釀酒酵母乙酸代謝調(diào)控機(jī)制及低產(chǎn)菌株選育的研究進(jìn)展

鄧海霞，郭晨晨，李二虎,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.果蔬加工與品質(zhì)調(diào)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)），湖北 武漢 430070）

果酒是水果經(jīng)破碎、榨汁、發(fā)酵、澄清、陳釀等工藝加工后獲得的低酒精度飲料，其酒精體積分?jǐn)?shù)一般在7%～18%。經(jīng)發(fā)酵釀制而成的果酒，既保留了水果的風(fēng)味又增加了其營養(yǎng)價(jià)值，符合人們當(dāng)前的消費(fèi)需求，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。果酒中的有機(jī)酸包括固定酸和揮發(fā)酸。乙酸作為揮發(fā)酸的主要成分，其含量高低是影響果酒品質(zhì)的重要因素[1]。乙酸含量過高不僅會(huì)導(dǎo)致果酒口感苦澀、刺激，而且會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞死亡，阻礙發(fā)酵正常進(jìn)行[2]。通常情況下，果酒中乙酸質(zhì)量濃度在0.1～0.5 g/L，當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.8 g/L就會(huì)出現(xiàn)酸敗味[3]。2020年制定的《果酒通用技術(shù)要求》規(guī)定，果酒中的乙酸質(zhì)量濃度應(yīng)不高于1.2 g/L。但是實(shí)際生產(chǎn)中因原料質(zhì)量及釀造工藝等因素的影響，常有果酒乙酸含量超標(biāo)的現(xiàn)象發(fā)生，阻礙了我國果酒產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

果酒中的乙酸主要來源于3 個(gè)方面：1）果酒發(fā)酵原料帶入。水果成熟后易受病蟲害浸染，表面滋生微生物，由病原體感染或自然形成引起的果皮破裂，使得醋酸菌能夠進(jìn)入果實(shí)的內(nèi)部，并利用天然酵母發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇作為其首選碳源，使得果汁中乙酸含量超標(biāo)[4-5]；2）果酒發(fā)酵過程釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）代謝生成。在酒精發(fā)酵過程中，丙酮酸脫氫酶活性在厭氧條件下受到抑制，阻礙了丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A。為了滿足酵母細(xì)胞基本能量和物質(zhì)的合成，酵母丙酮酸脫氫酶旁路被激活，乙酸則是釀酒酵母通過丙酮酸脫氫酶旁路形成的一種重要副產(chǎn)物，主要產(chǎn)生于酒精發(fā)酵初期，其產(chǎn)量受酵母菌株[6-7]、含糖量[8-10]、氮源[11-12]和發(fā)酵條件[13-16]等因素影響；3）陳釀階段產(chǎn)生。果酒在陳釀過程中，如果貯存管理不科學(xué)，果酒與空氣接觸，感染雜菌或酒中的乙醇被氧化，也會(huì)導(dǎo)致乙酸含量增加[17]。其中，在發(fā)酵原料和陳釀階段產(chǎn)生的乙酸，國內(nèi)外學(xué)者已開展了大量研究，并提出了相應(yīng)的生產(chǎn)控制措施[18-19]。而針對酒精發(fā)酵過程中釀酒酵母生成導(dǎo)致果酒乙酸含量過高的問題，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界至今仍未能找到有效的解決措施。雖然通過優(yōu)化發(fā)酵工藝條件能夠在短期內(nèi)快速調(diào)整果酒中乙酸含量[20-21]，但是由于原料的差異性以及發(fā)酵環(huán)境的復(fù)雜性，對生產(chǎn)設(shè)備和發(fā)酵工藝提出了較高的要求。因此，要想從根本上解決果酒乙酸含量超標(biāo)的問題，應(yīng)該從釀酒酵母乙酸代謝調(diào)控機(jī)制出發(fā)，選育優(yōu)良的低產(chǎn)乙酸酵母菌株。本文介紹酒精發(fā)酵過程中釀酒酵母乙酸代謝途徑及其調(diào)控基因，并在此基礎(chǔ)上闡述釀酒酵母乙酸調(diào)控機(jī)制研究策略以及低產(chǎn)乙酸菌株選育方法的研究進(jìn)展，以期為精準(zhǔn)調(diào)控果酒中乙酸含量、提高果酒品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 釀酒酵母乙酸代謝途徑及調(diào)控基因

酒精發(fā)酵過程中釀酒酵母產(chǎn)生的乙酸是引起果酒揮發(fā)酸含量升高的重要原因。研究乙酸在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的代謝過程對控制果酒乙酸有重要意義。圖1展示了釀酒酵母中乙酸代謝的主要途徑及關(guān)鍵調(diào)控基因。

