• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    離子通道蛋白Piezo1在人源非小細(xì)胞肺癌中的功能研究

    2023-08-11 13:58:22趙敏萱夏凡晨張文悅石金磊康宇佳
    黑龍江科學(xué) 2023年12期
    關(guān)鍵詞:貨號(hào)孔板細(xì)胞系

    趙敏萱,夏凡晨,劉 晨,張文悅,石金磊,康宇佳

    (上??萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,上海 201210)

    0 引言

    肺癌是全球發(fā)病率最高的癌癥之一,2021年,世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)表的2020年全球癌癥報(bào)告顯示,肺癌患者新增220萬(wàn)例,僅次于乳腺癌,死亡病例數(shù)占據(jù)首位,遠(yuǎn)超其他癌癥類(lèi)型[1]。肺癌通常分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),其中非小細(xì)胞肺癌可細(xì)分為肺腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌及大細(xì)胞癌。作為長(zhǎng)期受到氣壓、氣流及血流應(yīng)力牽拉刺激的器官,肺組織的細(xì)胞中具有壓力感受器,在細(xì)胞生理功能中起重要作用[2],這些感受機(jī)械力的結(jié)構(gòu)可能與肺癌發(fā)病機(jī)制相關(guān),并有機(jī)會(huì)成為肺癌精準(zhǔn)治療的突破口。

    近年來(lái),Piezo家族基因及其編碼的機(jī)械力敏感型離子通道蛋白受到了廣泛關(guān)注,Piezo家族蛋白能感受機(jī)械力,使陽(yáng)離子通過(guò),調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,影響多個(gè)信號(hào)通路,在細(xì)胞增殖、炎癥因子分泌等多種生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[3]。正常細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)離子泵與離子通道的開(kāi)啟及閉合,對(duì)胞內(nèi)Ca2+濃度進(jìn)行精確調(diào)控。Piezo1是一種Ca2+通道蛋白,在組織及器官中表達(dá)更為廣泛[4],參與多種生理功能(如脈管及血液系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)節(jié)、消化與泌尿系統(tǒng)的功能行使與調(diào)控、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)發(fā)育等),并作為關(guān)鍵分子調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、分化及遷移過(guò)程[5-9]。

    對(duì)肺癌的研究表明,Piezo1表達(dá)量在小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌中均下調(diào),但對(duì)于A(yíng)549細(xì)胞系中Piezo1病理機(jī)制的研究尚不明確。本研究以非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象,探究Piezo1蛋白表達(dá)變化對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響,并研究其對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+相關(guān)通路的作用,為Piezo1蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ),為肺癌治療提供新的分子靶標(biāo)。

    1 實(shí)驗(yàn)方法

    1.1 Piezo1敲減細(xì)胞系構(gòu)建

    所用細(xì)胞系為A549人源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),環(huán)境為37 ℃培養(yǎng)箱(5% CO2),siRNA采購(gòu)自cohesion bioscience公司(貨號(hào):CRH6542)提供的4管siRNA,分別是實(shí)施高效敲減的si-A、si-B、si-C及si-scrambled(簡(jiǎn)記為si-NC),其與有效的siRNA有相同的序列組成,但是與mRNA沒(méi)有明顯的同源性,用于做轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染方式為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,所用試劑盒名稱(chēng)為Invitrogen?Lipofectamine 3000,操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,在96孔板中細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%時(shí)實(shí)施轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染12 h后吸棄轉(zhuǎn)染液并加入正常培養(yǎng)體系,在轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

    1.2 qPCR

    實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到兩次qPCR驗(yàn)證基因轉(zhuǎn)錄水平,第一次用于驗(yàn)證siRNA敲減后Piezo1表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平的變化。從各組細(xì)胞中提取mRNA,再進(jìn)行mRNA的逆轉(zhuǎn)錄[所用試劑盒為T(mén)akara公司的PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time),貨號(hào):RR036A],取用500 ng mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的1/25進(jìn)行qPCR試劑配置。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用QuantStudioTM進(jìn)行分析。

