油茶炭疽病復(fù)合病菌鑒定及室內(nèi)藥劑評(píng)價(jià)*

李玲玲 朱原野 張盛培 李 河

（南方人工林病蟲(chóng)害防控國(guó)家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 森林生物資源與有害生物綜合管理湖南省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長(zhǎng)沙 410004）

油茶（Camellia oleifera）是我國(guó)特有的木本食用油料樹(shù)種，主要種植于我國(guó)南方14 個(gè)?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)），至今已有兩千多年的栽培歷史（陳永忠等, 2013）。近年來(lái)，我國(guó)油茶種植面積持續(xù)增加，油茶籽產(chǎn)量不斷提高，截至2019 年全國(guó)油茶種植面積達(dá)到453.3 萬(wàn)hm2，油茶籽產(chǎn)量達(dá)267.9 萬(wàn)t。油茶產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展對(duì)維護(hù)我國(guó)糧油安全、推動(dòng)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展，鞏固油茶產(chǎn)區(qū)農(nóng)民脫貧致富成果具有重要作用（張立偉等,2021）。但隨著油茶種植面積的迅速增加，各類油茶病害的發(fā)生也日趨嚴(yán)重，其中油茶炭疽病是危害油茶最嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重阻礙了油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前已報(bào)道的油茶炭疽病的病原菌主要有：膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、果生炭疽菌（C.fructicola）、暹羅炭疽菌（C. siamense）、山茶炭疽菌（C.camelliae）、喀斯特炭疽菌（C. karstii）、博寧炭疽菌（C.boninense）、（C. henanense）、哈銳炭疽菌（C. horri,C.nymphaeae）（Liet al., 2018；李河等, 2015；2017；Liet al., 2020）。

復(fù)合侵染是指2 種或2 種以上的病原物共同侵染寄主植物引起病害的現(xiàn)象。目前研究表明，在馬鈴薯（Solanum tuberosum）、蠶豆（Vicia faba）、甜瓜（Cucumis melo）、玉米（Zea mays），番茄（Lycopersicon esculentum）等多種植物中存在由病原物復(fù)合侵染引起的病害，Li 等（2021）研究表明，番茄褪綠病毒（ToCV）和番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）復(fù)合侵染番茄時(shí)具有協(xié)同增效作用，導(dǎo)致番茄病害嚴(yán)重度指數(shù)高，莖高和莖重降低。錢恒偉等（2017）研究發(fā)現(xiàn)甘薯莖枯病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）復(fù)合侵染引起的。吳會(huì)杰等（2021）研究報(bào)道黑點(diǎn)根腐病菌（Monosporascus cannonballus）和鐮孢菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）復(fù)合侵染引起甜瓜根腐病。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在分離油茶炭疽病病原菌的過(guò)程中，除炭疽屬之外，總能分離出擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsissp.）和鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌。進(jìn)一步致病性測(cè)定結(jié)果表明，擬盤多毛孢屬和鏈格孢屬真菌都是油茶的致病菌。由此筆者推測(cè)，油茶炭疽病可能存在炭疽菌和其他致病菌復(fù)合侵染現(xiàn)象。

油茶炭疽病的防治措施主要是化學(xué)防治。曹志華等（2012）發(fā)現(xiàn)10%苯醚甲環(huán)唑WG 對(duì)油茶炭疽病病原菌的室內(nèi)毒力最強(qiáng)；陳紹紅等（2007）室內(nèi)和田間試驗(yàn)表明，撲菌清、葉斑凈和寶寧對(duì)油茶炭疽病的防治效果較好；王義勛等（2014）田間試驗(yàn)結(jié)果表明，40%氟硅唑乳油2 000 倍液或10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑4 500 倍液對(duì)油茶炭疽病的防治效果較好。但是，一種殺菌劑對(duì)不同屬甚至同屬不同種病原菌的抑制活性存在較大差異，如氟吡菌酰胺對(duì)牡丹炭疽病菌的抑制作用較好，但對(duì)辣椒炭疽病菌則沒(méi)有抑制作用（徐娜娜等，2021；高楊楊，2021）；代森錳鋅對(duì)鏈格孢（Alternaria alternata）具有抑制作用，但對(duì)炭疽病菌（C.gloeosporioides）和新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）幾乎沒(méi)有抑制作用（馮寶珍等，2019；曹志華等，2012；溫浩等，2019）。前期研究發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病斑中除炭疽菌以外，可能還存在其他致病菌，防治多種病菌復(fù)合侵染的油茶炭疽病目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，為了有效防治油茶炭疽病，亟需篩選能同時(shí)殺死或抑制病斑中多種致病菌的殺菌劑。