圖1 釀酒酵母乙酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝途徑[22-26]Fig.1 Acetic acid transportation and metabolism pathways in S.cerevisiae[22-26]

1.1 乙酸的合成代謝

釀酒酵母代謝生成乙酸的實(shí)際生化途徑雖然還沒有明確闡明，但國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為乙酸是釀酒酵母經(jīng)過丙酮酸脫氫酶旁路的副產(chǎn)物[27-28]。該途徑涉及到丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的催化下生成乙醛，之后乙醛通過乙醛脫氫酶被氧化為乙酸（圖1）。Verduvn等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在厭氧條件下，具有最低乙醛脫氫酶活性酵母產(chǎn)生的乙酸含量最低。在高糖發(fā)酵基質(zhì)中，釀酒酵母合成乙酸與甘油總是同步的，因此有人提出釀酒酵母產(chǎn)生乙酸以平衡響應(yīng)高滲應(yīng)激和甘油過量產(chǎn)生的NAD+可能是乙酸形成的機(jī)制[30-31]。除了上述兩種說法以外，Jost等[32]提出乙酸也可由乙酰輔酶A水解酶水解乙酰輔酶A以及檸檬酸裂解酶裂解檸檬酸生成。

1.2 乙酸的分解代謝

乙酸在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)取決于胞外pH值（圖1）。在低pH值條件下（pH＜4.76），乙酸處于未解離（質(zhì)子化）狀態(tài)，可以通過水甘油孔通道蛋白（Fps1p）或通過簡單擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞[23]。但Mollapour等[33]卻發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母細(xì)胞被突然暴露在高質(zhì)量濃度乙酸（6 g/L）環(huán)境下時(shí)，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）會(huì)被迅速激活，使Fps1p磷酸化，這種磷酸化會(huì)導(dǎo)致Fps1p的內(nèi)吞和降解，阻止乙酸進(jìn)入細(xì)胞。未解離的乙酸一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，就會(huì)解離成乙酸根陰離子和質(zhì)子，質(zhì)子可以通過質(zhì)膜質(zhì)子泵ATP酶（Pma1p）或液泡質(zhì)子泵ATP酶（V-ATPase）被排出到細(xì)胞質(zhì)外，以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)pH值[34]。當(dāng)外界pH值高于4.76時(shí)，乙酸根離子主要通過兩個(gè)電中性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ady2p和Jen1p）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[35]。

進(jìn)入細(xì)胞的乙酸根陰離子以乙酸鹽的形式進(jìn)入丙酮酸脫氫酶旁路被代謝。乙酸鹽在乙酰輔酶A合成酶的催化下與輔酶A結(jié)合生成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A作為釀酒酵母體內(nèi)一種重要的輔因子，參與了包括TCA、GYC[25]、脂肪酸合成[36]、酯類化合物合成[32]和染色質(zhì)蛋白乙?；痆26]等細(xì)胞內(nèi)多種生化反應(yīng)。

1.3 乙酸代謝調(diào)控基因

釀酒酵母生成乙酸是多個(gè)基因共同調(diào)控的結(jié)果。目前對乙酸調(diào)控基因的研究主要集中在丙酮酸脫氫酶旁路途徑和甘油合成途徑（圖1），現(xiàn)對這兩條代謝通路的關(guān)鍵調(diào)控基因以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行介紹，并闡述其對乙酸的調(diào)控作用。

1.3.1 丙酮酸脫氫酶旁路途徑調(diào)控基因

丙酮酸經(jīng)過丙酮酸脫羧酶脫羧生成乙醛和二氧化碳，該反應(yīng)中的丙酮酸脫羧酶主要由PDC1和PDC5控制編碼，且該酶80%～90%的活性來源于Pdc1p[37]，而Wang Depei等[38]研究表明，PDC5才是完全實(shí)現(xiàn)丙酮酸脫羧酶活性的主導(dǎo)基因。PDC1被報(bào)道在厭氧條件下對酵母乙酸的生成影響不顯著[39]，但Curiel等[40]在有氧條件下敲除酵母的PDC1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸產(chǎn)量下降了57%。說明PDC1對乙酸的調(diào)控作用可能與氧氣有關(guān)。