    兩次用到的qPCR引物見(jiàn)表1。

    表1 兩次用到的qPCR引物

    1.3 Western Blot

    4 ℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞,吸干后每個(gè)六孔板加入2.5 μL含PMSF的裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃ 14 000 rpm離心10 min,取上清以BCA法進(jìn)行蛋白定量,使樣品濃度為1.5 μg/uL,95 ℃金屬浴使蛋白變性。取40 μL蛋白溶液為上樣量,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(140 V)1 h,在250 mA電流下轉(zhuǎn)膜2 h至聚偏二氯乙烯膜上,用5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1 h,向各組中分別為加入一抗,除兔抗人Piezo1外均用Western一抗稀釋液(公司:Beyotime,貨號(hào):P0023A)稀釋,一抗分別為兔抗人Piezo1(1∶2000,5%脫脂奶粉/TBST稀釋,公司:Beyotime,貨號(hào):AF7743)、兔抗人pAkt(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號(hào):4060)、兔抗人Akt(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號(hào):4691 )、兔抗人p4EBP1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號(hào):2855)、兔抗人4EBP1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號(hào):9644)、兔抗人pS6K1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號(hào):9234)、兔抗人S6K1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號(hào):2708)及兔抗人GAPDH(1∶2000,公司:BBI,貨號(hào):D110016-0025)單克隆抗體,4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次,每次5 min。加入二抗山羊抗兔 I gG抗體(目的蛋白1∶6000,內(nèi)參蛋白1∶10 000,公司:BBI,貨號(hào):D110058-0025),室溫孵育1 h。ECL顯影液[Thermo Scientific SuperSignal West Pico PLUS Stable Peroxide Solution(TH271011)和Thermo Scientific SuperSignal West Pico PLUS Luminol/Enhancer Solution(TH270329)按體積比1∶1配置]顯色3 min后顯影。

    1.4 細(xì)胞增殖水平驗(yàn)證

    CCK8法用于驗(yàn)證細(xì)胞增殖水平,所用試劑為MedChemExpress公司購(gòu)買(mǎi)的(貨號(hào):HY-K0301)。實(shí)驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行,具體操作方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.5 對(duì)于Piezo1蛋白通道的激活抑制驗(yàn)證

    所用到的Yoda1試劑儲(chǔ)存在-80 ℃中,在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從冰凍狀態(tài)取出,按照濃度梯度在室溫中稀釋,由于DMSO有細(xì)胞毒性,需要用DMSO調(diào)整,使最終梯度試劑中的DMSO含量為0.5%,令實(shí)驗(yàn)條件一致。GsMTx4溶解于PBS后于-20 ℃儲(chǔ)存,使用當(dāng)天從冰箱取出,配置濃度梯度。細(xì)胞預(yù)先鋪在96孔板中,在各孔中加入400 μL藥液及600 μL培養(yǎng)基后,在原細(xì)胞培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后吸棄原培養(yǎng)基,用排槍加入CCK-8試劑用于細(xì)胞增殖情況檢測(cè),在敲減回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染12 h后吸棄轉(zhuǎn)染體系,恢復(fù)到正常細(xì)胞培養(yǎng)體系,轉(zhuǎn)染48 h后加入藥液培養(yǎng)體系,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后吸棄藥液并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)處理。

    1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

    取用一個(gè)新的6孔板,孔背面在水平方向上用粗頭馬克筆均勻畫(huà)三條橫線(xiàn)作為基準(zhǔn)線(xiàn),約每隔0.5~1 cm橫穿過(guò)孔。在6孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,待細(xì)胞匯合度達(dá)到95%以上,用移液槍取用200 μL槍頭(Parafilm包裹固定),槍頭豎直。稍用力抵靠孔底部,在中央基準(zhǔn)線(xiàn)的1/3、2/3寬度處垂直于基準(zhǔn)線(xiàn)慢慢在細(xì)胞層上劃兩條痕跡,過(guò)程中盡量保證力度一致。所有劃痕操作使用同一只槍頭完成,沿孔壁輕輕加入1 mL無(wú)菌dPBS洗滌2~3次,盡可能洗凈懸浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片,避免沖散劃痕周?chē)?xì)胞。更換2 mL無(wú)血清或低血清培養(yǎng)基,將培養(yǎng)皿放回37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2 h取出培養(yǎng)皿進(jìn)行拍照。拍照時(shí)曝光時(shí)間需要保持一致,用ImageJ軟件處理圖像。

    1.7 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

    用不含血清的培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠,按照每孔40 μL量將細(xì)胞接種于24孔板對(duì)應(yīng)的小室上室,37 ℃孵育3 h后在超凈臺(tái)中干燥12 h。將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用PBS清洗兩遍后消化、收集,用含10% FBS的培養(yǎng)基洗細(xì)胞、離心、棄上清液、收集細(xì)胞,再用含10% FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ mL。取150 μL細(xì)胞置于小室上室,在小室下室加入800 μL含10% FBS的培養(yǎng)基,緩慢將上室浸入下室,避免產(chǎn)生氣泡。培養(yǎng)48 h后,PBS清洗小室上表面,用PBS潤(rùn)濕的棉簽小心擦去小室微孔膜上層的細(xì)胞,在干凈的24板小孔中加入600 μL 4% 多聚甲醛固定液(PFA),浸沒(méi)小室上下表面,固定45 min,0.1%結(jié)晶紫染20 min,置于顯微鏡下觀(guān)察、拍照,用ImageJ軟件處理圖像。

