氣態(tài)臭氧結合微孔氣調包裝對楊梅品質和抗氧化性能的影響

雷婷婷，殷 誠，孫陟巖，錢 靜

（江南大學機械工程學院，江蘇 無錫 214122）

楊梅（Myrica rubraSieb.et Zucc.）是我國重要的亞熱帶水果品種，其酸甜適中、營養(yǎng)豐富，同時富含酚類等多種天然活性成分，這些活性成分具有抗癌、抗氧化、減肥和神經保護特性，具有很高的營養(yǎng)價值和食療作用[1-2]。楊梅成熟期約在每年的6、7月，恰逢梅雨季節(jié)，因其組織含水率高且無堅實外果皮保護，在采摘和運輸中易受機械損傷，且采后活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝平衡易被破壞，導致楊梅在常溫下僅可保存1～2 d[3-4]。

目前，常見的楊梅采后保鮮技術有熱處理[5]、氣調保鮮[6]、化學保鮮[7]、電場保鮮[8]等方法。其中氣調包裝（modified atmosphere packaging，MAP）被廣泛用于楊梅[6]、樹莓[9]和葡萄[10]等水果的保鮮。然而MAP中所用薄膜CO2的擴散速度比O2快2～8 倍，這種特性不適合呼吸頻率高的果蔬，甚至在低O2和高CO2環(huán)境下，厭氧和產生異味是常見的現象[11-12]。為解決這些問題，微孔氣調包裝（perforated MAP，P-MAP）被用于果蔬的保鮮。Rodriguez等[13]研究表明，以孔徑3 mm、孔數為2 個/1 856 cm2的低密度聚乙烯薄膜包裝藍莓，第7天時包裝內可通過呼吸作用被動產生穩(wěn)定氣體比例，有效抑制藍莓的腐爛；Liguori等[14]使用穿孔定向聚丙烯（polypropylene，PP）薄膜對葡萄進行包裝，包裝盒內初始CO2和N2體積分數分別為20%和80%，在整個貯藏期間包裝內氣體比例始終處于動態(tài)平衡，顯著降低了葡萄的腐爛率。

臭氧是延長食品保質期的綠色冷保鮮技術，可以通過刺激細胞內的ROS代謝系統來提高植物的抗逆性，從而促進抗氧化酶的合成[15]。Yeoh等[16]用臭氧氣體（ozone gas，OG）處理鮮切木瓜20 min，發(fā)現其總酚含量比未處理的對照組增加了10.3%。此外，研究人員已成功將臭氧預處理與MAP相結合，以降低呼吸速率并刺激抗氧化防御系統[17]，延長了蘑菇[18]、葡萄[19]和樹莓[20]等新鮮果蔬的貨架期。

本研究旨在基于上述研究探討臭氧預處理協同P-MAP對楊梅的保鮮效果，篩選楊梅保鮮的最佳臭氧濃度和氣體比例，并采用能夠預測包裝系統內氣體濃度的數學模型來推導實現包裝內氣體組成平衡的微孔參數，最后探討臭氧預處理結合P-MAP對楊梅品質和抗氧化性能的影響，為開發(fā)和完善楊梅保鮮技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用大浮楊梅于江蘇無錫太湖采摘，采摘時排除任何有病害的個體，并在采后3 h內運回實驗室。挑選無機械損傷、無病蟲害、大小均勻、成熟度相當的楊梅作為實驗材料。

濃鹽酸、乙二胺四乙酸、30%過氧化氫、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α-萘胺、硝酸鉀、丙酮、四氯化鈦、濃氨水、硫酸、磷酸、紅菲咯啉、三氯化鐵、乙二胺四乙酸二鈉、蛋氨酸、氮藍四唑國藥集團化學試劑有限公司；交聯聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮 北京伊諾凱科技有限公司；二硫蘇糖醇上海百靈威化學技術有限公司；無水甲醇、L-抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PLMAP-5包裝系統（基于加壓惰性氣體和激光微孔膜的抑菌MAP）無錫一網激光設備有限公司；V-320多功能MAP一體機 蘇州工業(yè)園區(qū)德森包裝機械有限公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津國際貿易公司；PAL-BX/ACIDF5糖酸度一體機 日本ATAGO公司；GY-5B數顯水果硬度計 杭州艾普儀器設備有限公司；C650B頂空氣體分析儀 濟南蘭光機電技術有限公司；LC-LX-HR165A高速冷凍離心機 上海一恒科學儀器有限公司；GN-S2S臭氧機 安徽杰禹電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臭氧處理和MAP實驗