本研究采用組織分離法對(duì)油茶炭疽病復(fù)合病菌進(jìn)行分離，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行種類鑒定，通過(guò)復(fù)合侵染試驗(yàn)探究致病菌之間的關(guān)系，并對(duì)致病力強(qiáng)的復(fù)合病菌進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選，以期為全面合理有效的防治油茶炭疽病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集與菌株分離

油茶炭疽病病葉于2020 年6—10 月采集自湖南長(zhǎng)沙、瀏陽(yáng)、益陽(yáng)、湘潭、廣西南寧、廣東東莞，海南澄邁及江蘇南京8 個(gè)地區(qū)的油茶成林。采用Cai 等（2009）組織分離法分離病原菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基及供試藥劑

供試培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基；AEA 培養(yǎng)基。

供試藥劑：96%咪鮮胺原藥、95%苯醚甲環(huán)唑原藥、98%啶酰菌胺原藥、96%氟吡菌酰胺原藥，98%嘧菌酯原藥，97%啶氧菌酯原藥，均由濟(jì)南一農(nóng)化工有限公司提供。99%水楊肟酸（SHAM）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 柯赫氏法則驗(yàn)證

采用李河等（2017）、Maharachchikumbura 等（2016）和Woudenberg 等（2013）的方法對(duì)分離獲得的油茶病原真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和柯赫氏法則驗(yàn)證，確定油茶炭疽病斑中的致病菌種類。

1.4 分子生物學(xué)分析

采用CTAB 法（Xuet al., 1996）提取致病菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用通用引物ITS1/ITS4（序列見(jiàn)表1）對(duì)所有致病菌的ITS 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的序列在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，初步分析致病菌種類，進(jìn)一步用特異性基因擴(kuò)增測(cè)序。炭疽菌屬菌株由ITS 和ApMat基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析，擬盤多毛孢屬、新擬盤多毛孢屬及假擬盤多毛孢屬菌株由ITS、TUB2和EF-1α 基因聯(lián)合建樹(shù)分析，鏈格孢屬菌株由ITS 和Histone-3 基因聯(lián)合建樹(shù)分析，所有引物序列和PCR 擴(kuò)增程序見(jiàn)表1。參考菌株序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。采用CLUSTAL W 進(jìn)行序列比對(duì)分析，用MEGA 7 軟件構(gòu)建N-J(neighbor-joining)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自舉檢驗(yàn)重復(fù)1 000 次。

表1 引物序列和PCR 擴(kuò)增程序Tab. 1 Primer sequence and PCR cycling conditions

1.5 復(fù)合侵染試驗(yàn)

將油茶炭疽病斑中分離出的主要復(fù)合致病菌作為供試菌株，用打孔器（Φ=4 mm）在生長(zhǎng)良好的菌落邊緣切取菌餅。參考錢恒偉等（2017）和張永樂(lè)等（2018）的方法，采用有傷接種的方式，將菌餅接種在油茶嫩葉和蘋果果實(shí)上，共設(shè)3 個(gè)處理，1）先接種炭疽菌屬菌，再接同種菌株；2）先單獨(dú)接種擬盤多毛孢屬或新擬盤多毛孢屬病菌，再接種同種菌株；3）復(fù)合接種，即先接種炭疽菌屬病菌，再接種擬盤多毛孢屬或新擬盤多毛孢屬病菌。待首次接種油茶葉片和蘋果果實(shí)開(kāi)始出現(xiàn)病斑后，去除所有接種菌塊，再接種同種或不同種真菌，置于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 天。每個(gè)處理重復(fù)6 次，無(wú)菌PDA 作為對(duì)照。觀察葉片和蘋果果實(shí)發(fā)病情況并記錄病斑大小。

