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    甲烷氧化菌素模擬酶催化顯色法檢測(cè)小麥粉中過(guò)氧化鈣

    2023-08-08 01:05:18徐陽(yáng)辛嘉英王雨晴王貴儒尹一
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2023年14期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    徐陽(yáng),辛嘉英,2*,王雨晴,王貴儒,尹一

    (1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150076;2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000)

    過(guò)氧化鈣(CaO2)是一種常見(jiàn)的無(wú)機(jī)化合物,為淡黃色粉末,難溶于水,易溶于乙醚等有機(jī)溶劑,是常見(jiàn)的化工原料,在食品開(kāi)發(fā)、加工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在食品工業(yè)領(lǐng)域還可用作小麥粉增白劑、殺菌劑等[1-3],天然小麥粉一般呈乳白色或黃色,且不易加工成面團(tuán)[4],而將過(guò)氧化鈣添加到小麥粉中,既可以提高面筋韌性,還可以有效提高小麥粉的色澤,由于CaO2作為小麥粉添加劑會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成潛在危險(xiǎn),如食用過(guò)量會(huì)刺激腸道、誘發(fā)癌癥等[5],自2011 年,我國(guó)衛(wèi)生部門(mén)已經(jīng)全面禁止在小麥粉中添加過(guò)氧化鈣[6],為了防止一些生產(chǎn)廠商以此獲得利益,進(jìn)一步保障食品安全,維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益,小麥粉中過(guò)氧化鈣的檢測(cè)受到越來(lái)越多的關(guān)注及重視。常用的過(guò)氧化鈣檢測(cè)方法有物理法、化學(xué)法等[7-8],但這些方法在操作時(shí)通常會(huì)產(chǎn)生無(wú)法避免的誤差,導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果誤差較大、準(zhǔn)確度低。因此,酶法檢測(cè)被廣泛開(kāi)發(fā)。其中,過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)及其模擬酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品和生物領(lǐng)域[9-10],應(yīng)用前景良好。

    張玉榮等[11]提出酶法檢測(cè)小麥粉中CaO2含量,利用辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為生物催化劑,HRP 是常見(jiàn)的天然過(guò)氧化物酶,CaO2與硫酸反應(yīng)可生成H2O2,在碘化鉀(KI)的存在下,HRP 可催化H2O2氧化季胺,使其快速生成一種黃色物質(zhì),從而對(duì)小麥粉中CaO2進(jìn)行定量分析。此方法具有較高的精密度、準(zhǔn)確度及高靈敏度,但HRP 是天然過(guò)氧化物酶,易受外界環(huán)境因素如溫度、pH 值的影響。在一般的酶催化反應(yīng)進(jìn)程中,溫度越高,反應(yīng)速度越快,當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),天然酶會(huì)失活,降低反應(yīng)溫度,反應(yīng)速度也會(huì)下降。在上述反應(yīng)體系中,酸化后的溶液需將溶液pH 值調(diào)節(jié)至中性,在中性條件下,檢測(cè)才能進(jìn)行,這導(dǎo)致試驗(yàn)操作更加繁瑣、效率降低,從而存在一定局限性[12]。因此,使用穩(wěn)定性好、溫度和pH 值范圍廣的模擬酶替代天然酶,成為實(shí)現(xiàn)酶法檢測(cè)小麥粉中CaO2的關(guān)鍵。

    甲烷氧化菌是一類(lèi)以甲烷為能量來(lái)源及碳源的細(xì)菌,甲烷氧化菌素(methanobactin,Mb)是一種由甲烷氧化菌發(fā)酵分泌的菌素,具有抗氧化、抗菌作用[13-15]。它是一種小分子熒光肽,對(duì)銅有很強(qiáng)的親和力[16],Mb可以通過(guò)其來(lái)自2 個(gè)惡唑酮環(huán)的氮和來(lái)自2 個(gè)烯硫醇基團(tuán)的硫來(lái)配位單個(gè)Cu(II)離子[17],且與Cu 配位后具有良好的過(guò)氧化物酶活性,配位后的Mb-Cu 能在更寬的溫度和pH 值范圍內(nèi)催化反應(yīng)[18]。Xin 等[19]基于在Mb-Cu 的催化下,H2O2能快速氧化苯酚和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine,4-AAP)生成紅色醌亞胺的原理,建立了一種新的催化體系檢測(cè)小麥粉中CaO2。Mb 非常穩(wěn)定,在酸性介質(zhì)及50 ℃下也能保持良好的催化活性[20]。因此試驗(yàn)過(guò)程可省略調(diào)節(jié)pH 值這一步驟。此條件下,Mb 表現(xiàn)出較高的POD 活性,此檢測(cè)方法速度更快、操作過(guò)程更簡(jiǎn)單,并且試驗(yàn)結(jié)果良好、準(zhǔn)確度高,已成功應(yīng)用于小麥粉中過(guò)氧化鈣的測(cè)定。季胺是一類(lèi)可測(cè)定多種物質(zhì)的靈敏試劑,可作為底物被過(guò)氧化氫氧化從而顯色,并且可很好地溶于微酸性水溶液[21-22],由于過(guò)氧化鈣在酸性介質(zhì)中可生成H2O2,因此季胺作為底物可更好地應(yīng)用于小麥粉中過(guò)氧化鈣的檢測(cè)。