    1.8 Ca2+成像

    所用試劑為Fluo-4 AM熒光探針(購(gòu)買(mǎi)自Beyotime公司,產(chǎn)品編號(hào)S1060),進(jìn)入細(xì)胞膜后,Fluo-4AM被細(xì)胞內(nèi)酯酶切割成Fluo-4游離體,游離體與Ca2+結(jié)合之后能夠發(fā)出較強(qiáng)熒光,用于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的定量分析檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)使用6孔板,將培養(yǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移到每孔含有3個(gè)平行細(xì)胞爬片的6孔板中,使用含有10%FBS與1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為70%~90%,隨后進(jìn)行正常轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染48 h之后,吸棄正常培養(yǎng)基,用PBS洗滌兩次后暫時(shí)用PBS保護(hù)細(xì)胞不處于干燥狀態(tài),在暗處用2 mM濃度的Fluo-4AM母液配置含有2.5 μM探針的工作液共3 mL,吸棄用于清洗的PBS后,每孔加入500 μL工作液,以沒(méi)過(guò)細(xì)胞爬片。隨后用鋁箔包裹6孔板,使其處于避光條件下,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育45 min。孵育結(jié)束后,吸棄工作用1 mL含1%FBS的PBS沒(méi)過(guò)細(xì)胞表面,置于37 ℃培養(yǎng)箱中再次避光孵育30 min。隨后吸棄孔內(nèi)液體,將每孔爬片再次用1 mL PBS清洗一遍,在載玻片上滴加抗淬滅水性封片劑7 μL,將爬片細(xì)胞面扣在封片劑內(nèi)制片,吸去多余封片劑及液體之后置于熒光顯微鏡下觀(guān)察。圖像在ImageJ軟件中分析處理。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 Piezo1敲減細(xì)胞系中Piezo1表達(dá)下調(diào)

    RT-PCR檢測(cè)Piezo1敲減細(xì)胞系中Piezo1的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示,si-Piezo1導(dǎo)致mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)(圖1a),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。WB鑒定Piezo1敲減細(xì)胞系中Piezo1蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示,在3個(gè)敲減細(xì)胞系中,Piezo1蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào),其中si-B組Piezo1蛋白表達(dá)水平下調(diào)最為明顯(圖1 b、圖1 c),表明siRNA沉默Piezo1基因表達(dá)的方法能在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上同時(shí)抑制Piezo1的蛋白表達(dá)。

    (a)RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組Piezo1基因轉(zhuǎn)錄水平 (b)WB檢測(cè)對(duì)照組和敲減組中Piezo1蛋白的表達(dá)情況 (c)對(duì)照組和敲減組細(xì)胞中Piezo1蛋白相對(duì)表達(dá)量

    2.2 Piezo1敲減造成非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖能力下調(diào)

    2.2.1Piezo1表達(dá)水平下降造成細(xì)胞增殖能力減弱

    CCK8法檢測(cè)野生型A549細(xì)胞系與敲減細(xì)胞系細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,敲減組細(xì)胞增殖能力出現(xiàn)顯著下調(diào)(圖2a),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Piezo1通道蛋白抑制劑GsMTx4[14]處理A549細(xì)胞,結(jié)果顯示,細(xì)胞增殖能力與抑制劑濃度負(fù)相關(guān),4 μM濃度處理的A549細(xì)胞增殖率降低程度最大,對(duì)Piezo1離子通道的抑制效果最強(qiáng)(圖2b)。

    (a)CCK8表征siRNA敲減前后細(xì)胞增殖情況,利用單因素方差分析,顯著度分別為:si-A:P<0.0001,si-B:P<0.0001,si-C: P<0.01 (b)不同濃度抑制劑GsMTx4處理細(xì)胞后的增殖能力變化情況 (c~f)激活劑和抑制劑處理Piezo1敲減A549細(xì)胞后克隆形成情況變化,c,e為分別用不同濃度抑制劑GsMTx4和激活劑Yoda1處理后細(xì)胞克隆形成情況變化,d、f為對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

    2.2.2Piezo1蛋白活性降低抑制A549細(xì)胞的克隆形成

    利用克隆形成模擬A549細(xì)胞在體內(nèi)的增殖生長(zhǎng)環(huán)境實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,GsMTx4抑制組出現(xiàn)明顯差異,克隆形成率與抑制劑濃度成負(fù)相關(guān)(圖2c、圖2d),表明Piezo1通道活性下降對(duì)克隆形成起抑制作用。Yoda1激活組中各濃度未出現(xiàn)明顯的克隆形成率差異(圖2e、圖2f),暗示了在A(yíng)549細(xì)胞系中,Piezo1的本底表達(dá)可能處于高水平。