1.6 殺菌劑毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定6 種殺菌劑對(duì)油茶致病菌的抑菌活性，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)得到供試藥劑對(duì)不同致病菌的有效濃度范圍。啶酰菌胺和氟吡菌酰胺為10、25、50、75、100 μg·mL-1；嘧菌酯和啶氧菌酯為0.005、0.01、0.02、0.04、0.16、5、25，50 μg·mL-1；咪鮮胺為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg·mL-1；苯醚甲環(huán)唑?yàn)?.125、0.25、0.5、1.5、3、4.5 μg·mL-1。從活化3 天的菌落邊緣切取菌餅（Φ=4 mm），分別接種到含有咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺的PDA 平板，含有嘧菌酯和10、25 μg·mL-1SHAM、啶氧菌酯和10、25 μg·mL-1SHAM 的AEA 平板上，28 ℃培養(yǎng)4 天。分別以含甲醇的PDA 培養(yǎng)基、含甲醇和10、25 μg·mL-1SHAM的AEA 培養(yǎng)基為對(duì)照，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.7 數(shù)據(jù)處理

Excel 軟件計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，DPS 軟件計(jì)算有效抑制中濃度（EC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶炭疽病斑中絲狀真菌致病性測(cè)定及形態(tài)特征

采用組織分離法，從油茶炭疽病病葉樣本中分離獲得186 株絲狀真菌，通過(guò)回接實(shí)驗(yàn)測(cè)定它們的致病性，發(fā)現(xiàn)這些菌均能引起油茶葉片發(fā)病。根據(jù)形態(tài)特征，可初步將這些菌分為三大類：第一類130 株，在PDA 平板上菌落圓形，邊緣整齊，菌絲生長(zhǎng)初期為白色絨狀，后期轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑驕\褐色。分生孢子長(zhǎng)橢圓形或圓柱形，兩端鈍圓或一端稍尖，單孢，無(wú)隔膜，無(wú)色；第二類為50 株，PDA 平板上菌落近圓形，白色，后期菌落中央呈淺褐色，由中央向外擴(kuò)展，有的呈輪紋狀，培養(yǎng)后期在PDA 培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生黑色油狀黏液，即為分生孢子堆。分生孢子為紡錘形或梭形，5 個(gè)細(xì)胞，有隔膜，頂端和基部細(xì)胞顏色淺，多為透明狀，中間3 個(gè)細(xì)胞顏色較深，多為褐色，頂端有2～4 根無(wú)色透明的附屬絲，基部有1 根短柄；第三類6 株，PDA平板上菌落圓形，中央墨綠色絨狀，邊緣白色，氣生菌絲濃密。分生孢子褐色或黃褐色，棍棒狀、倒梨形或卵形，有1～5 個(gè)橫隔膜，0～3 個(gè)縱斜隔膜，多數(shù)具有喙。根據(jù)菌株的形態(tài)特征，初步鑒定第一類為炭疽菌屬真菌，第二類為類擬盤多毛孢屬真菌，第三類為鏈格孢屬真菌，進(jìn)一步需要采用分子生物學(xué)方法確定。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)186 株菌株分別進(jìn)行不同基因擴(kuò)增測(cè)序，將獲得的序列與GenBank 中已知種序列進(jìn)行比對(duì)分析，并下載參考菌株構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，130株炭疽菌屬菌株聚為6 個(gè)分支（圖略），占總分離菌株的69.9%，其中56 株以99%的支持率與果生炭疽菌參考菌株聚為1 支，在湖南、海南、廣西，廣東和江蘇采樣點(diǎn)均有分布；6 株以99%的支持率與C. aeschynomenes參考菌株聚為1 支，全部采自湖南；40 株以98%的支持率與暹羅炭疽菌參考菌株聚為1 支，采自湖南、海南、廣西和廣東；9 株以99%的支持率與膠胞炭疽菌參考菌株聚為1 支，采自江蘇和湖南兩地；14 株以98%的支持率與山茶炭疽菌參考菌株聚為1 支，分布在湖南和廣東兩地；5 株為未知種Colletotrichumsp.。18 株擬盤多毛孢屬菌株，占總分離菌株的9.7%，其中3 株與秤鉤風(fēng)擬盤多毛孢菌（P. diploclisia）參考菌株聚為1 支，1 株與P. humus參考菌株聚為一支，1 株與P. parva參考菌株聚為一支，2 株與玫瑰紅擬盤多毛孢(P. rosea)參考菌株聚為一支，11 株為未知種Pestalotiopsissp.；4 株假擬盤多毛孢屬菌株聚為2 個(gè)分支，占總分離菌株的2.2%，其中1 株以100%的支持率與Pseudo. camelliae-sinensis參考菌株聚為1 支，3株為未知種Pseudopestalotiopsissp.；28 株新擬盤多毛孢屬菌株，占總分離菌株的15.6%，其中2 株與Neo.saprophyta參考菌株聚為1 支，3 株與Neo. cubana參考菌株聚為1 支，23 株為未知種Neopestalotiopsissp.。6 株鏈格孢屬菌株聚為3 個(gè)分支，占總分離菌株的3.2%，其中2 株以100%的支持率與鏈格孢參考菌株聚為1 支，1 株與細(xì)極鏈格孢參考菌株聚為一支，3 株未知種Alternariasp.。因此，基于形態(tài)學(xué)特征和rDNAITS、ApMat、TUB2，EF-1α 和Histone-3基因序列分析，可以確定油茶炭疽病斑中的致病菌有炭疽菌屬、擬盤多毛孢屬、新擬盤多毛孢屬、假擬盤多毛孢屬和鏈格孢屬真菌。

