基于miR-495/FTO 通路介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化探討芪參湯改善胰島素抵抗治療2 型糖尿病的分子機(jī)制

孫志東，高佳煒，楊柳欣，張雅麗，3，袁星星，

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；3.張雅麗名老中醫(yī)藥專家工作室，黑龍江 哈爾濱 150006）

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種由環(huán)境與遺傳等因素共同作用引起的，以胰島素分泌相對減少伴胰島素抵抗為主要病理生理特征的代謝性疾?。?］。30 多年來，我國糖尿病的患病率顯著增加，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，其中T2DM 約占我國糖尿病的90%以上，不僅給患者帶來極大的危害，也給社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。

巨噬細(xì)胞是人體重要的固有免疫細(xì)胞，在機(jī)體微環(huán)境改變的同時其功能發(fā)生變化，包括經(jīng)典激活的M1 型和交替激活的M2 型。巨噬細(xì)胞極化在包括肥胖、T2DM、非酒精性脂肪性肝病和痛風(fēng)等代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［3］。研究證實(shí)，脂肪巨噬細(xì)胞構(gòu)成的炎性浸潤在誘導(dǎo)胰島素抵抗-T2DM 這一病理過程中的作用不容忽略［4］。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)的炎癥微環(huán)境可能是改善胰島素抵抗的重要途徑。芪參湯已被證實(shí)能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗，從而促進(jìn)糖脂代謝和降低體質(zhì)量，然而具體機(jī)制仍不明確［5，6］。本研究以佛波酯誘導(dǎo)THP-1 人單核細(xì)胞株分化巨噬細(xì)胞，并采用高糖刺激構(gòu)建巨噬細(xì)胞極化模型，通過觀察芪參湯對miR-495/FTO 信號通路介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的影響，從而闡明芪參湯改善胰島素抵抗治療T2DM 的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞

20 只健康清潔級SD 大鼠（雄性，6 周齡，201～225 g）購于北京維通利華有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：京瓦窯 SCXK（京）2021-0011。動物飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20～25 ℃，循環(huán)光照，自由飲水。THP-1（人單核細(xì)胞白血病）細(xì)胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

芪參湯（生黃芪15 g、西洋參10 g、澤瀉10 g、荷葉10 g、生山楂10 g、丹參10 g、女貞子8 g、墨旱蓮8 g、絞股藍(lán)5 g、三七5 g、生甘草3 g）購于黑龍江生中醫(yī)藥科學(xué)院中草藥局，藥物經(jīng)煎煮、過濾后制成1 g/mL 的濃縮液備用。佛波酯購于中國Biosharp 公司（貨號：BL1127A）；RPMI-1640 培養(yǎng)液和高糖培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號分別為PM150110B 和PM150210B）。CD86 和CD206 一抗均購于英國Abcam 公司（ab239075 和ab270647）；FTO 一抗、β-Actin 一抗、HRP 標(biāo)記的二抗、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA 蛋白檢測試劑盒購于美國CST 公司（貨號分別為#31687、#93473、#7074、#6883 和#7780）。白細(xì)胞介素4（Interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-1β 和IL-10 檢測試劑盒購于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司（貨號分別為MM -0051H2、MM -0049H2、MM-0181H2 和MM-0066H2）。Lipo6000轉(zhuǎn)染試劑盒購于上海碧云天生物（貨號：C0526-10ml）；qPCR 試劑盒購于美國Roche 公司（貨號：KK4610）。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為空白組與模型組，各10 只。參照前期研究［7］方法，芪參湯組給予芪參湯濃縮液（18.8 g/kg）灌胃治療，空白組給與等體積的生理鹽水灌胃治療，每日1次，連續(xù)7 d。于末次治療后腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血。3 500 r/min 離心10 min 后收集血清，水浴滅活30 min 后，濾膜過濾后備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1 以RPMI-1640 培養(yǎng)液（含有10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗和β-巰基乙醇）進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37 ℃和含5%CO2的培養(yǎng)箱中配，2～3 d 換液1 次。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，將細(xì)胞接種于6 孔板（1×106個/mL）。向細(xì)胞中加入佛波酯（160 nmol/L）誘導(dǎo)THP-1 向巨噬細(xì)胞分化，當(dāng)細(xì)胞以懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)為貼壁狀態(tài)，表示細(xì)胞分化成功。