    2.3 Piezo1敲減造成非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移能力下調(diào)

    細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)48 h結(jié)果顯示,與對(duì)照組Si-NC及WT相比,Piezo1基因敲減組Si-A與Si-C的遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少,遷移率明顯降低(圖3a、圖3b),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明,Piezo1敲減對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移能力具有明顯的抑制作用。

    (a)劃痕實(shí)驗(yàn)48 h前后對(duì)比圖像 (b)各組劃痕修復(fù)的區(qū)域面積統(tǒng)計(jì) (c)Transwell檢測(cè)A549細(xì)胞侵襲 (d)利用孔內(nèi)平均熒光強(qiáng)度計(jì)算得Fluo-4AM處理后A549細(xì)胞總體熒光強(qiáng)度 (e)Fluo-4AM處理后的A549細(xì)胞熒光圖像 (f)利用單細(xì)胞熒光強(qiáng)度計(jì)算得Fluo-4AM處理后A549細(xì)胞總體熒光強(qiáng)度

    2.4 Piezo1敲減造成非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲能力下調(diào)

    Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)12 h結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Piezo1敲減組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(圖3c),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。結(jié)果表明,Piezo1敲減對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲能力有明顯的抑制作用。

    2.5 Piezo1敲減造成非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度下降

    Fluo-4 AM Ca2+探針對(duì)Ca2+成像(圖3e),結(jié)果顯示,敲減組單細(xì)胞內(nèi)部及細(xì)胞系總體的胞內(nèi)Ca2+含量均減少(圖3d、圖3f)。

    2.6 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞Piezo1敲減影響下游信號(hào)

    2.6.1 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞Piezo1敲減后影響Ca2+通道下游磷酸化水平

    Piezo1本身作為壓力敏感型Ca2+通道,可能通過(guò)將機(jī)械應(yīng)力信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)Ca2+濃度信號(hào),觸發(fā)下游相關(guān)的信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞的增殖及遷移表型。研究認(rèn)為,Ca2+水平上升可能調(diào)控Akt磷酸化并啟動(dòng)下游通路[15],在經(jīng)典通路中,Akt磷酸化抑制tuberin,解除TCS2對(duì)Rheb的抑制調(diào)控[16-17],使mTOR通路被激活并進(jìn)一步磷酸化下游的4EBP1和S6K1[18],其磷酸化同步表征mTORC1的磷酸化水平。4EBP1磷酸化導(dǎo)致elF4E轉(zhuǎn)錄因子活化,從而激活基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞增殖與遷移。WB結(jié)果顯示,在Piezo1敲減細(xì)胞系中,pAkt的磷酸化水平被下調(diào)(圖4a),4EBP1蛋白的磷酸化水平顯著提高(圖4b),而S6K1蛋白的磷酸化水平則沒(méi)有發(fā)生顯著的改變(圖4c)。

    2.6.2 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞Piezo1敲減后影響增殖、遷移及侵襲下游信號(hào)

    由于轉(zhuǎn)錄因子的活化,選擇下游部分基因,通過(guò)RT-PCR鑒定mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示,敲減細(xì)胞系中,與增殖相關(guān)的Myc[19-20]、Cyclin-D1[21]、Cyclin-E[22]、CDK2轉(zhuǎn)錄水平均有明顯下調(diào)(圖4d),與遷移、侵襲表型相關(guān)的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin[23]等基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯上調(diào)(圖4e),其中si-B的效果較明顯,表明Piezo1蛋白通過(guò)影響與增殖及遷移相關(guān)基因的表達(dá),最終影響肺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。

    3 討論

    Piezo1是由一個(gè)長(zhǎng)達(dá)2547個(gè)氨基酸構(gòu)成的三聚體,呈螺旋槳式結(jié)構(gòu),各亞基通過(guò)36個(gè)跨膜域及2個(gè)跨膜域組成的離子通道錨定在細(xì)胞膜上[24]。研究認(rèn)為,Piezo1蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象契合杠桿作用原理,可能通過(guò)體外周跨膜螺旋單位(THU)作為機(jī)械力感受器,通過(guò)杠桿完成力的傳遞。研究發(fā)現(xiàn),Piezo1不僅可以感受外界機(jī)械應(yīng)力,還可以感知內(nèi)源機(jī)械應(yīng)力[25],從而認(rèn)為Piezo1不只在膜上作為壓感型離子通道,也在胞內(nèi)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合體響應(yīng)蛋白內(nèi)應(yīng)力并參與細(xì)胞內(nèi)功能行使,這意味著Piezo1在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中仍有尚未解析的功能。