乙醛在乙醛脫氫酶催化作用下被氧化為乙酸，并伴隨著NAD+還原成NADH。釀酒酵母中已鑒定出3 種編碼細(xì)胞質(zhì)乙醛脫氫酶的基因（ALD2、ALD3和ALD6）和2 種編碼線粒體乙醛脫氫酶基因（ALD4和ALD5）。ALD2與ALD3使用NAD+作為輔因子，其活性受到應(yīng)激脅迫誘導(dǎo)和葡萄糖抑制[41]。ALD6由Mg2+激活并優(yōu)先利用NADP+作為輔助因子，對葡萄糖和乙醇條件下酵母的生長發(fā)揮作用[42]。ALD5是編碼線粒體乙醛脫氫酶的一種次要基因，由K+激活，并利用NAD+和NADP+作為輔助因子，在電子傳遞鏈組分的調(diào)節(jié)或生物合成中發(fā)揮作用，并受滲透應(yīng)力誘導(dǎo)[43-44]。ALD4由K+激活，主要參與酵母在乙醇條件下的生長，對酵母在葡萄糖條件下的生長無明顯作用[45]。目前，尚不清楚是哪一種編碼乙醛脫氫酶的基因在乙酸調(diào)控方面占主導(dǎo)地位，不同的菌株背景和發(fā)酵條件下，基因表達(dá)情況也有所不同。在大部分果酒發(fā)酵過程中，ALD6主要負(fù)責(zé)酒精發(fā)酵過程中乙酸的生成，ALD3和ALD4的表達(dá)均受到葡萄糖的抑制[46-48]。在模擬葡萄汁發(fā)酵過程中，ALD6主要負(fù)責(zé)乙酸的合成，ALD5起輔助作用[49]。若刪除野生型菌株的一個(gè)或兩個(gè)拷貝的ALD6，可以使酒中乙酸產(chǎn)量分別降低為野生型的75%和40%，而ALD4可以部分補(bǔ)償ALD6缺失引起的乙酸產(chǎn)量降低[40,49]。在冰酒發(fā)酵的高滲透脅迫條件下，ALD3的高水平表達(dá)似乎有助于維持釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡和發(fā)酵過程中乙酸的產(chǎn)生[9,50]。

乙酸在乙酰輔酶A合成酶的催化下與輔酶A結(jié)合生成乙酰輔酶A，并伴隨著ATP水解。乙酰輔酶A合成酶受兩個(gè)基因編碼，分別是ACS1和ACS2。研究表明由ACS1編碼的酶與乙酸鹽的親和力約是ACS2編碼酶的30 倍，但ACS1的表達(dá)在厭氧條件下會(huì)受葡萄糖抑制，這種抑制作用會(huì)在ACS2缺失時(shí)被削弱[51]。Shiba等[52]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的ALD6過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致乙酸產(chǎn)量會(huì)升高，ACS1過表達(dá)導(dǎo)致乙酸產(chǎn)量降低，而當(dāng)二者同時(shí)過表達(dá)時(shí)，乙酸產(chǎn)量降低，說明ACS1對乙酸的調(diào)控作用比ALD6更顯著。

1.3.2 甘油合成途徑調(diào)控基因

酒精發(fā)酵初期，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)乙醇脫氫酶的活性被抑制，氧化還原反應(yīng)不平衡引發(fā)甘油的合成。甘油合成過程對NADH的需求增加，誘導(dǎo)釀酒酵母生成更多的乙酸以平衡甘油合成途徑中消耗的NADH[31]。磷酸二羥丙酮是合成甘油的底物，在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)NADH依賴性甘油-3-磷酸脫氫酶和甘油-3-磷酸酶催化后轉(zhuǎn)化為甘油。甘油-3-磷酸脫氫酶是甘油形成的關(guān)鍵限速酶，由兩個(gè)同源基因（GPD1和GPD2）編碼[53]。GPD1的表達(dá)受到滲透壓應(yīng)激誘導(dǎo)并通過高滲甘油信號（highosmolarity glycerol response，HOG）途徑調(diào)節(jié)[54]。GPD2的表達(dá)不受外部滲透壓變化的影響，但與厭氧條件下維持氧化還原的平衡有關(guān)[55]。Pigeau等[50,56]發(fā)現(xiàn)在冰酒發(fā)酵過程中，與稀釋后的冰酒汁相比，高糖脅迫條件下冰酒中乙酸含量增加了7 倍，釀酒酵母GPD1表達(dá)量增加了2.5 倍，但GPD2表達(dá)量變化不顯著。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄因子