選擇挑選后的楊梅隨機分成6 組，3 組進行MAP處理，MAP的處理條件分別為：1）5% O2+15% CO2+80% N2（MAP 1）；2）10% O2+10% CO2+80% N2（MAP 2）；3）5% O2+10% CO2+85% N2（MAP 3）；3 組進行OG處理，處理時間為30 min，處理濃度分別為18.3、36.7、54.9 mg/m3。采用PP材質的MAP盒（183 mm×133 mm×80 mm），每盒裝入（100±1）g楊梅后以聚對苯二甲酸乙二醇酯/聚丙烯（polyethylene terephthalate/polypropylene，PET/PP）聚合膜（243.39 cm2）進行熱封。將包裝好的楊梅置于（4±1）℃、相對濕度90%～95%的環(huán)境下貯藏，在貯存的第5天測定其理化指標，以未進行臭氧處理、初始氣體為空氣的普通包裝作為對照組（CK）。

1.3.2 微孔參數的確定

呼吸速率遵循Benkeblia等[21]的方法進行測定，基于米氏方程通過多重線性回歸分析推出呼吸模型。根據氣調實驗得到的楊梅最佳氣體比例，將呼吸模型與硬盒包裝微孔膜MAP模型[22]聯立，可以獲得使楊梅包裝內氣體組成維持動態(tài)平衡的微孔參數（表1）。考慮到激光機的最佳加工效果，選取孔徑為100 μm的微孔進行實驗。

表1 楊梅MAP膜微孔參數Table 1 Number and size of perforations in MAP film for Chinese bayberry

將楊梅置于MAP盒中，每盒裝入（100±1）g楊梅后充入10% O2+10% CO2+80% N2并使用微孔PET/PP復合膜熱封。不同包裝處理組參數如下：1）孔徑100 μm，孔數為0，記為MAP P0；2）孔徑100 μm，孔數為2，記為MAP P2；3）孔徑100 μm，孔數為4，記為MAP P4；將包裝好的楊梅置于（4±1）℃、相對濕度90%～95%的環(huán)境下貯藏，每天測定一次包裝頂部空間成分。

1.3.3 臭氧預處理結合微孔MAP實驗

將楊梅置于MAP盒中，每盒裝入（100±1）g楊梅，處理方法如下：用18.3 mg/m3的OG對楊梅處理30 min，立即進行MAP并以微孔膜熱封（OG+MAP P2）；不經過臭氧處理直接進行MAP并以微孔膜熱封（MAP P2）；以未進行臭氧處理、初始氣體為空氣的普通包裝作為對照組（CK）。將包裝好的楊梅置于（4±1）℃、相對濕度90%～95%的環(huán)境下貯藏，在貯藏期間每天測定一次楊梅理化指標。

1.3.4 包裝內氣體成分的測定

使用C650B頂空氣體分析儀監(jiān)測包裝的頂部空間成分。將氣體分析儀針頭通過薄膜上的硅膠隔膜插入包裝內測定O2和CO2的體積分數[21]。每組3 個平行，結果取平均值。

1.3.5 楊梅品質指標的測定

腐爛指數的測定參考Yang Zhenfeng等[23]的方法并稍作修改，以楊梅表面出現腐爛斑點作為腐爛判斷的依據。按照腐爛面積將腐爛級別劃分為4級：0級，無腐爛；1級，腐爛面積小于1/4；2級，腐爛面積占1/4～1/2；3級，腐爛面積大于1/2；統計每組24 個楊梅腐爛情況，每組3 個平行實驗組，并按式（1）計算腐爛指數。

使用硬度計在楊梅赤道均勻間隔的兩個點測定硬度，單位為N，每組3 個平行實驗組，結果取平均值。

采用質量差法根據式（2）計算楊梅質量損失率。

式中：m0為樣品的初始質量/g；mi為每次測定時樣品的質量/g。

總可溶性固形物（total soluble solids，TSS）質量分數和可滴定酸（titratable acidity，TA）質量分數使用糖酸度一體機測定。TSS測定液通過均質器勻漿后過濾得到，取1 mL TSS測定液用50 mL去離子水稀釋后獲得TA測定液。

總酚、花青素和黃酮類化合物的含量按照曹建康等[24]的方法進行測定。

1.3.6 ASA含量的測定

ASA含量的測定參考文獻[24]，以ASA為標準品構建標準曲線，得到回歸方程：y＝0.004 2x+0.055 8，R2＝0.994 2，單位為mg/100 g。

1.3.7 丙二醛、H2O2與·含量的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用Wang Lei等[25]的方法進行測定，單位為nmol/g。