    本實(shí)驗(yàn)探究了Piezo1蛋白表達(dá)量與細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)siRNA敲減Piezo1降低Piezo1蛋白的表達(dá),可以顯著降低A549細(xì)胞系的增殖、遷移及侵襲能力。在使用Piezo1蛋白抑制劑GsMTx4處理A549細(xì)胞系后得到了與siRNA敲減相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。需要指出的是,GsMTx4是一種廣譜性用于抑制壓力敏感型離子通道的抑制劑[26],并不是Piezo1的特異型抑制劑,因此不能直接說(shuō)明細(xì)胞的功能缺失完全是由Piezo1受到抑制而導(dǎo)致的。

    在敲減細(xì)胞系中加入Piezo1蛋白的特異型激活劑Yoda1發(fā)現(xiàn),該激活劑可以部分恢復(fù)癌細(xì)胞的增殖能力,這從另一個(gè)角度證實(shí)了A549細(xì)胞系增殖能力的下降確實(shí)是由于Piezo1蛋白表達(dá)量降低所引起的。然而,用Yoda1處理野生型A549細(xì)胞發(fā)現(xiàn),其對(duì)細(xì)胞增殖能力的改變并不明顯,這表明在A(yíng)549細(xì)胞系中Piezo1的本底表達(dá)與通道活性相對(duì)較高。劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Piezo1敲減造成A549細(xì)胞遷移及侵襲能力下降。

    研究認(rèn)為,作為機(jī)械力敏感的陽(yáng)離子通道蛋白,Piezo1可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度調(diào)控細(xì)胞表型。胞內(nèi)Ca2+探針實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Piezo1敲減細(xì)胞Ca2+濃度下降明顯。有文獻(xiàn)指出,Piezo1敲減的人源骨髓巨噬細(xì)胞中,PI3K/Akt途徑受到抑制,其中Akt磷酸化水平降低而PI3K表達(dá)沒(méi)有受到影響,暗示Piezo1采用一種PI3K之外的Akt激活途徑[27],由此猜測(cè)在非小細(xì)胞肺癌中,Ca2+變化可能通過(guò)某種方式影響Akt磷酸化水平,因而嘗試驗(yàn)證在A(yíng)549中Piezo1與Akt激活的關(guān)系。結(jié)果表明,敲減Piezo1降低Piezo1蛋白的表達(dá)能夠?qū)е翧549細(xì)胞中Akt磷酸化水平的降低,與之前的研究結(jié)果一致。

    由于A(yíng)kt通路下游的mTORC1通路與細(xì)胞增殖相關(guān),進(jìn)一步驗(yàn)證了Piezo1影響細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的下游分子機(jī)制十分必要。在基因轉(zhuǎn)錄水平上探究增殖相關(guān)的Myc、Cyclin-D1、Cyclin-E、CDK2與遷移相關(guān)的E-cadherin、N-cadherin及Vimentin的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果表明,Myc、Cyclin-D1、Cyclin-E、CDK2轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào),與前期細(xì)胞增殖表型的下調(diào)相一致,E-cadherin、N-cadherin、Vimentin轉(zhuǎn)錄水平則明顯上調(diào)。在細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中,遷移相關(guān)的三個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮著重要的作用。E-cadherin作為本地黏附分子在EMT過(guò)程中表達(dá)量降低,而N-cadherin與Vimentin表達(dá)量增加,增強(qiáng)細(xì)胞的移動(dòng)能力以完成EMT過(guò)程[24]。在EMT過(guò)程中,細(xì)胞需要解除自身與周?chē)橘|(zhì)的黏附才能開(kāi)啟一系列的遷移模式,因此作為EMT過(guò)程的開(kāi)端,E-cadherin的表達(dá)下調(diào)非常重要。在轉(zhuǎn)錄水平上,E-cadherin的上調(diào)可能比N-cadherin及Vimentin的作用更為突出,從而導(dǎo)致宏觀(guān)上A549細(xì)胞的遷移能力減弱。

    近年來(lái),人們一直在研究Piezo1與疾病之間的關(guān)系。不同類(lèi)型的癌癥中,Piezo1的作用不盡相同。在骨肉瘤中,Piezo1激活后促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而敲減Piezo1則會(huì)影響腫瘤形成能力并挽救細(xì)胞凋亡[28]。在肝細(xì)胞癌(HCC)中,Piezo1表達(dá)顯著上調(diào),敲低Piezo1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成及體內(nèi)腫瘤形成等方面的顯著損傷[29]。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中阻斷Piezo1通道的功能會(huì)減弱細(xì)胞的遷移能力[30]。在結(jié)腸癌中Piezo1表達(dá)量的上調(diào),過(guò)度表達(dá)Piezo1可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲[31-32]。在胃癌細(xì)胞中敲低Piezo1可減弱細(xì)胞的遷移能力[33]。