除了上述的調(diào)控基因外，一些轉(zhuǎn)錄因子可通過調(diào)控編碼乙醛脫氫酶的基因或蛋白進(jìn)而調(diào)控乙酸的生成。Rsf2p是一種可以調(diào)節(jié)ALD6的轉(zhuǎn)錄因子[57]，但敲除菌株的RSF2對酵母乙酸生成無顯著影響[47]，說明RSF2對乙酸調(diào)控不具有主要作用。Aaf1p是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在葡萄酒發(fā)酵條件下定位于細(xì)胞核中[47]。Aaf1p可直接或者通過介導(dǎo)Ald6p調(diào)節(jié)ALD4和ALD6的轉(zhuǎn)錄水平，從而調(diào)節(jié)乙酸的生成。Walkey等[58]研究發(fā)現(xiàn)，AAF1敲除菌株產(chǎn)生的乙酸量比野生型菌株少39%左右，其效果比RSF2的敲除更顯著。Yap1p是一種控制釀酒酵母氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。氧化條件下的ChIP芯片全基因組定位分析表明，Yap1可直接與ALD5和ALD6基因的啟動(dòng)子相互作用，參與釀酒酵母乙酸的調(diào)控[59]。Cordente等[60]發(fā)現(xiàn)，YAP1突變的釀酒酵母表現(xiàn)出較低的乙酸產(chǎn)量和較低的乙醛脫氫酶活性。

研究表明，當(dāng)釀酒酵母細(xì)胞中編碼乙醛脫氫酶的5 個(gè)基因都被敲除時(shí)，該缺失菌株依舊可以產(chǎn)生乙酸[49]，說明還存在其他調(diào)控基因可通過影響乙醛脫氫酶活性進(jìn)而影響乙酸的生成，或者是除丙酮酸脫氫酶旁路外，可能還存在其他產(chǎn)生乙酸的途徑。因此，釀酒酵母乙酸代謝通路及其調(diào)控的關(guān)鍵基因，仍需進(jìn)一步探索和挖掘。

2 釀酒酵母乙酸代謝調(diào)控機(jī)制研究策略

為了更有效地調(diào)控釀酒酵母乙酸的生成，需要深入揭示酵母乙酸調(diào)控機(jī)制。釀酒酵母產(chǎn)乙酸特性是受多基因控制的數(shù)量性狀，是基因與基因、基因與環(huán)境互作的結(jié)果，每個(gè)基因都具有復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這給低產(chǎn)乙酸分子機(jī)制的解析提出了挑戰(zhàn)?？刹捎媒M學(xué)技術(shù)和數(shù)量性狀基因座（quantitative trait loci，QTL）定位技術(shù)挖掘調(diào)控釀酒酵母乙酸產(chǎn)量的關(guān)鍵基因，解析乙酸表型-基因型關(guān)系，既可明晰釀酒酵母調(diào)控乙酸代謝的分子機(jī)制，又能夠?yàn)榈彤a(chǎn)乙酸酵母菌株選育提供理論依據(jù)。

2.1 組學(xué)技術(shù)

組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為了解菌株的代謝途徑、尋找差異表達(dá)基因及生物標(biāo)志物提供了有力的分析平臺。利用下一代測序技術(shù)進(jìn)行測序比對，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)對基因及代謝物進(jìn)行定性定量，結(jié)合生物信息學(xué)分析對其進(jìn)行功能注釋及分類，尋找基因表達(dá)及代謝物豐度差異，進(jìn)而解析基因型與表型關(guān)系。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)通常用于比較不同組織或生理狀況下基因表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)與特定生理功能相關(guān)的基因，從而研究基因與相關(guān)代謝通路調(diào)控規(guī)律。轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)主要包括基于雜交的DNA微陣列技術(shù)、基于標(biāo)簽的基因表達(dá)系列分析和大規(guī)模平行測序技術(shù)、基于新一代高通量測序的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)。RNA-seq技術(shù)通過新一代測序技術(shù)對cDNA文庫進(jìn)行測序，對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行全方位的研究，無需進(jìn)行熒光標(biāo)記，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠、操作簡單方便，逐漸成為轉(zhuǎn)錄組研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。Baumann等[61]通過RNA-seq技術(shù)確定釀酒酵母與其高產(chǎn)辛酸改造菌株的差異表達(dá)基因，通過對這些基因進(jìn)行敲除和過表達(dá)，驗(yàn)證了RPL40B的過表達(dá)對辛酸的產(chǎn)生發(fā)揮了重要的作用。沈璐[62]利用RNA-Seq技術(shù)研究抗葡萄糖阻遏菌株乳源酵母Kluyveromyces marxianus246解阻遏的機(jī)制，通過對不同碳源的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，確定了MIG1的低表達(dá)使得半乳糖代謝途徑相關(guān)基因獲得適應(yīng)性進(jìn)化，從而具有抗葡萄糖阻遏作用。對釀酒酵母乙酸代謝機(jī)制的研究，也可利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)比較同一菌株不同時(shí)期或不同乙酸表型釀酒酵母菌株同一時(shí)期的基因表達(dá)，挖掘與乙酸產(chǎn)量密切連鎖的主效基因，揭示表型背后的分子機(jī)制。