1.3.3 細(xì)胞分組與藥物干預(yù) 將分化后的巨噬細(xì)胞以2.5×105個/mL 的密度接種于6 孔板，每孔900 μL。參照方案進(jìn)行分組并給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行干預(yù)。（1）空白組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L葡萄糖）+100 μL 空白血清；（2）模型組：THP-1+高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 空白血清；（3）芪參湯組：THP-1+高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L葡萄糖）+100 μL 含藥血清；（4）miR-495 抑制物組：THP-1+高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL空白血清+miR-495 inhibitor；（5）芪參湯+miR-495抑制物組：THP-1+高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 含藥血清+miR-495 inhibitor。其中miR-495 inhibitor 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代合成，參照Lipo6000 試劑盒說明書將終濃度為200 nmol/L 的miR-495 inhibitor 轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞。

1.3.4 CCK8 法檢測 將分化后的巨噬細(xì)胞以2.5×105個/mL 的密度接種于6 孔板，參照方案進(jìn)行分組并給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行干預(yù)，以檢測芪參湯含藥血清和轉(zhuǎn)染miR-495 inhibitor 對巨噬細(xì)胞的毒性。（1）空白組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L葡萄糖）；（2）空白血清組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 空白血清；（3）含藥血清組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 含藥血清；（4）miR-495 抑制物組：THP-1+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+miR-495 inhibitor。沒孔加入10 μL 的CCK8 溶液，于37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)4 h，通過酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度值（A450）。

1.3.5 ELISA 法檢測 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA 試劑盒檢測各組培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-1β、IL-4 和IL-10 的含量，實(shí)驗(yàn)操作在試劑盒說明書指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入PBS 重懸后1 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌2 次后分為2 組。一組加入200 μL 的PBS 重懸后加入FITC 標(biāo)記的CD86 的抗體進(jìn)行孵育；另一組加入200 μL 的PBS 重懸后加入1.5 mL 破膜劑，加入FITC 標(biāo)記的CD206 的抗體進(jìn)行孵育。孵育30 min后以PBS 洗滌、重懸后上機(jī)檢測CD86 和CD206 的陽性表達(dá)率。

1.3.7 qPCR 檢測 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞，采用TRIzol 法提取細(xì)胞中總RNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照qPCR 試劑盒方法進(jìn)行mRNA 的定量分析。引物序列如下：miR-495：F：5'-GCGAAACAAACATGGTGC-3'，R：5'-GCAG GGTCCGAGGTATTC-3'；U6：F：5'-CTCGCTT CGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3'；FTO：5'-TTCATGCTGGATG ACCTCAATG-3'，R：5'-GCCAACTGACAGCG TTCTAAG - 3'；GAPDH：F：5'- GCACCGTC AAGGCTGAGAAC-3'，R：5'-TGGTGAAGACG CCAGTGGA-3'。qPCR 的反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，58 ℃變性30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40 次后以95 ℃終末延伸15 s，4 ℃保持。miR-495 以U6 作為內(nèi)參，F(xiàn)TO 以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-495 與FTO 的相對表達(dá)量。

1.3.8 Western blot 檢測 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞，提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后以脫脂牛奶于室溫下進(jìn)行封閉。加入FTO（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗于室溫下繼續(xù)孵育2 h。TBST 洗膜后加入ECL 顯影，化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)拍照后分析FTO 的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用ANOVA，組間兩兩的比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪參湯對巨噬細(xì)胞活性的影響

為了明確空白血清、芪參湯含藥血清和轉(zhuǎn)染miR-495 抑制物對巨噬細(xì)胞的毒性，本研究采用CCK8 法檢測巨噬細(xì)胞的活性。與本組12 h 相比，24 h 和48 h細(xì)胞的活性均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各時間段組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組相比，空白血清、芪參湯含藥血清和轉(zhuǎn)染miR-495 抑制物的巨噬細(xì)胞活性均無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 芪參湯對巨噬細(xì)胞活性的影響（n=3，±s，OD）Tab 1 Effect of Qishen decoction on macrophage activity（n=3，±s，OD）

表1 芪參湯對巨噬細(xì)胞活性的影響（n=3，±s，OD）Tab 1 Effect of Qishen decoction on macrophage activity（n=3，±s，OD）

注：與本組12 h 相比，*P＜0.05。

分組空白組空白血清組含藥血清組miR-495 抑制物組48 h 0.847±0.165*0.852±0.080*0.870±0.053*0.849±0.081*0.030 0.916 FP 12 h 0.633±0.013 0.634±0.040 0.627±0.075 0.627±0.044 0.022 0.995 24 h 0.740±0.021*0.747±0.020*0.750±0.020*0.746±0.035*0.086 0.966

