石斛基因組DNA提取方法比較研究

潘映秋　洪亮　盧啟寰　李兆奎　夏慧麗

摘 要：目的：比較3種基因組DNA提取試劑盒對(duì)提取富含多糖多酚類物質(zhì)的鐵皮石斛和霍山石斛鮮葉及凍葉的提取效果。方法：對(duì)提取的DNA進(jìn)行純度及產(chǎn)率檢測(cè)、電泳質(zhì)量分析及ITS2 PCR擴(kuò)增效率檢測(cè)。結(jié)果：市售基于蛋白酶K消化法的試劑盒不適用于石斛DNA提??；基于改良CTAB法的試劑盒更適用于需要較高DNA模板量的石斛鮮葉的DNA提?。换诟牧糞DS法的試劑盒更適用于石斛凍葉的DNA提取，該法提取的鮮葉DNA完整性最佳，更適用于對(duì)DNA完整度要求較高的DNA大片段的分析研究。結(jié)論：基于改良CTAB法和改良SDS法的試劑盒提取的石斛鮮葉及凍葉的基因組DNA均適用于常規(guī)分子檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：石斛；DNA提取方法；SDS法；CTAB法

石斛屬為蘭科植物，約有1 600多種[1]，其中鐵皮石斛和霍山石斛具有重要的藥用和食療價(jià)值，在浙江省、安徽省和云南省等地有著悠久的作為食品原料食用的歷史，主要方法為即食、煲湯、入菜、榨汁、泡茶、傳統(tǒng)方式泡酒等[2]。雁蕩山鐵皮石斛、宣城鐵皮石斛、武義鐵皮石斛、霍山石斛等近年來(lái)陸續(xù)成為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。石斛種類繁多，多種同屬植物形態(tài)差異不顯著，但價(jià)格差距極大，導(dǎo)致鐵皮石斛和霍山石斛市場(chǎng)上使用同屬植物制成的偽品以次充好、摻假充真的情況屢禁不止[3-4]。因此，靈敏、快速、有效的石斛檢測(cè)方法，對(duì)于規(guī)范石斛市場(chǎng)，保護(hù)石斛的藥用和食用安全尤為重要。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子鑒偽以其高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)植物源性成分鑒定中的應(yīng)用日益廣泛，基因組DNA的有效提取是成功開展分子鑒定的前提[5-6]。植物基因組DNA提取方法有很多，但不同植物存在多種不同比例的代謝物質(zhì)，導(dǎo)致了同一提取方法在不同植物中的適用性存在差異[7-9]。相較其他植物，石斛屬植物含有更高比例的多糖、多酚等代謝產(chǎn)物[10]，多糖類物質(zhì)特性類似DNA，在富含多糖的石斛屬基因組提取的過程中不可避免地伴隨著大量DNA損失，導(dǎo)致DNA產(chǎn)率下降，而酚類物質(zhì)則可與DNA產(chǎn)生不可逆的結(jié)合，增加后續(xù)洗脫的黏度，導(dǎo)致DNA純度下降，影響分子檢測(cè)中酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)檢測(cè)的失敗[11]。目前，已有不少針對(duì)石斛基因組DNA提取方法的研究報(bào)道，主要為建立在SDS法和CTAB法基礎(chǔ)上的改良SDS法和改良CTAB法[12-14]。但這些方法需要自行配置多種溶液、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣，同一方法經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)室改良，相互之間存在操作步驟和使用試劑的差異，無(wú)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作[15-17]。此外，大部分研究都是選擇石斛鮮葉進(jìn)行核酸抽提，但在實(shí)際檢測(cè)過程中樣品可能會(huì)涉及凍存甚至反復(fù)凍融，不同核酸提取方法對(duì)凍融樣品的核酸提取效果亦有待研究探討[18-19]。