代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)因基因或基因表達(dá)被擾動(dòng)而導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物、代謝途徑變化規(guī)律的學(xué)科。代謝組技術(shù)通常基于質(zhì)譜與氣相色譜、高效液相色譜等技術(shù)聯(lián)用對代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析[63]。代謝組學(xué)技術(shù)通常被用于確定生物體系代謝途徑，從代謝的水平上揭示物質(zhì)調(diào)控機(jī)制。Ogawa等[64]采用非靶向代謝組學(xué)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)研究酒花酵母的葡萄糖酸代謝，結(jié)果表明葡萄糖酸的代謝涉及到包括TCA循環(huán)和甘油脂代謝在內(nèi)的4 個(gè)代謝途徑，提出可基于這些途徑進(jìn)一步調(diào)控葡萄酒中的葡萄糖酸含量。依靠代謝組學(xué)能夠找到與乙酸相關(guān)的代謝通路，從而進(jìn)一步探究釀酒酵母的乙酸代謝途徑及調(diào)控機(jī)制。

利用轉(zhuǎn)錄組分析可以得到大量差異基因以及眾多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但難以確定關(guān)鍵調(diào)控途徑。代謝組分析可以反映表型狀態(tài)的變化，但無法解釋表型的基因機(jī)理。因此，越來越多學(xué)者選擇采用組學(xué)聯(lián)合的方法分析差異基因與差異代謝物的相關(guān)性，確定關(guān)鍵基因，構(gòu)建核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡釋生物學(xué)現(xiàn)象。Zhang Zhiyong等[65]采用代謝組學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）和釀酒酵母在蘋果酒中靜態(tài)發(fā)酵條件下的揮發(fā)性化合物含量及代謝途徑變化規(guī)律，分析表明馬克斯克魯維酵母糖酵解和乙醇合成途徑的相關(guān)基因都有很高的表達(dá)量，從而促進(jìn)了乙酸乙酯和相關(guān)酯的合成。Zhu Yuanyuan等[66]以轉(zhuǎn)錄組和代謝組研究木質(zhì)纖維素抑制劑對樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）的代謝機(jī)制影響，發(fā)現(xiàn)在抑制劑的作用下，畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)參與碳源代謝的基因表達(dá)顯著下調(diào)，氨基酸合成途徑基因表達(dá)顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合策略也可被應(yīng)用在研究釀酒酵母乙酸代謝的分子機(jī)制上，通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組測序獲得差異表達(dá)基因和差異代謝物，并計(jì)算差異基因和差異代謝物的相關(guān)性，構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，找出引起乙酸變化的關(guān)鍵作用基因，確定關(guān)鍵的調(diào)控通路。

2.2 數(shù)量性狀基因座定位

釀酒酵母乙酸產(chǎn)量是受多基因與環(huán)境共同調(diào)控的復(fù)雜數(shù)量性狀。如果能找到與乙酸產(chǎn)量密切連鎖的主效基因，將會(huì)對酵母乙酸調(diào)控機(jī)制的研究以及低產(chǎn)菌株的選育工作提供很大的幫助。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，復(fù)雜數(shù)量性狀主效基因的挖掘效率和成功率不斷提高[67-68]。解析數(shù)量性狀基因座的一般方式為：首先通過連鎖分析等方法從目標(biāo)物種的基因組上定位與目標(biāo)數(shù)量性狀間存在顯著相關(guān)關(guān)系的區(qū)段，即QTL；隨后在定位到的QTL區(qū)段內(nèi)通過篩選與鑒定，尋找數(shù)量性狀候選基因（quantitative trait gene，QTG）；采用基因置換、相互半合子分析（reciprocal hemizygosity analysis，RHA）等方法對候選基因進(jìn)行克隆鑒定；通過等位基因間的比對尋找引發(fā)該數(shù)量性狀改變的有效數(shù)量性狀核苷酸突變（quantitative trait nucleotide，QTN），最終對其分子機(jī)制進(jìn)行解析[67]。Offei等[69]以布拉氏酵母（Saccharomyces boulardii）與釀酒酵母為親本菌株，采用混合分離全基因組序列分析，對布拉氏酵母高乙酸產(chǎn)量基因進(jìn)行QTL定位，結(jié)合互惠半合子分析、等位基因置換、序列分析確定了布拉氏酵母候選基因sdh1F317Y、whi2S287*對高乙酸產(chǎn)量的重要作用。Marullo等[70]對兩株產(chǎn)乙酸量存在差異的親本菌株的后代采用高密度核苷酸微陣列進(jìn)行基因分型，并建立性狀與分子遺傳標(biāo)記之間的統(tǒng)計(jì)聯(lián)系，從而定位決定乙酸產(chǎn)量顯著差異的QTL，進(jìn)一步研究表明，該QTL僅在以天冬酰胺為主要氮源時(shí)才有效。