2.2 芪參湯對巨噬細(xì)胞炎癥因子含量的影響

與空白組相比，模型組IL-6 和IL-1β 的含量均顯著增加，IL-4 和IL-10 的含量均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組上清中IL-6 和IL-1β 的含量均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組上清中IL-4 和IL-10 的含量均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）。見表2。

表2 芪參湯對巨噬細(xì)胞炎癥因子含量的影響（n=3，±s，pg/mL）Tab 2 Effect of Qishen decoction on inflammatory factors in macrophages（n=3，±s，pg/mL）

表2 芪參湯對巨噬細(xì)胞炎癥因子含量的影響（n=3，±s，pg/mL）Tab 2 Effect of Qishen decoction on inflammatory factors in macrophages（n=3，±s，pg/mL）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，○P＜0.05，○○P＜0.01。

分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組IL-6 7.93±0.78 24.58±2.15**16.48±2.88○○17.99±3.29○○9.78±1.37○○IL-1β 18.04±3.35 57.66±9.69**40.25±5.63○○39.25±6.81○○22.67±1.83○○IL-4 23.23±0.93 8.91±1.26**13.69±1.87○○13.10±1.38○19.05±2.63○○IL-10 70.07±8.98 28.43±4.19**40.12±1.30○○40.22±2.06○52.60±2.48○○33.981＜0.001 FP 25.662＜0.001 20.051＜0.001 31.628＜0.001

2.3 芪參湯對巨噬細(xì)胞表型的影響

與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞CD68 的表達(dá)和CD68/CD206 的比值均顯著增加，CD206 的表達(dá)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組巨噬細(xì)胞CD68 的表達(dá)和CD68/CD206 的比值均顯著降低，CD206 的表達(dá)均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3 和圖1。

圖1 各組巨噬細(xì)胞CD86 和CD206 表達(dá)的比較Fig 1 Comparison of CD86 and CD206 expression in macrophages

表3 芪參湯對巨噬細(xì)胞表型的影響（n=3，±s）Tab 3 Effect of Qishen decoction on macrophage phenotype（n=3，±s）

表3 芪參湯對巨噬細(xì)胞表型的影響（n=3，±s）Tab 3 Effect of Qishen decoction on macrophage phenotype（n=3，±s）

注：與空白組相比，**P＜0.01；與模型組相比，○○P＜0.01。

分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組CD68（%）21.26±1.38 53.53±3.05**38.05±3.14○○37.61±5.73○○30.49±2.05○○CD206（%）24.01±3.16 11.20±1.69**19.64±4.15○○20.85±3.24○○29.08±1.98○○CD68/CD206 的比值0.90±0.16 4.84±0.46**2.01±0.52○○1.81±0.27○○1.05±0.06○○65.063＜0.001 FP 36.219＜0.001 14.535＜0.001

2.4 芪參湯對巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞iNOS 和COX-2 的表達(dá)均顯著增加，Arg-1 和YM-1 的表達(dá)均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組巨噬細(xì)胞iNOS 和COX-2 的表達(dá)均顯著降低，Arg-1 和YM-1 的表達(dá)均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4 芪參湯對巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記分子表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 4 Effect of Qishen decoction on the expression of macrophage marker molecules（n=3，±s）

表4 芪參湯對巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記分子表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 4 Effect of Qishen decoction on the expression of macrophage marker molecules（n=3，±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，○P＜0.05，○○P＜0.01。

分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組Arg-1 1.00±0.00 0.25±0.07**0.64±0.07○○0.67±0.09○○0.93±0.05○○YM-1 1.00±0.00 0.34±0.05**0.66±0.07○○0.68±0.05○○0.88±0.04○○84.613＜0.001 FP iNOS 1.00±0.00 3.14±0.18**2.43±0.08○○2.45±0.14○○1.75±0.10○○143.029＜0.001 COX-2 1.00±0.00 2.80±0.12**2.41±0.08○○2.39±0.13○○1.45±0.09○○191.093＜0.001 64.004＜0.001

2.5 芪參湯對MiR-495 和FTO 表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞中miR-495 的表達(dá)均顯著增加，F(xiàn)TO 的表達(dá)均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組巨噬細(xì)胞中miR-495 的表達(dá)均顯著降低，F(xiàn)TO 的表達(dá)均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表5。