目前，市售DNA提取試劑盒技術(shù)已非常成熟，經(jīng)不斷的改良，其提取DNA成本大大下降、操作步驟更簡(jiǎn)便、操作流程更規(guī)范、提取效率更高、試劑質(zhì)量更可控，更能保障DNA提取質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性。鑒于石斛DNA抽提受多糖、多酚等影響的特殊性且樣品保存過程中可能會(huì)存在凍融情況，本研究以鐵皮石斛和霍山石斛鮮葉及凍葉為材料，應(yīng)用3種基于不同原理的DNA基因組提取試劑盒對(duì)其進(jìn)行抽提，比較三者抽提石斛鮮葉和凍葉DNA的能力，旨在為石斛屬基因組DNA提取提供更穩(wěn)定、更便捷、更高效的試驗(yàn)方法，有助于為后續(xù)分子生物學(xué)研究提供穩(wěn)定可靠的核酸來(lái)源，也為其他同類植物的DNA提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 主要試劑 基因組DNA小量制備試劑盒（UElandy）、新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（Bioteke）、植物基因組DNA提取試劑盒（DHelix）、TaqTM Hot Start Version（Takara）、S3大片段卡夾（Bioptic）、S2標(biāo)準(zhǔn)卡夾（Bioptic）；ITS2F（5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3） 、ITS3R （5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3），引物由生工生物工程（上海）有限公司負(fù)責(zé)合成。

1.1.2 材料 鐵皮石斛和霍山石斛，分別采自浙江樂清和安徽霍山，經(jīng)臺(tái)州市藥品檢驗(yàn)研究院鑒定，取其葉用于DNA抽提。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 主要儀器 T100 PCR擴(kuò)增儀（Bio-rad）、Lysera高通量組織研磨儀（Biotage）、Nanodrop One超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo）、Qsep100全自動(dòng)核酸蛋白分析儀（Bioptic）、ST8R低溫冷凍離心機(jī)（Thermo）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 樣品處理 取新鮮鐵皮石斛和霍山石斛葉各10 g，其中5 g保存于-80℃冰箱備用；另5 g保存于-20℃冰箱，反復(fù)凍融3次備用。

1.3.2 DNA提取 分別稱取鐵皮石斛和霍山石斛鮮葉及凍葉各約100 mg，Lysera高通量組織研磨儀低溫冷凍研磨成粉末，用于后續(xù)核酸抽提，每種石斛葉3種不同提取方法均制備3份平行樣。核酸抽提分別使用UElandy基因組DNA小量制備試劑盒（M1）、Bioteke新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（M2）和DHelix植物基因組DNA提取試劑盒（M3），參照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3 DNA純度及產(chǎn)率檢測(cè) 取2 μL DNA原液，使用Nanodrop One超微量核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)其在230、260、280nm處的吸光度，其中A260用于計(jì)算DNA濃度；A260/A280比值用于判斷提取的DNA中是否含有多糖、蛋白、RNA等雜質(zhì)；A260/A230比值用于判斷提取的DNA中是否殘留鹽及小分子雜質(zhì)。按式（1）進(jìn)一步計(jì)算DNA產(chǎn)率。

DNA產(chǎn)率（μg/g）=DNA濃度（μg/μL）×稀釋倍數(shù)×DNA樣品體積（μL）/樣品質(zhì)量（g）（1）

1.3.4 DNA質(zhì)量檢測(cè) 根據(jù)DNA核酸濃度檢測(cè)結(jié)果，將其稀釋至10～20 ng/μL ，使用Qsep100全自動(dòng)核酸蛋白分析儀，S3大片段卡夾電泳檢測(cè)分析基因組DNA提取質(zhì)量。

1.3.5 ITS2 PCR擴(kuò)增效率檢測(cè) 以不同方法提取得到的基因組DNA為模板，使用ITS2通用引物[20]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中 10×PCR Buffer （Mg2+ plus） 2.5 μL、dNTP Mixture （各2.5 mol/L） 1 μL、TaKaRa Taq HS （5 U/μl） 0.3 μL、DNA 10 ～ 50 ng、引物ITS2F和ITS3R各 0.5 μL，水補(bǔ)足至總體積25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性5 min；95℃ 20s、61℃ 30s、72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸 3min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用Qsep100全自動(dòng)核酸蛋白分析儀S2標(biāo)準(zhǔn)卡夾電泳檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度及產(chǎn)率檢測(cè)