定位QTL的方法主要有構(gòu)建遺傳圖譜法、全基因組關(guān)聯(lián)分析法（genome-wide association study，GWAS）和分離群體分組分析法（bulked segregant analysis，BSA）。傳統(tǒng)的構(gòu)建遺傳圖譜法，需要對所有個(gè)體進(jìn)行基因分型和表型測定，時(shí)間長、成本高。GWAS涉及使用從種群或物種中采樣的遺傳多樣性個(gè)體識別遺傳變異和性狀之間的關(guān)聯(lián)[71]，具有更高的遺傳作圖分辨率，并能夠?qū)ξ锓N中存在的遺傳多樣性進(jìn)行更廣泛的采樣。GWAS在檢測人群中常見的遺傳變異方面最為有效，因此低頻的因果變異可能無法識別[72]。隨著高通量測序的發(fā)展，下一代測序技術(shù)為目標(biāo)性狀連鎖標(biāo)記及基因快速定位提供了有效手段，分離群體分組分析與全基因組重測序技術(shù)相結(jié)合（BSA-seq），具有所需樣本量少、成本低、效率高等特點(diǎn)，已成為QTL定位的主流方法。自1991年由Michelmore等報(bào)道以來[73]，BSA-seq技術(shù)在作物農(nóng)藝性狀[74]和酵母數(shù)量性狀[75-76]基因定位的研究中應(yīng)用十分廣泛。目前，BSA-seq技術(shù)已成功用于探索調(diào)控釀酒酵母耐受性[77]、發(fā)酵速率[78]、氮源利用[79]、甘油產(chǎn)量[80]、香氣合成[81]及微生物互作[82]等數(shù)量性狀的主效基因。因此，可利用BSA-seq策略挖掘果酒發(fā)酵過程中釀酒酵母乙酸產(chǎn)量性狀主效QTL，從而分析釀酒酵母調(diào)控乙酸生成分子機(jī)制。如圖2所示，首先篩選出兩株乙酸產(chǎn)量差異極顯著的釀酒酵母，形成后代雜合孢子，后代孢子是攜帶來自親本（紅色和藍(lán)色片段）遺傳物質(zhì)的嵌合體；對F2代進(jìn)行表型篩選，分別構(gòu)建低產(chǎn)乙酸混池和高產(chǎn)乙酸混池，對不同表型的子代混池樣本及親本進(jìn)行全基因組重測序，通過生物信息學(xué)分析實(shí)現(xiàn)QTL定位[67]。

圖2 基于BSA-seq技術(shù)定位釀酒酵母乙酸產(chǎn)量主效數(shù)量基因座的方法示意圖[67]Fig.2 Schematic diagram of the method for locating the major effect QTL of acetic acid production in S.cerevisiae based on BSA-seq technology[67]

3 低產(chǎn)乙酸釀酒酵母的選育方法

為了控制釀酒酵母產(chǎn)生乙酸，以往采取的措施主要是從自然發(fā)酵中篩選低產(chǎn)乙酸的菌株[83-84]。然而這種方式不僅消耗大量的人力和物力，而且所篩菌株性狀往往不夠理想，不能夠滿足現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)的需要。隨著釀酒酵母乙酸代謝機(jī)制研究的不斷深入，研究人員逐漸傾向于依靠誘變、雜交和代謝工程等功能菌種選育技術(shù)選育出優(yōu)良的低產(chǎn)乙酸酵母菌株，實(shí)現(xiàn)果酒乙酸的調(diào)控。

