刺激24 h 造模。將六孔板放置于冰上，用磷酸緩沖鹽溶液清洗細(xì)胞，每孔加500 μL 總RNA抽提試劑，4 ℃裂解30 min，完成RNA 收集。將測試樣品分為3 組，依次為空白組、100 μmol/mL 棕櫚酸組和槲皮素組（10 μmol/mL 槲皮素+棕櫚酸處理）。

1.2.2 測序文庫構(gòu)建及數(shù)據(jù)處理

提取總RNA 后，測序后構(gòu)建文庫，富集真核mRNA，將富集的mRNA 片段化成短片段，并用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，純化并修復(fù)cDNA 片段，連接到Illumina測序接頭上。通過瓊脂糖凝膠電泳選擇連接產(chǎn)物的大小，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，并測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

與核糖體RNA（rRNA）的比對，與參考基因組的比對，轉(zhuǎn)錄本重建，新的基因轉(zhuǎn)錄本鑒定和注釋，利用RSEM 軟件對基因豐度進(jìn)行定量分析。利用基因本體數(shù)據(jù)庫（gene ontology，GO）富集分析、通路富集分析鑒定差異表達(dá)基因相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的主成分分析

轉(zhuǎn)錄組測序獲得了各樣本中所有基因的表達(dá)值信息，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）比較樣本之間在基因表達(dá)值的整體相似性或者差異程度。運(yùn)用降維的方法保留高維度的數(shù)據(jù)最重要的一些特征，去除噪聲和不重要的特征，從而探究基因表達(dá)存在的相關(guān)性。

PC1 和PC2 是兩個主坐標(biāo)成分，PC1 表示盡可能最大解釋數(shù)據(jù)變化的主坐標(biāo)成分，PC2 為解釋余下的變化度中占比例最大的主坐標(biāo)成分。不同處理下樣品的情況，樣品組成越相似，其距離越近。由圖1 可知，各處理組分布于不同象限，組內(nèi)平行性較好，可進(jìn)行后續(xù)分析利用。

圖1 主成分分析Fig.1 Principal component analysis plot

2.2 差異表達(dá)基因的分析

不同處理組差異表達(dá)基因的韋恩圖和火山圖見圖2。

圖2 不同處理組差異表達(dá)基因的韋恩圖和火山圖Fig.2 Venn diagram and volcano plots of differentially expressed genes between different groups

對不同處理條件下的測序數(shù)據(jù)差異結(jié)果進(jìn)行分析，差異基因用韋恩圖（圖2A）和火山圖（圖2B～D）表示，在火山圖中，用圓點表示為各個差異基因，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2 且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.05 來選擇閾值。不同處理組之間的比較研究發(fā)現(xiàn)（圖2E），空白組與棕櫚酸組相比，上調(diào)基因404 個，下調(diào)基因291 個；棕櫚酸組與槲皮素組相比，顯著上調(diào)的基因為385 個，下調(diào)基因共有172 個。上述結(jié)果表明，與空白組相比，棕櫚酸處理小鼠肝原代細(xì)胞會使其中的眾多基因表達(dá)量發(fā)生改變，而加入槲皮素干預(yù)后，調(diào)節(jié)了基因轉(zhuǎn)錄水平。

將測序結(jié)果中顯示的差異基因進(jìn)行相關(guān)熱圖分析，建立了空白組、棕櫚酸組、槲皮素組各不同處理方式下肝原代細(xì)胞差異基因的熱圖，結(jié)果見圖3。

圖3 不同處理組測序差異表達(dá)基因的熱圖分析Fig.3 Heatmap of differentially expressed genes between different groups determined via RNA-Seq

圖3 中，每個格子表示1 個基因，顏色越深代表這個基因的表達(dá)量越高。每行表示每個基因在不同樣本中的表達(dá)量情況，每列表示每個樣品中所有基因的表達(dá)量情況。左側(cè)樹形圖就是對基因的聚類，聚類可以觀察到基因之間的關(guān)系及其上下游調(diào)控會導(dǎo)致連鎖反應(yīng)。

2.3 基因本體數(shù)據(jù)庫分析

基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫把基因的功能分成了3 個部分，分別為細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）。利用GO 數(shù)據(jù)庫，就可以得到目標(biāo)基因在CC，MF 和BP 3 個層面上的生物調(diào)節(jié)機(jī)制。GO 的功能注釋分析見圖4。