    本研究對(duì)Piezo1下游信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了敲低Piezo1會(huì)影響Akt的磷酸化進(jìn)程,并進(jìn)一步影響增殖相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄活動(dòng),從而導(dǎo)致A549細(xì)胞增殖表型受到抑制。目前已經(jīng)研究過(guò)的Piezo1相關(guān)下游通路包括激活ORAI1通路并引發(fā)淋巴管萌芽[34],在肺動(dòng)脈中激活A(yù)kt與eNOS[35],在卵巢癌中激活Hippo/YAP通路[36],在HCC組織中通過(guò)招募Rab5c來(lái)激活TGF-β通路[29],在H1-L細(xì)胞系中激活CaM/Src/Pitx2通路[37],在神經(jīng)干細(xì)胞中激活BMP2/Smad通路并調(diào)控干細(xì)胞發(fā)育[38]等。Piezo1的具體下游通路仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

    猜你喜歡
    貨號(hào)孔板細(xì)胞系
    核電廠(chǎng)高壓安注系統(tǒng)再循環(huán)管線(xiàn)節(jié)流孔板的分析與改進(jìn)
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    限流孔板的計(jì)算與應(yīng)用
    廣州化工(2020年6期)2020-04-18 03:30:20
    作者更正致歉說(shuō)明
    長(zhǎng)距離礦漿管道系統(tǒng)中消能孔板的運(yùn)行優(yōu)化
    STAT3對(duì)人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系增殖與凋亡的影響
    抑制miR-31表達(dá)對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞系遷移和侵襲的影響及可能機(jī)制
    E3泛素連接酶對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    氣田集輸站場(chǎng)火災(zāi)泄壓放空限流孔板計(jì)算解析
    七葉皂苷鈉與化療藥聯(lián)合對(duì)HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞系的作用
    亚洲精品久久午夜乱码| 美女中出高潮动态图| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产综合精华液| 亚洲精品日本国产第一区| 直男gayav资源| 一个人看视频在线观看www免费| 中文天堂在线官网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| av女优亚洲男人天堂| videos熟女内射| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 精品久久国产蜜桃| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲三级黄色毛片| av网站免费在线观看视频| 精品国产三级普通话版| 观看美女的网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲第一av免费看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 一区二区三区乱码不卡18| 日韩成人av中文字幕在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲av综合色区一区| 国产在线男女| 国产在线视频一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 欧美成人午夜免费资源| av女优亚洲男人天堂| 亚洲国产精品专区欧美| 永久免费av网站大全| 国产毛片在线视频| 亚洲国产精品999| 99久久精品一区二区三区| 观看免费一级毛片| 亚洲高清免费不卡视频| 日本vs欧美在线观看视频 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一级毛片久久久久久久久女| 热re99久久精品国产66热6| 国产午夜精品一二区理论片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 高清av免费在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线观看人妻少妇| 亚洲av日韩在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲高清免费不卡视频| 99久久人妻综合| 五月开心婷婷网| 日韩中字成人| 亚洲成人手机| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 女人久久www免费人成看片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲av综合色区一区| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲av中文av极速乱| 97在线视频观看| 国产 精品1| 如何舔出高潮| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 毛片女人毛片| 国产乱来视频区| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久久久国产网址| 亚洲成人中文字幕在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| .国产精品久久| 一区二区av电影网| 高清av免费在线| 国产免费视频播放在线视频| 国产 一区 欧美 日韩| 少妇高潮的动态图| 国产精品av视频在线免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲不卡免费看| 久久久久久久久久久免费av| 日韩三级伦理在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| av专区在线播放| 日韩欧美 国产精品| xxx大片免费视频| 婷婷色综合www| 国产一区有黄有色的免费视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲av男天堂| 简卡轻食公司| 久久av网站| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲精品国产色婷婷电影| 熟女人妻精品中文字幕| 联通29元200g的流量卡| 国产永久视频网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲成人一二三区av| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲熟女精品中文字幕| av卡一久久| av线在线观看网站| 精品熟女少妇av免费看| 国产亚洲欧美精品永久| 成年人午夜在线观看视频| 国产日韩欧美在线精品| 日韩一本色道免费dvd| 成人特级av手机在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 成人一区二区视频在线观看| 中文天堂在线官网| 伦理电影免费视频| 美女视频免费永久观看网站| 免费av不卡在线播放| 精品一区二区免费观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 边亲边吃奶的免费视频| 青春草亚洲视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 岛国毛片在线播放| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩亚洲欧美综合| 国产伦理片在线播放av一区| 久久国产乱子免费精品| 久久午夜福利片| 涩涩av久久男人的天堂| 久久人妻熟女aⅴ| 各种免费的搞黄视频| av不卡在线播放| 在线观看免费视频网站a站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 成人特级av手机在线观看| 人妻系列 视频| 不卡视频在线观看欧美| 久久久成人免费电影| 午夜福利影视在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 六月丁香七月| 赤兔流量卡办理| 免费观看a级毛片全部| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品一区蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 免费av不卡在线播放| 国产精品偷伦视频观看了| 黑人高潮一二区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 大香蕉97超碰在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 