2.3 油茶炭疽病同一病斑分離出多種致病菌

對(duì)106 個(gè)病斑分離出的致病菌種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離出單一炭疽病菌的病斑55 個(gè)，而能同時(shí)分離出炭疽病菌和其他致病菌的病斑有51 個(gè)，占總分離病斑的48.1%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，油茶炭疽病斑復(fù)合致病菌的組合方式有7 種，分為炭疽菌屬（同屬不同種）真菌；炭疽菌屬和擬盤多毛孢屬或新擬盤多毛孢屬或假擬盤多毛孢屬或鏈格孢屬真菌；炭疽菌屬，擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬或鏈格孢屬真菌。其中炭疽菌屬和新擬盤多毛孢屬，炭疽菌屬和擬盤多毛孢屬致病菌這2 種組合方式最多，占總復(fù)合菌株病斑的41.2%和27.5%（圖1），分布在湖南、海南、廣西、廣東和江蘇樣品采集地，說(shuō)明復(fù)合菌株共同侵染的現(xiàn)象廣泛發(fā)生在我國(guó)油茶種植區(qū)；其次是炭疽菌屬（同屬不同種），占總復(fù)合菌株病斑的15.7%，分布在湖南，廣東和海南。試驗(yàn)結(jié)果表明，油茶炭疽病中存在炭疽菌屬真菌和其它致病菌復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

圖1 病斑分離出的致病菌組合方式Fig. 1 Combination pattern of pathogens isolated from symptomatic diseased tissues

2.4 油茶炭疽病斑中存在復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象

根據(jù)油茶炭疽病斑中分離出的復(fù)合致病菌，將炭疽菌屬和擬盤多毛孢屬，炭疽菌屬和新擬盤多毛孢屬，炭疽菌同屬不同種這3 種分離率最多的組合方式致病菌回接到油茶上，進(jìn)行復(fù)合侵染試驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，炭疽病菌和擬盤多毛孢屬真菌接種油茶葉片5 天，復(fù)合接種的葉片發(fā)病程度較只接同種炭疽菌的更嚴(yán)重，統(tǒng)計(jì)分析表明病斑直徑對(duì)比組間存在顯著差異（圖2A，2B，2C）；炭疽病菌和新擬盤多毛孢屬真菌復(fù)合接種的病斑顯著大于只接同種炭疽菌（圖2D，2E，2F）；不同種炭疽菌復(fù)合接種的病斑大小與只接同種炭疽病菌差異不顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明，油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象。為探究在其他寄主植物上是否也存在類似的現(xiàn)象，筆者在蘋果果實(shí)上進(jìn)行了復(fù)合侵染試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，炭疽病菌和新擬盤多毛孢屬真菌先后復(fù)合接種的病斑大于只接同種炭疽菌的病斑，統(tǒng)計(jì)分析差異顯著（圖2G，2H），說(shuō)明在其他寄主植物中也存在炭疽屬真菌和其它致病菌復(fù)合侵染現(xiàn)象。研究結(jié)果表明，油茶炭疽病斑中的炭疽菌屬、擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬真菌之間存在復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象。