3.1 誘變育種

誘變育種是目前應(yīng)用最廣泛的菌種選育技術(shù)，主要是指采用物理和化學(xué)等誘變劑處理釀酒酵母，使其基因的突變率大幅提高，從而獲得具有特定功能菌株的育種技術(shù)。物理誘變包括紫外誘變與常壓室溫等離子體誘變技術(shù)，通過增大釀酒酵母菌株DNA的堿基錯(cuò)配率，進(jìn)而提高釀酒酵母的基因突變率。紫外誘變通過破壞菌株DNA雙鏈解旋和堿基配對，影響菌株DNA正常復(fù)制，形成突變體[85]。常壓室溫等離子體技術(shù)通過發(fā)射等離子體，造成菌株DNA損傷以及不完全修復(fù)，進(jìn)而形成可穩(wěn)定遺傳的突變株[86]。陳雪等[87]通過常壓室溫等離子體對釀酒酵母進(jìn)行誘變，得到一株低產(chǎn)揮發(fā)酸突變菌株，該菌株遺傳穩(wěn)定性好，釀造的冰酒揮發(fā)酸含量低，但導(dǎo)致其低產(chǎn)揮發(fā)酸的原因有待探究。

化學(xué)誘變是一種經(jīng)濟(jì)方便的育種方法，并且較物理誘變，采用不同化學(xué)誘變劑對染色體、基因等的誘變專一性更強(qiáng)[88]。張菡[89]以淺藍(lán)菌素為誘變劑處理釀酒酵母，從得到的淺藍(lán)菌素突變體中篩選出穩(wěn)定、高效的低產(chǎn)乙酸目標(biāo)菌株，ALD6的堿基突變可能是突變菌株低產(chǎn)乙酸的原因。Mizuno等[90]從釀酒酵母的2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）突變體中分離出具有低乙酸和高乙醇生產(chǎn)力的突變體2-DGR19，并且通過DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，ADH的高表達(dá)與ALD的低表達(dá)是導(dǎo)致該突變體具有這些特性的主要原因。

單一的誘變方式效率較低，且很少能得到性狀十分優(yōu)良同時(shí)能夠穩(wěn)定遺傳的菌株。因此，有些學(xué)者選擇采用物理誘變與化學(xué)誘變技術(shù)相結(jié)合的方式來提高篩菌效率。Kosugi等[91]通過紫外誘變分離耐2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol，2,4-DNP）的清酒酵母菌株，這些菌株顯示出高產(chǎn)蘋果酸和低產(chǎn)乙酸，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)低線粒體活性和高NADH/NAD+比率是導(dǎo)致兩種有機(jī)酸含量改變的原因。物理和化學(xué)誘變技術(shù)都是目前比較常見的育種技術(shù)，操作簡單、成本低。但酵母菌的基因結(jié)構(gòu)使得這種育種方法應(yīng)用起來有局限性，因?yàn)榇蟛糠值慕湍富蚨加? 個(gè)以上的拷貝，隱性突變的選擇很困難[92]，而且長期使用誘變劑會(huì)導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐受性。

3.2 雜交育種

雜交育種是指將不同優(yōu)良表型的親本菌株進(jìn)行雜交，從而得到具有雙親優(yōu)良性狀雜交種的育種方法。雜交一般可通過4 種方式實(shí)現(xiàn)：孢子雜交、罕見雜交、大規(guī)模雜交、原生質(zhì)體融合。孢子雜交類似于自然交配，由具有不同交配型的孢子接合，雜交成功率大，遺傳穩(wěn)定性好[93]，但實(shí)驗(yàn)中無法對孢子的表型進(jìn)行表征，形成的雜交種可能會(huì)丟失親本的優(yōu)良表型[94]。大規(guī)模雜交使用大量來源于不同親本的單倍體進(jìn)行隨機(jī)交配，可以以快速且相對容易的方式獲得多種有益突變累加在一起的表型。Steensels等[95]通過從301 株酵母菌株中選擇3 株具有遺傳多樣性的釀酒酵母作為親本菌株，以果香化合物為標(biāo)準(zhǔn)對其142 個(gè)分離孢子進(jìn)行篩選，共選擇17 個(gè)單倍體進(jìn)行雜交，最終獲得高產(chǎn)乙酸異戊酯的雜交菌株H44，乙酸異戊酯產(chǎn)量比親本菌株（Y354和Y397）提高了152%和145%。罕見雜交是指當(dāng)二倍體酵母菌株交配型位點(diǎn)的雜合性自發(fā)消失時(shí)，該酵母可與其互補(bǔ)的酵母菌株雜交，這種方式交配率極低，往往需要選擇性標(biāo)記分離雜種。原生質(zhì)體融合包括去除親本細(xì)胞壁、融合原生質(zhì)體、新細(xì)胞壁合成，這種方法不需要考慮菌株的產(chǎn)孢及交配能力，并且形成的雜種基因組具有較低的穩(wěn)定性[96]。Bellon等[97]將釀酒酵母與低產(chǎn)乙酸的貝酵母（Saccharomyces bayanus）進(jìn)行種間雜交獲得雜交酵母，兩種雜交種產(chǎn)生的乙酸水平約為釀酒酵母的65%，并可用于生產(chǎn)具有特征風(fēng)味與香氣的葡萄酒。