表5 芪參湯對巨噬細(xì)胞miR-495 和FTO 表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of Qishen decoction on the expression of miR-495 and FTO（n=3，±s）

表5 芪參湯對巨噬細(xì)胞miR-495 和FTO 表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of Qishen decoction on the expression of miR-495 and FTO（n=3，±s）

注：與空白組相比，**P＜0.01；與模型組相比，○○P＜0.01。

分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組miR-495 的相對表達(dá)1.00±0.00 2.70±0.09**2.30±0.06○○2.37±0.05○○FTO 的相對表達(dá)1.00±0.00 0.21±0.03**0.49±0.03○○0.50±0.05○○1.42±0.03○○0.76±0.04○○271.386＜0.001 FP 504.084＜0.001

2.6 芪參湯對FTO 蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞中FTO 蛋白的表達(dá)均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芪參湯組、miR-495 抑制物組和芪參湯+miR-495 抑制物組巨噬細(xì)胞中FTO蛋白的表達(dá)均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表6。

表6 芪參湯對巨噬細(xì)胞FTO 蛋白表達(dá)的的影響（n=3，±s）Tab 6 Effect of Qishen decoction on FTO protein expression（n=3，±s）

表6 芪參湯對巨噬細(xì)胞FTO 蛋白表達(dá)的的影響（n=3，±s）Tab 6 Effect of Qishen decoction on FTO protein expression（n=3，±s）

注：與空白組相比，**P＜0.01；與模型組相比，○○P＜0.01。

FTO/β-actin 0.82±1.36 0.20±0.03**0.51±0.03○○0.50±0.06○○0.71±0.03○○128.495＜0.001分組空白組模型組芪參湯組miR-495 抑制物組芪參湯+miR-495 抑制物組FP

圖2 各組巨噬細(xì)胞中FTO 蛋白表達(dá)的比較Fig 2 Comparison of FTO protein expression in macrophages of each group

3 討論

胰島素抵抗作為T2DM 的重要病理機(jī)制，同時也被證實(shí)在代謝綜合征中發(fā)揮著重要的作用。肥胖可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的體積增大，增大的脂肪細(xì)胞引起脂肪組織的缺氧，從而誘發(fā)細(xì)胞功能障礙（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)）并啟動炎癥反應(yīng)；另一方面，肥大的脂肪細(xì)胞通過分泌的單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）導(dǎo)致糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗［8］。除脂肪組織巨噬細(xì)胞外，在MCP-1 和B 細(xì)胞、T 細(xì)胞的趨化作用下，來自單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞在壞死脂肪細(xì)胞周圍浸潤的巨噬細(xì)胞是糖尿病慢性炎癥的標(biāo)志［9］。

巨噬細(xì)胞功能存在顯著的異質(zhì)性，在局部微環(huán)境的影響下其表型發(fā)生著動態(tài)轉(zhuǎn)化。M1 型巨噬細(xì)胞以CD68、iNOS 和COX2 為主要標(biāo)記分子，通過分泌IL-6、IL-1β 及TNF-α 等促炎因子，發(fā)揮免疫監(jiān)控的作用。iNOS 是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，通過下調(diào)胰島素信號分子Rab8 的表達(dá)水平參與胰島素抵抗的形成［10］。COX2 是前列腺素合成過程中的重要限速酶，其表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)及腫瘤的形成密切相關(guān)。有研究證實(shí)，COX2 可誘導(dǎo)胰島內(nèi)的炎癥水平，進(jìn)而引起胰島β 細(xì)胞功能的損傷［11］。M2 型巨噬細(xì)胞以CD206、Arg-1 和YM-1 陽性表達(dá)為主表標(biāo)記分子，通過分泌IL-4 及IL-10 等細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎的作用。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞以M1 型分化為主，并分泌大量的IL-6 和IL-1β。芪參湯含藥血清能夠顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中CD206、Arg-1 和YM-1 的表達(dá)，并下調(diào)CD68、iNOS 和COX2 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1 向M2型分化，從而發(fā)揮抗炎的作用。