圖2 油茶葉片和蘋果復(fù)合接種致病力測(cè)定Fig. 2 Symptoms of oil-tea leaves and apples after compound inoculation of pathogens

2.5 不同殺菌劑對(duì)油茶炭疽病復(fù)合病菌的抑制作用存在差異

6 種殺菌劑對(duì)油茶炭疽病致病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果顯示，啶酰菌胺和氟吡菌酰胺對(duì)炭疽菌屬和新擬盤多毛孢屬致病菌幾乎沒(méi)有抑制作用，在50 μg·mL-1供試濃度下，菌絲生長(zhǎng)抑制率在12.7%～43.3%之間（表2）。咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)μ烤揖鷮?、擬盤多毛孢和新擬盤多毛孢屬致病菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，EC50在0.011～0.555 μg·mL-1之間（表3）。嘧菌酯和啶氧菌酯對(duì)擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬真菌具有一定的抑制作用，EC50在0.007～0.020 μg·mL-1之間，但這2 種殺菌劑在50 μg·mL-1供試濃度下對(duì)炭疽菌的抑制作用較差。且同一殺菌劑對(duì)不同炭疽菌的抑制作用存在差異，嘧菌酯和啶氧菌酯對(duì)山茶炭疽菌C.camelliae的抑制作用強(qiáng)于果生炭疽菌C. fructicola、暹羅炭疽菌C. siamense 和膠胞炭疽菌C. gloeosporioides，這表明山茶炭疽菌對(duì)這兩種殺菌劑更為敏感。試驗(yàn)結(jié)果表明，在供試的6 種殺菌劑中，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)τ筒杼烤也?fù)合病菌的毒力較強(qiáng)，其次是嘧菌酯和啶氧菌酯，而啶酰菌胺和氟吡菌酰胺對(duì)復(fù)合病菌幾乎沒(méi)有抑制作用。

表3 4 種殺菌劑對(duì)油茶炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定①Tab. 3 Toxicity test of four fungicides against pathogens of Camellia oleifera

3 討論

3.1 油茶炭疽病菌的種類與分布

本研究分離獲得186 株致病菌，其中130 株為炭疽菌，56 株為果生炭疽菌，分離率最高，其次是暹羅炭疽菌、山茶炭疽菌和膠胞炭疽菌，這與李河等報(bào)道的果生炭疽菌是油茶炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病菌的結(jié)果一致（李河等，2014；2017；Li, 2019）。在樣本采集地湖南、海南、廣西，廣東和江蘇等地均發(fā)現(xiàn)存在果生炭疽菌，說(shuō)明這類病原菌分布范圍廣，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，這與李河等（2014）報(bào)道的結(jié)果一致。除果生炭疽菌以外，江蘇省只分離出膠胞炭疽菌，廣西省和海南省只分離出暹羅炭疽菌，14 株山茶炭疽菌中13 株來(lái)自于廣東省，這是否與病原菌種類的分布存在地理區(qū)域差異有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 植物病害中存在病原菌復(fù)合侵染現(xiàn)象