圖4 GO 的功能注釋分析Fig.4 GO annotation of the differentially expressed genes

圖4 GO 分析表明，槲皮素作用于肝原代細(xì)胞中，生物過程包括細(xì)胞過程、信號-組織過程、刺激反應(yīng)、代謝過程、生物調(diào)節(jié)；分子功能包括綁定、接觸反應(yīng)活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子活性等；細(xì)胞組成包括細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜等。通過對核心靶點的GO 分析，發(fā)現(xiàn)槲皮素改善脂代謝紊亂的肝臟原代細(xì)胞，與細(xì)胞代謝過程、生物調(diào)節(jié)信號等生物學(xué)過程密切相關(guān)，說明槲皮素有助于肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控。而脂質(zhì)在肝臟的異位沉積被認(rèn)為是代謝紊亂和胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵性因素，表明脂肪組織功能紊亂與肝臟胰島素抵抗發(fā)生之間的關(guān)系[17]，通過基因組測序結(jié)果證實棕櫚酸刺激肝原代細(xì)胞確使其發(fā)生代謝紊亂。

2.4 京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫分析

京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫。根據(jù)mRNA-gene 調(diào)控信息，為了能夠比較清晰地研究不同組之間基因差異的生物學(xué)影響，將顯著富集的基因利用KEGG 進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 KEGG 通路的功能注釋分析Fig.5 KEGG pathways of the differentially expressed genes

差異基因主要富集的信號通路有炎癥相關(guān)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號通路（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）、MAPK 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路（tumor necrosis factor，TNF）等通路富集的差異基因數(shù)量較多。已有研究表明棕櫚酸刺激細(xì)胞極易引發(fā)其自身氧化應(yīng)激及代謝紊亂。Cheng 等[18]利用棕櫚酸刺激HepG2細(xì)胞建立糖代謝紊亂模型。本試驗中利用100 μmol/L棕櫚酸刺激小鼠肝臟原代細(xì)胞建立肝臟原代細(xì)胞糖脂紊亂模型。此外，Zhang 等[19]發(fā)現(xiàn)蕎麥中的功能性成分可預(yù)防PA 介導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂。KEGG 分析結(jié)果顯示，槲皮素改善脂代謝紊亂的通路為HIF-1 信號通路，MAPK 信號通路、TNF 信號通路。HIF-1 的發(fā)現(xiàn)給肝臟脂質(zhì)代謝紊亂研究提供了新思路，缺氧導(dǎo)致肝組織功能紊亂。當(dāng)氧氣水平低時，HIF-1 的量會增加，因此它可以結(jié)合并調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素基因以及其他具有HIF 結(jié)合DNA 片段的基因。這一因子的升高標(biāo)志了組織處于缺氧狀態(tài)，而這與線粒體功能障礙有關(guān)，包括脂肪酸氧化受損，電子傳輸鏈活性降低和活性氧產(chǎn)生增加[20]。這些缺氧性改變極易加速肝脂質(zhì)積累和炎性細(xì)胞浸潤，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致肝臟中不可逆的纖維化重塑[21]。高脂飲食間歇性缺氧通常會加劇肝脂肪變性，并伴有肝臟炎癥和脂質(zhì)過氧化作用。MAPK信號通路調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過程。在糖脂代謝紊亂所產(chǎn)生的應(yīng)激刺激（缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等）和炎性刺激狀態(tài)中起轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，MAPK 是信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。進(jìn)入血液循環(huán)的高濃度游離脂肪酸會造成脂肪代謝的紊亂，MAPK 通過依次磷酸化將上游信號傳遞至下游應(yīng)答分子，使機(jī)體具有信號傳遞功能的脂質(zhì)甘油二酯的含量升高從而導(dǎo)致蛋白激酶C-ε 向胞膜異位，與胰島素受體結(jié)合并抑制該受體的作用，通過損壞胰島素下游的磷脂酰肌醇3 激酶信號通路，從而減弱了胰島素抑制糖異生的作用，導(dǎo)致肝臟產(chǎn)糖量增加[22-24]。而在高血糖的刺激下，極易導(dǎo)致機(jī)體的炎癥反應(yīng)，此時TNF 信號通路中的關(guān)鍵因子介導(dǎo)了體內(nèi)的細(xì)胞存活、死亡和分化。脂質(zhì)代謝紊亂引發(fā)的肝臟胰島素抵抗是后續(xù)研究的新思路，值得我們進(jìn)一步深入探究其機(jī)制。

3 結(jié)論

肝臟在代謝調(diào)控中具有主導(dǎo)作用，但很少有研究全面揭示槲皮素作為膳食補(bǔ)充劑在原代肝細(xì)胞中基因表達(dá)情況，尤其是對全基因譜的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄組測序及分析顯示，差異基因主要富集的信號通路分別是HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路等通路。測序結(jié)果表明不同處理組對小鼠肝原代細(xì)胞中基因表達(dá)量產(chǎn)生影響。其中，蕎麥槲皮素有效改善HIF-1 途徑值得特別關(guān)注，這一發(fā)現(xiàn)將為蕎麥作為高原缺氧條件下的膳食補(bǔ)充提供理論基礎(chǔ)，豐富蕎麥制品，延長地方特色小雜糧產(chǎn)業(yè)鏈，為促進(jìn)雜糧可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。