H2O2含量的測定參考文獻[24]，以30%分析純H2O2為標準品構建標準曲線，得到回歸方程：y＝0.254 9x+0.017 6，R2＝0.999 3。

1.3.8 ROS代謝相關酶活力的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參考文獻[24]。以每分鐘每克果蔬組織（鮮質量）的反應體系抑制氮藍四唑（nitro blue tetrazolium,NBT）光還原50%為1 個SOD活力單位；以每克果蔬組織（鮮質量）每分鐘吸光度增加1為1 個POD活力單位。

1.4 數據統計分析

實驗數據采用Excel 2019軟件進行整理，采用SPSS Statistics 26軟件進行單因素方差分析，用Duncan多重比較法進行顯著性差異分析，以P＜0.05為差異顯著，采用Origin 2022b軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式對4 ℃下貯藏5 d楊梅品質指標的影響

在貯藏的第5天，MAP處理組中楊梅的腐爛指數均在11%以下，其中MAP 2組僅為2.08%，而對照組高達18.8%（表2）。MDA是膜脂氧化的中間產物，其含量是反映衰老的重要指標。氣調處理均能減少MDA的積累，其中MAP 2組和MAP 3組包裝內楊梅的MDA含量顯著低于MAP 1組和對照組（P＜0.05）。這說明適宜比例的氣調可以抑制腐爛的發(fā)生和膜脂氧化，延緩楊梅衰老和變質。

表2 不同MAP對4℃下貯藏5 d楊梅品質指標的影響Table 2 Effects of different MAP treatments on the quality of Chinese bayberry stored at 4℃ for 5 d

總酚、花青素和黃酮類化合物是植物體內的非酶類抗氧化物質，參與自由基的清除[27]。由表2可知，MAP 2組楊梅總酚、花青素和黃酮類化合物的含量顯著高于其他處理組和對照組（P＜0.05），保持了較高的抗氧化活性。

OG處理組中非酶類抗氧化物質均維持在較高水平，且MDA含量均高于對照組（表3）。OG處理的楊梅有較低的腐爛指數，其中18.3 mg/m3的臭氧處理顯著降低了楊梅的腐爛指數（P＜0.05）。

表3 不同濃度OG處理對4℃下貯藏5 d楊梅品質指標的影響Table 3 Effects of different OG concentrations on the quality of Chinese bayberry stored at 4℃ for 5 d

綜上可知，MAP 2（10% O2+10% CO2+80% N2）和18.3 mg/m3分別是維持楊梅品質的最佳氣體比例和臭氧濃度，因此以這兩個參數結合微孔膜處理楊梅，以驗證臭氧預處理協同P-MAP對楊梅在4 ℃下的保鮮效果。

2.2 不同微孔參數對包裝內氣體體積分數的影響

如圖1所示，初始O2和CO2的體積分數均為10%。整個貯藏期間，MAP P0的O2體積分數不斷下降，CO2體積分數不斷上升，貯藏末期CO2體積分數已接近水果貯藏的發(fā)酵閾值20%[28]。而MAP P4中更多的穿孔增強了通過膜的氣體交換[29]，導致包裝內O2體積分數不斷上升，CO2體積分數不斷下降。MAP P2中CO2和O2在整個貯藏期間均處于9%～12%的體積分數區(qū)間，接近楊梅貯藏的最佳氣體比例。綜上可知，孔數為2、孔徑為100 μm的微孔膜可以使楊梅包裝內氣體組成處于動態(tài)平衡，且與數學模型推導的孔參數（表1）趨于一致。

圖1 不同孔數下楊梅在4℃貯藏7 d時MAP內O2（A）和CO2（B）體積分數的變化Fig.1 Evolution of O2 (A) and CO2 (B) concentrations in MAP with different numbers of perforations of bayberry during storage at 4℃ for up to 7 d

2.3 OG+MAP P2處理對楊梅腐爛指數的影響

與對照組相比，MAP P2和OG+MAP P2處理對楊梅有一定的保鮮效果，所有實驗組在第1天均未腐爛，對照組和MAP P2組楊梅分別在第4天和第6天開始腐爛，并且隨著時間的延長，腐爛現象不斷加劇（圖2）。OG+MAP P2處理組在第7天出現輕微腐爛，但在可接受的腐爛范圍內。在整個貯藏期間，OG+MAP P2處理組楊梅的腐爛指數顯著低于MAP P2處理組和對照組（P＜0.05），楊梅的無霉保質期被延長至8 d。

圖2 OG＋MAP P2處理對楊梅在4℃貯藏期間腐爛指數的影響Fig.2 Effect of OG+MAP P2 treatment on decay index of Chinese bayberry stored at 4℃