微小RNA（miRNA）是真核生物內(nèi)的一類小分子非編碼RNA，約19～25 個核苷酸大小。在Dicer酶的作用下，70～90 nt 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA 前體被加工形成miRNA，其通過識別并特異性地結(jié)合mRNA 的3'UTR，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制mRNA的翻譯或者促進(jìn)mRNA 的降解，發(fā)揮病理生理作用。越來越多的研究證實(shí)miRNA 的表達(dá)通過影響胰島素抵抗或調(diào)控胰島β 細(xì)胞的功能參與葡萄糖的代謝［12］。此外，miRNA 還可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與巨噬細(xì)胞的極化，進(jìn)而對免疫反應(yīng)、胰島素抵抗與炎癥等發(fā)揮治療作用［13］。miR-495 已被證實(shí)在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并對血管再狹窄、氧化應(yīng)激的調(diào)控和巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮著積極的作用［14-16］。FTO 是miR-495 下游重要的靶基因。作為脂肪和肥胖相關(guān)基因，F(xiàn)TO 與糖尿病、脂肪肝、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展存在著密切的關(guān)系。研究證實(shí)，過表達(dá)FTO 可引起體重的增加與糖尿病等［17］。然而，F(xiàn)TO 在不同細(xì)胞中的作用可能相反。研究證實(shí)，F(xiàn)TO 在通過調(diào)控肝臟中糖生成基因的表達(dá)從而參與機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)［18］。當(dāng)前的研究證實(shí)，在高糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞模型中miR-495 的表達(dá)水平顯著增加，通過抑制miR-495 的表達(dá)能夠顯著上調(diào)FTO 的表達(dá)，從而促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗炎的作用。

芪參湯為臨床治療代謝綜合征的經(jīng)驗(yàn)方，該方以黃芪、西洋參為君，其中黃芪具有補(bǔ)氣固表，西洋參養(yǎng)陰生津，兩者合用具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效。研究證實(shí)，黃芪中的黃芪多糖能夠通過上調(diào)骨骼肌中的PI3K 和降低血清總膽固醇和甘油三酯的水平，達(dá)到改善肥胖大鼠的胰島素抵抗的作用［19］。方中以澤瀉、荷葉入脾、腎經(jīng)，滲濕、泄熱，生山楂、丹參入肝、脾、胃經(jīng)，健脾消食、行氣散瘀，以上四藥，共為臣藥。周熠等［20］通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明，荷葉可通過胰島素抵抗通路、ErbB 信號通路及胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等協(xié)調(diào)發(fā)揮治療T2DM 的作用。而丹參的主要活性成分丹參酮Ⅰ可通過抑制PTP1B 的表達(dá)，從而促進(jìn)AKT 信號通路的活化，改善胰島素抵抗［21］。女貞子、墨旱蓮滋補(bǔ)肝腎，絞股藍(lán)補(bǔ)虛清熱，三七活血祛瘀，以上四藥共為佐藥。藥理學(xué)研究證實(shí)，絞股藍(lán)及其等效成分如絞股藍(lán)多糖、絞股藍(lán)皂苷等能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝、恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)、改善胰島素抵抗和抗氧化的作用，在糖尿病的治療中發(fā)揮著重要作用。甘草解毒、調(diào)和藥性，作為使藥。全方共奏益氣養(yǎng)陰、消食散瘀的功效。本研究結(jié)果證實(shí)芪參湯對巨噬細(xì)胞的活性無明顯毒副作用，該結(jié)果提示芪參湯抗炎的作用不是通過抑制巨噬細(xì)胞活性實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步藥理學(xué)研究結(jié)果顯示芪參湯能夠顯著增加M2 型巨噬細(xì)胞的比例，降低M1 型巨噬細(xì)胞的比例，從而降低IL-6 和IL-1β 的水平，增加IL-4 和IL-10 的水平，發(fā)揮抗炎的作用。機(jī)制角度，芪參湯能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞中miR-495 的表達(dá)，上調(diào)FTO 的表達(dá)水平，從而巨噬巨噬細(xì)胞M1 向M2 型極化，其藥理學(xué)作用與miR-495 抑制物趨勢相同，兩者聯(lián)用和發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步闡明了芪參湯改善胰島素抵抗的分子機(jī)制及靶點(diǎn)。研究結(jié)果表明，芪參湯通過miR-495/FTO 通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2 型分化，從而發(fā)揮抗炎機(jī)制，達(dá)到改善胰島素抵抗的作用。

作者貢獻(xiàn)度說明：

袁星星：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；高佳煒、楊柳欣執(zhí)：行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和指標(biāo)檢測；孫志東：負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分析和文稿撰寫；張雅麗：進(jìn)行最后校審。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。