使用Nanodrop One超微量核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)3種試劑盒提取的4種石斛葉進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)，由圖1 A260/A280結(jié)果可見，3種試劑盒提取的不同石斛葉的DNA所含雜質(zhì)差別較大，其中M1法多糖、酚類及蛋白污染較為嚴(yán)重，A260/A280均低于1.8；M2法和M3法提取的DNA純度較M1法更高。高質(zhì)量的DNA A260/A280應(yīng)介于1.8～2.0之間，小于1.8說明DNA可能存在多糖、酚類及蛋白污染，大于2.0則說明可能存在RNA污染；A260/A230應(yīng)大于2.0，小于2.0說明可能存在殘留鹽及小分子雜質(zhì)。由圖1可見，M1法和M3法提取的DNA存在較多的小分子及鹽類雜質(zhì)，且同種方法在同一樣品平行樣之間的檢測(cè)結(jié)果差異很大，說明這兩種方法去除小分子及鹽類雜質(zhì)效果不理想；M2法提取的DNA純度更高，提取效果也更穩(wěn)定。由圖2可見，不同方法對(duì)不同樣品抽提得到的基因組DNA產(chǎn)率差異很大，其中M1法提取的凍葉和鮮葉的DNA產(chǎn)率很低；M2法提取的鮮葉DNA產(chǎn)率顯著高于凍葉，其鮮葉DNA產(chǎn)率高于M1和M3法，而凍葉DNA產(chǎn)率則低于M3法；M3法提取的鮮葉DNA和凍葉DNA產(chǎn)率較為穩(wěn)定，其中凍葉DNA產(chǎn)率較M1法和M2法更高，但鮮葉DNA產(chǎn)率低于M2法。

2.2 DNA質(zhì)量檢測(cè)

電泳可用于簡(jiǎn)便鑒定和評(píng)估抽提的DNA完整性，通過電泳圖譜可以判斷DNA有無(wú)降解及降解程度，在1 000bp以上觀察到的主帶越清晰，說明DNA完整性越好；若DNA在整條泳道中呈彌散狀態(tài)，則說明DNA發(fā)生了降解。由圖3可見，3種方法提取的凍葉DNA均存在較為嚴(yán)重的降解，且條帶強(qiáng)度均偏弱，說明反復(fù)凍融對(duì)基因組DNA完整性破壞較大。M1法提取的鮮葉和凍葉DNA受提取效率低的影響，條帶偏弱，且均存在不同程度的降解；M2法提取的鮮葉DNA也發(fā)生了一定程度的降解；M3提取的鮮葉DNA在1 000 bp以上可觀察到清晰的主帶，表明其提取的DNA完整性優(yōu)于M1法和M2法。

2.3 ITS2 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

以不同提取試劑盒提取的DNA為模板，對(duì)石斛ITS2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增（目標(biāo)片段大小約為500bp），檢測(cè)其擴(kuò)增效果。如圖4所示，M1提取的擴(kuò)增條帶均弱于M2和M3法，且部分樣品無(wú)法檢測(cè)到清晰擴(kuò)增條帶；M2法和M3法提取的凍葉和鮮葉DNA均可擴(kuò)增得到清晰的ITS2目標(biāo)條帶，表明這兩種方法抽提得到的DNA可用于后續(xù)分子檢測(cè)。

3 結(jié)論與討論

基因組DNA提取是分子生物實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)環(huán)節(jié)，快速有效地提取DNA核酸是開展后續(xù)各種分子檢測(cè)的前提和基礎(chǔ)[21]。本研究比較了3種不同原理的基因組DNA提取試劑盒對(duì)富含多糖多酚類物質(zhì)的石斛鮮葉和凍葉的提取效果。其中M1法使用的是基因組DNA小量制備試劑盒（UElandy），其原理是通過蛋白酶K消化去除蛋白雜質(zhì)后，使用硅膠材質(zhì)和高鹽低pH值的結(jié)合膜柱過濾法進(jìn)行DNA純化抽提，最后應(yīng)用低鹽高pH值的洗脫液洗脫DNA；M2法使用的是新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（Bioteke），該試劑盒是基于改良CTAB法前處理后，硅膠膜過柱純化并洗脫得到DNA；M3法使用植物基因組DNA提取試劑盒（DHelix），該試劑盒原理是對(duì)樣品進(jìn)行SDS/KAC 前處理后，使用硅膠柱純化洗脫得到DNA。