目前關(guān)于由多種病毒復(fù)合侵染引起植物病害的報(bào)道較多，如番茄褪綠病毒ToCV 和番茄黃化曲葉病毒TYLCV 復(fù)合侵染番茄植株，且影響與寄主和昆蟲(chóng)媒介的互作（Ontiveroset al., 2021）。趙麗玲等（2020）報(bào)道了中國(guó)南瓜曲葉病毒SLCCNV 和野茼蒿黃脈病毒CraYVV 復(fù)合侵染引起水茄發(fā)病，并發(fā)現(xiàn)在CraYVV 發(fā)生區(qū)域，病毒SLCCNV 與CraYVV 存在協(xié)同作用。在真菌引起的植物病害中也存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。張永樂(lè)等（2018）對(duì)山東省茶褐枯病病原菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病害是由圍小叢殼菌山茶?；停℅lomerella cingulatef. sp.camelliae）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）復(fù)合侵染引起的。錢恒偉等（2017）對(duì)青島市甘薯莖枯病的病原菌尖孢鐮刀菌和細(xì)極鏈格孢進(jìn)行了致病力研究，結(jié)果表明，這2 種病原菌均可引起甘薯莖枯病，且病原菌混合接種較單獨(dú)接種的發(fā)病率高，致病力強(qiáng)。李培琴等（2021）研究表明互隔交鏈孢（Alternaria alternata）和芍藥生擬盤多毛孢（Pestalotiopsis paeoniicola）既可單獨(dú)侵染也可復(fù)合侵染引起皇帝陵側(cè)柏葉枯病，且二者病原菌復(fù)合侵染比單獨(dú)接種時(shí)的發(fā)病率高，發(fā)病程度也更為嚴(yán)重。本研究對(duì)油茶炭疽菌屬、擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬致病菌進(jìn)行復(fù)合侵染試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合接種較先后均接種炭疽病菌的致病力強(qiáng)，發(fā)病程度更嚴(yán)重，這與李培琴等報(bào)道的Alternaria alternata和Pestalotiopsis paeoniicola復(fù)合侵染引起黃帝陵側(cè)柏葉枯病更嚴(yán)重的結(jié)果一致，表明油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象，這些病原在復(fù)合侵染過(guò)程中可能存在一定的互作，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。蘋果復(fù)合侵染試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，炭疽病菌、擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬致病菌之間極可能存在協(xié)同作用，在其它寄主植物內(nèi)可能也存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合侵染現(xiàn)象。

3.3 殺菌劑種類與病原菌抑菌效果的關(guān)系

甲氧基丙烯酸酯（QoI）類、琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI）類及甾醇脫甲基抑制劑(DMI)類殺菌劑是目前使用最多的三類殺菌劑，具有抗菌譜廣，活性高等特點(diǎn)（嚴(yán)明，2016）。DMI 類殺菌劑被廣泛應(yīng)用于炭疽病的防治。徐從英等（2021）報(bào)道了咪鮮胺對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病菌C. siamense的抑制活性最好。劉霞等（2013）研究發(fā)現(xiàn)咪鮮胺、戊唑醇和三唑酮對(duì)核桃炭疽病菌C.gloeosporioides的防治效果較好。本研究結(jié)果表明，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)τ筒杼烤也【–. fructicola、C. siamense、C. camelliae，C. gloeosporioides）均具有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)這兩種殺菌劑對(duì)油茶擬盤多毛孢和新擬盤多毛孢致病菌也具有較強(qiáng)的室內(nèi)毒力。由于DMI 類殺菌劑作用位點(diǎn)單一，容易產(chǎn)生抗性，后續(xù)可考慮與甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑復(fù)配使用。QoI 類和SDHI 類殺菌劑均為線粒體呼吸抑制劑，通過(guò)阻礙電子傳遞，影響細(xì)胞能量的合成和供給，從而抑制菌絲生長(zhǎng)。徐娜娜等（2021）研究表明氟吡菌酰胺和啶氧菌酯對(duì)牡丹炭疽病菌C. gloeosporioides的抑制活性較強(qiáng)，EC50值分別為0.013 8 μg·mL-1和0.032 4 μg·mL-1。這與高楊楊（2021）報(bào)道的辣椒炭疽菌（C. gloeosporioides、C. fructicola等）對(duì)氟吡菌酰胺和啶酰菌胺表現(xiàn)天然不敏感的結(jié)果不一致。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟吡菌酰胺和啶氧菌酯對(duì)油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae，C. gloeosporioides）的抑制活性較弱，表明不同寄主植物的同種病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性具有差異性。

本試驗(yàn)測(cè)定了6 種殺菌劑對(duì)油茶炭疽菌屬、擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬致病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，研究結(jié)果為油茶炭疽病的防治提供參考，但本試驗(yàn)工作均在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，環(huán)境條件較為穩(wěn)定，而田間施藥會(huì)受到多種因素如溫度、降雨等因子影響，藥劑的防治效果可能會(huì)有差異，因此本試驗(yàn)結(jié)果還需田間試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

對(duì)湖南、海南、廣西，廣東和江蘇5 地油茶成林葉部炭疽病斑的致病菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病同一病斑能分離出多種致病菌，并發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復(fù)合侵染協(xié)同增效現(xiàn)象；進(jìn)一步對(duì)油茶炭疽病斑中多種致病菌進(jìn)行防治藥劑篩選，結(jié)果表明咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果最好，可作為防治油茶炭疽病的首選殺菌劑。