酵母菌雜交育種也存在一定局限性，主要是由于酵母菌的多倍體基因排列，使得自然界中能形成孢子的菌株出現(xiàn)幾率很小，還有一些特殊的酵母菌屬間雜交不會(huì)將結(jié)合子的理想特性傳遞給子代，另外，能夠被交換或傳遞到子代、結(jié)合子上的理想性狀特點(diǎn)也是有限的。

3.3 代謝工程育種

代謝工程是近年來發(fā)展迅速的新興學(xué)科領(lǐng)域，能夠突破物種間的障礙，最大限度地定向構(gòu)造菌株。代謝工程通過對釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)乙酸代謝途徑進(jìn)行有目的地修飾和改造，從而改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建低產(chǎn)乙酸的代謝途徑。隨著對控制乙酸產(chǎn)量主效基因的挖掘以及釀酒酵母乙酸代謝調(diào)控機(jī)制研究的深入，運(yùn)用代謝工程手段定向構(gòu)造低產(chǎn)乙酸酵母菌株已成為了研究熱點(diǎn)（表1）。Shi Wenqi等[98]以釀酒酵母為研究對象，通過引入異源醇乙酰轉(zhuǎn)移酶過表達(dá)ACS1和ALD6，并刪除負(fù)責(zé)丙酮酸和乙酰輔酶A線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的基因（POR2、MPC2、PDA1），以此降低乙酸含量、提升乙酸乙酯的產(chǎn)量。Eglinton等[99]通過構(gòu)造ALD6缺失型菌株，使得乙酸產(chǎn)量減少至原來的1/3，但也導(dǎo)致發(fā)酵速率減慢以及一些次級代謝產(chǎn)量降低。

表1 代謝工程對釀酒酵母乙酸產(chǎn)量和發(fā)酵特性的影響Table 1 Effect of metabolic engineering on acetic acid production and fermentation characteristics of S.cerevisiae

雖然通過敲除或過表達(dá)乙酸合成途徑中的基因可以達(dá)到降低乙酸含量的目的，但是這種方式往往會(huì)影響菌株的正常生長及釀酒性能。針對這一問題，可以考慮采用逆向代謝工程進(jìn)行低產(chǎn)乙酸釀酒酵母的選育，即首先確定乙酸產(chǎn)量的關(guān)鍵基因或特定的環(huán)境因子，然后通過遺傳修飾或改變環(huán)境，使低產(chǎn)乙酸表型在特定生物中表達(dá)[103]。用此手段構(gòu)造的菌株，僅攜帶與低產(chǎn)乙酸相關(guān)的有利突變，并且保留了野生型菌株的優(yōu)良性狀。

4 結(jié)語

釀酒酵母代謝是果酒酒精發(fā)酵過程中乙酸生成的主要原因，該過程受多個(gè)基因的調(diào)控?；诮M學(xué)及BSAseq技術(shù)進(jìn)一步確定釀酒酵母控制乙酸產(chǎn)量的主效基因，揭示酵母乙酸的代謝調(diào)控機(jī)制，對選育出優(yōu)良的低產(chǎn)乙酸酵母菌株、實(shí)現(xiàn)果酒乙酸的精細(xì)化調(diào)控有重要意義。目前，針對發(fā)酵過程中乙酸含量的控制方法多集中于從自然環(huán)境中篩選低產(chǎn)乙酸的菌株或采用轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因手段改造釀酒酵母。篩選、誘變和雜交都是采用非轉(zhuǎn)基因手段從龐大的細(xì)胞池中篩選具有特定表型的酵母細(xì)胞，而細(xì)胞池中僅有少數(shù)表現(xiàn)出有益突變的細(xì)胞，通過多輪誘變、誘變后定向進(jìn)化、雜交前菌株表型篩選可以幫助縮小范圍同時(shí)靶向特定表型，但這些操作也可能造成其他表型丟失，導(dǎo)致突變株或雜交株表現(xiàn)弱于原始株。代謝工程可以通過敲除或過表達(dá)乙酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因達(dá)到降低乙酸產(chǎn)量的目的，但這種基于轉(zhuǎn)基因方式制作的食品可能會(huì)使消費(fèi)者難以接受。因此，未來仍需要探索更加合適的菌種選育方式，以獲取更加適用于工業(yè)及商業(yè)需求的酵母菌株。