試驗(yàn)結(jié)果表明，基于蛋白酶K消化的M1試劑盒提取的石斛基因組DNA純度、產(chǎn)率和后續(xù)PCR擴(kuò)增效果均較差，不適用于富含多糖多酚類樣品的核酸抽提?；诟牧糃TAB法的M2試劑盒提取的石斛基因組DNA純度和產(chǎn)率均較高，特別是石斛鮮葉的DNA產(chǎn)物顯著高于其他兩種方法，更適用于需要較高DNA模板量的富含多糖多酚類的鮮葉樣品。基于改良SDS法的M3試劑盒提取的石斛基因組DNA純度較高，產(chǎn)率適中，其對(duì)凍葉DNA的提取產(chǎn)率較M1和M2法更高，更適用于富含多糖多酚類凍葉樣品的核酸抽提；M3法提取的鮮葉DNA完整性最佳，更適用于后續(xù)對(duì)DNA完整度要求較高的大片段分析研究。M2法和M3法提取的石斛鮮葉及凍葉的基因組DNA均適用于后續(xù)常規(guī)分子檢測(cè)。

通過比較3種基因組DNA提取試劑盒對(duì)鐵皮石斛和霍山石斛鮮葉及凍葉的提取效果，發(fā)現(xiàn)雖然凍葉提取的DNA產(chǎn)率較低且降解較為嚴(yán)重，但在條件受限無(wú)法獲得新鮮樣品時(shí)候，仍可用于不涉及大片段DNA分析的常規(guī)分子檢測(cè)；市售基于改良CTAB法和改良SDS法的試劑盒適用于石斛基因組DNA的抽提，其實(shí)驗(yàn)流程規(guī)范、操作簡(jiǎn)便、質(zhì)量可控、易推廣使用，提取的DNA能夠滿足后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)要求，可推廣應(yīng)用于含多糖多酚類樣品的基因組DNA提取。

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Comparison Study on Genomic DNA Extraction Methods for Dendrobe

PAN Ying-qiu，HONG Liang，LU Qi-huan，LI Zhao-kui，XIA Hui-li

（Taizhou Key Laboratory of Drug Composition and Adulteration Identification Technology，

Taizhou Food Inspection and Testing Center/Taizhou Institute of Drug Inspection，Taizhou 318000，China）

Abstract：ObjectiveTo compare the effectiveness of three kinds of genomic DNA extraction kits for fresh and frozen leaves of Dendrobium officinale and Dendrobium huoshanense rich in polysaccharides and polyphenols.MethodDNA purity and yield tests，DNA electrophoresis quality analysis，and ITS2 PCR amplification efficiency were analyzed. ResultThe commercially available kit based on proteinase K digestion was not suitable for dendrobe DNA extraction. The modified CTAB-based kit was more suitable for extracting DNA from fresh leaves requiring a higher template amount，while the modified SDS-based kit was more suitable for extracting DNA from frozen leaves，producing the highest quality fresh leaf DNA for experiments requiring high DNA integrity. ConclusionThe kits based on the modified CTAB Method and SDS Method were both suitable for conventional molecular detection of dendrobe genomic DNA from fresh and frozen leaves.

Keywords：dendrobe; DNA extraction method; SDS Method；CTAB Method

基金項(xiàng)目：浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：20210174）。

作者簡(jiǎn)介：潘映秋（1983—），女，碩士，主管藥師，研究方向：食品藥品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)。

通信作者：夏慧麗（1978—），女，博士，正高級(jí)工程師，研究方向：食品藥品質(zhì)量控制與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。