2.4 OG+MAP P2處理對楊梅硬度及TSS、TA、ASA含量的影響

硬度是判斷楊梅新鮮度的重要依據。在貯藏期間楊梅的硬度不斷下降（圖3A），這主要是由于在收獲后楊梅仍會繼續(xù)成熟，細胞壁多糖的降解會導致果實逐漸軟化[30]。如圖3A所示，兩處理組均能延緩楊梅硬度的下降，在貯藏前期，OG+MAP P2處理組的楊梅硬度顯著高于MAP P2組和對照組（P＜0.05），這與水果暴露在臭氧后細胞壁多糖的降解減緩有關[31]。Selma等[32]在對哈密瓜進行OG處理后也觀察到了硬度下降減緩的現象。

圖3 OG+MAP P2處理對楊梅在4℃貯藏期間硬度（A）及ASA（B）、TSS（C）、TA（D）水平的影響Fig.3 Effect of OG+MAP P2 treatment on firmness (A) and ASA (B),TSS (C) and TA (D) contents in Chinese bayberry stored at 4℃

ASA是水果營養(yǎng)價值的重要組成部分。楊梅ASA含量在整個貯藏期間呈持續(xù)下降的趨勢（圖3B），這是因為果實中含有促ASA氧化的酶，導致ASA不斷氧化而含量下降[33]。對照組楊梅的ASA含量顯著低于各處理組（P＜0.05），其中OG+MAP P2處理組楊梅的ASA含量最高，主要是由于臭氧可通過氧化分子產生應激，刺激天然植物防御機制，并通過增加細胞中的ASA等抗氧化化合物的合成和積累來維持ASA含量，且臭氧處理可抑制ASA氧化酶的活性[34]，因此OG+MAP P2處理組ASA含量下降的速度低于對照組，臭氧對ASA含量下降的抑制作用在樹莓[35]貯藏保鮮中也已得到證實。

TSS和TA含量與水果風味密切相關，可指示水果成熟和衰老的程度[36]。隨著貯藏時間的延長，所有包裝內楊梅的TSS和TA質量分數都呈現相同的下降趨勢（圖3C、D），這是因為在貯藏過程中TSS和TA作為呼吸底物被不斷消耗，以維持衰老過程中的正常呼吸[37]。處理組楊梅維持較高的糖酸度，其中OG+MAP P2處理組和MAP P2組的TSS和TA質量分數顯著高于對照組（P＜0.05），貯藏末期OG+MAP P2處理組具有最高的TSS和TA質量分數。說明氣調和臭氧處理均可抑制楊梅的呼吸，且兩者協同處理抑制效果更顯著，這可能是因為呼吸下降減少了TSS和TA的消耗，這與Chen Junran等[17]對青椒的研究結果一致。

2.5 OG+MAP P2處理對楊梅總酚、花青素和黃酮類化合物含量的影響

總酚、花青素和黃酮類化合物具有較強的抗氧化和自由基清除能力，其含量能夠反映楊梅的抗氧化活性[20]。在貯藏期間，所有實驗組楊梅的黃酮類化合物和總酚含量都顯示出不同程度的下降趨勢（圖4A、C），兩個處理組其含量的下降速率均減緩。這一緩慢下降趨勢可歸因于包裝內低氧的環(huán)境保護了楊梅中酚類化合物免于被氧化，且氣態(tài)臭氧可以作為酚類化合物生物合成的激發(fā)子[19]，從而增加總酚含量。OG+MAP P2處理組楊梅總酚和黃酮類化合物含量顯著高于MAP P2組和對照組（P＜0.05）。說明臭氧協同MAP P2處理增強了對楊梅非酶類抗氧化物質的保護，Yeoh等[16]在對鮮切木瓜進行氣態(tài)臭氧處理時也得到了類似的結果。

圖4 OG＋MAP P2處理對楊梅在4℃貯藏期間總酚（A）、花青素（B）和黃酮類化合物（C）含量的影響Fig.4 Effect of OG+MAP P2 treatment on the contents of total phenols (A),anthocyanins (B) and flavonoids (C) in Chinese bayberry stored at 4℃