涩涩av久久男人的天堂| www.av在线官网国产| 亚洲av日韩在线播放| 少妇被粗大猛烈的视频| 777米奇影视久久| 91精品伊人久久大香线蕉| a级毛色黄片| 精品亚洲成a人片在线观看 | 成人亚洲精品一区在线观看 | 久久久久国产网址| 久久久欧美国产精品| 人人妻人人看人人澡| 久久久精品免费免费高清| 18+在线观看网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品一及| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩欧美精品免费久久| 欧美成人a在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 五月开心婷婷网| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久久久久久精品精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美xxⅹ黑人| av国产精品久久久久影院| 97在线人人人人妻| 国产极品天堂在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品视频人人做人人爽| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲综合精品二区| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲美女视频黄频| 在线免费观看不下载黄p国产| 岛国毛片在线播放| av一本久久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品欧美亚洲77777| 91精品国产九色| 国产有黄有色有爽视频| 激情五月婷婷亚洲| 又爽又黄a免费视频| av网站免费在线观看视频| 久久99热这里只频精品6学生| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 中文欧美无线码| 能在线免费看毛片的网站| 一级毛片aaaaaa免费看小| 免费高清在线观看视频在线观看| 中文欧美无线码| 日韩强制内射视频| 又爽又黄a免费视频| 久久精品人妻少妇| 男男h啪啪无遮挡| 男女无遮挡免费网站观看| 中文欧美无线码| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久欧美国产精品| 日本wwww免费看| 在线 av 中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久久国产电影| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 色5月婷婷丁香| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 2022亚洲国产成人精品| 高清欧美精品videossex| 91狼人影院| 亚洲精品乱久久久久久| 中文字幕免费在线视频6| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 97热精品久久久久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| av免费在线看不卡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 成年美女黄网站色视频大全免费 | 久久ye,这里只有精品| 三级国产精品片| 国产视频内射| 国产一区二区三区av在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费大片18禁| 在线免费十八禁| 亚洲av成人精品一区久久| 全区人妻精品视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 一级黄片播放器| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品少妇黑人巨大在线播放| 22中文网久久字幕| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产视频首页在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲不卡免费看| 亚洲在久久综合| 日日啪夜夜撸| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品一区www在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲成人手机| 日韩欧美精品免费久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 99精国产麻豆久久婷婷| 七月丁香在线播放| 精品少妇久久久久久888优播| 在线免费十八禁| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一区在线观看完整版| 免费观看的影片在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产一区二区三区av在线| 国产淫片久久久久久久久| 国产精品99久久久久久久久| 国产高清国产精品国产三级 | 日韩中字成人| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国精品久久久久久国模美| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成人黄色视频免费在线看| 老司机影院成人| 国产黄片美女视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 91狼人影院| 精品久久国产蜜桃| 精品一区二区三卡| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久久久久久国产电影| 亚洲天堂av无毛| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产成人精品久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 激情五月婷婷亚洲| 99久久精品一区二区三区| 色吧在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 国产在线免费精品| 日本wwww免费看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av在线app专区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 大码成人一级视频| 午夜福利影视在线免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 内射极品少妇av片p| 看非洲黑人一级黄片| 美女福利国产在线 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲不卡免费看| 亚洲美女黄色视频免费看| 人妻少妇偷人精品九色| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 性色avwww在线观看| 国产成人freesex在线| 亚洲精品国产成人久久av| 少妇精品久久久久久久| 七月丁香在线播放| 久久精品国产亚洲av天美| 精品人妻视频免费看| 51国产日韩欧美| 国产免费福利视频在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品一区二区在线观看99| 国产精品女同一区二区软件| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产亚洲最大av| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人特级av手机在线观看| 免费少妇av软件| 亚洲伊人久久精品综合| av线在线观看网站| 精品一区二区免费观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 观看av在线不卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲精品色激情综合| 国产在线一区二区三区精| 精品国产乱码久久久久久小说| 性色av一级| 亚洲一区二区三区欧美精品| 97精品久久久久久久久久精品| 免费看光身美女| 国产亚洲欧美精品永久| 美女视频免费永久观看网站| 中文天堂在线官网| 18禁在线播放成人免费| 欧美高清性xxxxhd video| 久久久久久九九精品二区国产| 舔av片在线| 欧美高清性xxxxhd video| 熟女电影av网| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 简卡轻食公司| 国产乱人视频| 秋霞在线观看毛片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 午夜激情福利司机影院| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲人与动物交配视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 