花青素是水果保持鮮艷、紅色的主要成分。收獲后，楊梅的色素繼續(xù)合成，花青素含量在貯藏期間先上升后降低，且不同實驗組的達峰時間不同。OG+MAP P2和MAP P2處理組中楊梅花青素含量不斷上升，分別在第6天和第7天出現峰值后下降（圖4B）。對照組楊梅花青素含量先略微上升，第4天后開始下降，在之后的整個貯藏期內均顯著低于兩處理組（P＜0.05）。Pinto等[20]對小漿果的研究發(fā)現，花青素的保存得益于MAP、低溫和臭氧暴露誘導的非生物脅迫。因此，對照組包裝內高氧環(huán)境和未經OG處理可能是花青素含量低于處理組的原因。此外，在處理組中觀察到花青素含量急劇下降的現象，這是因為臭氧作為強氧化劑，在貯藏后期會導致花青素氧化降解，從而導致其含量減少。在其他研究中也觀察到類似的結果，Chen Cunkun等[38]研究發(fā)現，臭氧處理的草莓花青素含量在21～28 d之間迅速下降，而對照組卻基本保持不變。

2.6 OG+MAP P2處理對楊梅H2O2、·含量和POD、SOD活力的影響

H2O2和·是組織內ROS代謝失調的主要產物，其積累會導致果蔬的氧化損傷在成熟和老化過程中不斷增強。整個貯藏期間，楊梅的H2O2和·含量整體均呈上升的趨勢，OG+MAP P2處理組的H2O2含量在貯藏前5 d出現明顯的下降趨勢，這可能與OG+MAP P2處理誘導ROS代謝相關酶活性的上升有關[17]。各處理組楊梅的H2O2和·含量均顯著低于同時間的對照組，其中OG+MAP P2處理組表現出更顯著的ROS累積抑制（P＜0.05），在貯藏的第8天，對照組楊梅的H2O2和·含量比OG+MAP P2處理組分別高13%和22%。

POD是果蔬體內普遍存在且活性較高的氧化還原酶，與SOD等共同組成植物的酶促ROS清除系統[27]。各處理組楊梅P O D 活力在貯藏期間均先略微上升后下降，對照組P O D 活力的下降速度由快轉慢（圖5C）。POD活力越高，越容易從組織中清除H2O2。各處理組的楊梅POD活力在整個貯藏期間均顯著高于對照組（P＜0.05）。貯藏8 d后，OG+MAP P2處理組的POD活力分別是MAP P2組和對照組的1.26 倍和1.42 倍，其對H2O2的清除能力增強。這是因為OG和MAP都可以增強酶促清除系統[15]，OG處理能快速誘導果實中POD活力的升高，但是隨著貯藏時間的延長，POD活力會出現迅速降低的變化趨勢。陳存坤等[39]也觀察到OG處理的草莓POD活力具有先升高后下降的趨勢，且處理組的POD活力顯著高于對照組，這一結果也得到了Bortolin等[40]研究的佐證。

圖5 OG＋MAP P2處理對楊梅在4℃貯藏期間H2O2（A）、·含量（B）和POD（C）、SOD（D）活力的影響Fig.5 Effect of OG+MAP P2 treatment on the contents of H2O2 (A)and superoxide anion (B) and the activities of POD (C) and SOD (D) in Chinese bayberry stored at 4℃

SOD活力在貯藏期間整體呈下降趨勢，OG+MAP P2處理組在第4～6天略微上升（圖5D），這與Sarkar等[41]發(fā)現OG可以誘導SOD基因表達的研究結果一致。各處理組中楊梅的SOD活力均高于對照組，其中OG+MAP P2處理組中SOD活力最高，第8天時是對照組的1.9 倍，提高了組織對·的清除能力[42]。Chen Junran等[17]也發(fā)現OG+MAP處理可以保持較高的SOD活性，延緩鮮切青椒的成熟和衰老進程。綜上可知，OG+MAP P2處理提高了POD和SOD活力，進而減少了H2O2和·在組織內的積累（圖5A、B），減輕了ROS對機體的損傷。

3 結論

采后保質期短是制約楊梅產業(yè)發(fā)展的瓶頸，本研究結果顯示，微孔MAP和臭氧處理均能顯著抑制楊梅采后腐爛的發(fā)生，并能維持其較高的抗氧化性能，且二者協同處理對楊梅表現出了更好的保鮮效果。這主要體現在OG+MAP P2處理減緩了楊梅硬度的下降，減少了TSS、TA和ASA的損失，維持了較高的總酚、花青素和黃酮類化合物等非酶類抗氧化物質的含量；此外，OG+MAP P2處理的楊梅的POD和SOD活力在第8天時分別是對照組的1.42 倍與1.9 倍，酶活力的提高增強了楊梅對ROS的清除能力，從而減少了H2O2和·的積累。OG+MAP P2處理將楊梅無霉保質期延長到8 d。因此，OG+MAP P2處理可以作為一種有效的復合保鮮技術應用于楊梅的采后貯藏，以防止楊梅的品質退化，延長其貨架期。