在线天堂最新版资源| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久久久国产电影| 黑丝袜美女国产一区| 男女边吃奶边做爰视频| 成人综合一区亚洲| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 内地一区二区视频在线| 日韩中字成人| 亚洲不卡免费看| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美 日韩 精品 国产| 成人黄色视频免费在线看| 妹子高潮喷水视频| 婷婷色综合大香蕉| 99热这里只有精品一区| 成人国产麻豆网| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久久久久人妻| 成人国产麻豆网| 亚洲不卡免费看| 日韩制服骚丝袜av| 精品亚洲成国产av| 精品午夜福利在线看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲国产欧美在线一区| 久久婷婷青草| 成人影院久久| 熟女av电影| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美激情国产日韩精品一区| 免费观看无遮挡的男女| av福利片在线观看| 高清欧美精品videossex| 免费观看在线日韩| 人妻少妇偷人精品九色| 日日啪夜夜撸| 亚洲av不卡在线观看| 久久精品国产自在天天线| 久久久久久久国产电影| 亚洲av男天堂| 国产免费又黄又爽又色| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品国产av在线观看| 久久ye,这里只有精品| 国产伦理片在线播放av一区| av在线播放精品| 亚洲色图av天堂| 大片免费播放器 马上看| 黄色日韩在线| 大香蕉97超碰在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品人妻熟女av久视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产v大片淫在线免费观看| 观看av在线不卡| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久久网色| 久久国产精品大桥未久av | 黄色怎么调成土黄色| 日韩视频在线欧美| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩亚洲欧美综合| 网址你懂的国产日韩在线| 夫妻午夜视频| 亚洲人成网站高清观看| 少妇丰满av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产黄片视频在线免费观看| 大香蕉久久网| 亚洲欧美清纯卡通| 国产永久视频网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 最黄视频免费看| 亚洲不卡免费看| 日韩大片免费观看网站| 成人一区二区视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产一区二区三区综合在线观看 | freevideosex欧美| 亚洲人成网站在线播| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| h视频一区二区三区| 一级毛片久久久久久久久女| 成人亚洲欧美一区二区av| 老司机影院成人| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 1000部很黄的大片| 99热6这里只有精品| 一区在线观看完整版| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品三级大全| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 日日啪夜夜撸| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜激情久久久久久久| 欧美日本视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久热精品热| 中文字幕制服av| 五月玫瑰六月丁香| 国产毛片在线视频| 最后的刺客免费高清国语| 在线观看av片永久免费下载| 香蕉精品网在线| 97超视频在线观看视频| 中文资源天堂在线| 久久午夜福利片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一级av片app| 最近最新中文字幕免费大全7| av视频免费观看在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费黄色在线免费观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产成人a区在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产欧美人成| 女人久久www免费人成看片| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品福利在线免费观看| 精品亚洲成国产av| 国产精品精品国产色婷婷| 国产男女超爽视频在线观看| 女性被躁到高潮视频| 国产黄频视频在线观看| 在线观看人妻少妇| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | tube8黄色片| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久精品夜色国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 久久精品久久久久久久性| 我的女老师完整版在线观看| 秋霞伦理黄片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 伦精品一区二区三区| 精品人妻视频免费看| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲av日韩在线播放| 久久精品国产亚洲网站| av免费在线看不卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 大陆偷拍与自拍| 精品一区二区三区视频在线| 26uuu在线亚洲综合色| 国产色婷婷99| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 人妻系列 视频| 日韩制服骚丝袜av| 新久久久久国产一级毛片| 舔av片在线| 男人添女人高潮全过程视频| 精品午夜福利在线看| 国产欧美日韩精品一区二区| 夫妻午夜视频| 在线精品无人区一区二区三 | 国产色婷婷99| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 丰满乱子伦码专区| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 91精品国产国语对白视频| 十八禁网站网址无遮挡 | 欧美少妇被猛烈插入视频| av专区在线播放| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品国产三级专区第一集| 一级黄片播放器| 成人国产av品久久久| 深夜a级毛片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 男女免费视频国产| 国产片特级美女逼逼视频| 精品久久久久久久久亚洲| 免费人成在线观看视频色| 精品一区在线观看国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| h视频一区二区三区| 好男人视频免费观看在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品久久久久久久末码| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 51国产日韩欧美| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| av女优亚洲男人天堂| 制服丝袜香蕉在线| 国产精品一二三区在线看| 我的女老师完整版在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 成人特级av手机在线观看| 全区人妻精品视频| 免费观看a级毛片全部| 人妻 亚洲 视频| 一区二区三区乱码不卡18| 91aial.com中文字幕在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲成色77777| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 久久97久久精品| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精品三级大全| 精品视频人人做人人爽| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美一区二区亚洲| 亚洲国产高清在线一区二区三| 高清欧美精品videossex| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲欧美成人精品一区二区| 一级毛片电影观看| 波野结衣二区三区在线| 国产精品伦人一区二区| 精品久久国产蜜桃|