    基于Mb-Cu 的良好POD 活性,本文建立了Mb-Cu-KI-季胺新體系,利用Mb-Cu 催化過(guò)氧化氫氧化季胺顯色的原理檢測(cè)小麥粉中CaO2含量并優(yōu)化反應(yīng)條件,方法操作簡(jiǎn)單、速度快,可應(yīng)用于小麥粉CaO2的檢測(cè),為小麥粉中過(guò)氧化鈣的研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    小麥粉:市售;甲烷氧化菌:清華大學(xué)環(huán)境生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供;甲烷(99.99%):哈爾濱黎明氣體有限公司;甲醇、季胺(均為分析純):天津市福晨化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉(均為分析純):天津市天力化學(xué)試劑有限公司;大孔樹(shù)脂:美國(guó)Supelco 公司;五水合硫酸銅(分析純):汕頭市西隴化工工廠有限公司;過(guò)氧化鈣(75%):上虞潔華化工有限公司;磷酸氫二鈉(分析純):蘇州力坤精細(xì)化工有限公司;碘化鉀(分析純):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;濃硫酸(分析純):北京化學(xué)試劑公司;試驗(yàn)用水均為二級(jí)水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-2550 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):日本島津公司;FDU-1200 冷凍干燥機(jī):東京理化器械公司;HL-2S 恒流泵:上海滬西分析儀器廠;HDL 組合式紫外檢測(cè)器:上海金達(dá)公司;BLBI0-HYG-FJ2 生物反應(yīng)器搖床:上海百侖生物科技有限公司;RV8V 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:德國(guó)IKA 公司;BCD-215GM 冰箱:合肥美的電冰箱有限公司;DF-101S 磁力攪拌器:上海越眾儀器設(shè)備有限公司;HWS24 電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科技有限公司;800XL 顏色掃描器:上海中晶科技有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 甲烷氧化菌素的分離與純化

    參考文獻(xiàn)[13]的方法,配制無(wú)機(jī)鹽(nitrate mineral salt,NMS)培養(yǎng)基,以甲基彎菌(Methylosinus trichosporium)OB3b 為菌種,使用NMS 培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行121 ℃高溫滅菌、換氣,時(shí)間為5~6 d,將得到的發(fā)酵液離心30 min(8 000 r/min,4 ℃),離心后所得到的菌液上清液經(jīng)已活化的大孔樹(shù)脂吸附,在組合式紫外檢測(cè)器的檢測(cè)下,用60%甲醇溶液對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行洗脫,獲得Mb,通過(guò)34 ℃、130 r/min 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,液體狀Mb 再經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到粉末狀Mb,放入-30 ℃冰箱中備用。

    1.3.2 Mb-Cu 的制備

    將凍干后的Mb 配制成各個(gè)濃度的溶液置于比色皿中,放入紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),使用微量進(jìn)樣器向比色皿中每隔30 s 加入5 μL 濃度為10 nmol/L 的CuSO4溶液,觀察紫外光譜曲線,當(dāng)曲線逐漸趨于一致時(shí),減少CuSO4溶液的加入量,改為加入2 μL,直至曲線峰型不再變化,Mb-Cu 制備完成。

    1.3.3 過(guò)氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

    準(zhǔn)確稱(chēng)量1.55 g 過(guò)氧化鈣,加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的稀硫酸,磁力攪拌4 min,轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶,蒸餾水定容,再稀釋100 倍,獲得0.1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

    1.3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

    取3 只10 mL 比色管,分別加入0、0.5、1.0 mL CaO2標(biāo)準(zhǔn)使用液,再依次加入100 μL 季胺溶液、15 μL KI溶液、2 mL 磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)、Mb-Cu 溶液,蒸餾水定容至10 mL,置于50 ℃恒溫水浴中10 min,進(jìn)行紫外全光譜掃描。

    1.3.5 反應(yīng)條件的選擇

    以Mb-Cu 濃度(1.5×10-5~7.5×10-5mol/L)、季胺用量(0~200 μL)、KI 用量(0~30 μL)、反應(yīng)溫度(30~70 ℃)、體系pH 值(1~5)、反應(yīng)時(shí)間(0~20 min)為變量,探討其對(duì)催化反應(yīng)體系顯色的影響。

    1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    分別取標(biāo)準(zhǔn)工作液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 加入到10 mL 比色管中,再分別加入0.02 mol/L 季胺溶液60 μL、0.05 mol/L KI 溶液12 μL、50 μL Mb-Cu 溶液以及2 mL PBS 緩沖溶液(0.2 mol/L,pH4.7),蒸餾水定容至10 mL。50 ℃恒溫水浴10 min,于462 nm 處測(cè)定其吸光度,以過(guò)氧化鈣濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制過(guò)氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.7 精密度與準(zhǔn)確度的測(cè)定

    準(zhǔn)確稱(chēng)量1 g 小麥粉,加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的稀硫酸,攪拌均勻后,加蒸餾水定容至100 mL,混合均勻后轉(zhuǎn)入離心管,以5 000 r/min 離心10 min,離心結(jié)束后吸取上清液8 mL,依次加入100 μL 季胺、15 μL KI、50 μL Mb-Cu 溶液、2 mL PBS 緩沖溶液,再于50 ℃水浴中反應(yīng)10 min,于462 nm 處測(cè)定其吸光度,與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比可讀出過(guò)氧化鈣的含量。加標(biāo)濃度為100、200、400 mg/kg,試驗(yàn)以不添加過(guò)氧化鈣的小麥粉作為空白樣品,試驗(yàn)重復(fù)6 次,測(cè)定方法的精密度與準(zhǔn)確度。過(guò)氧化鈣含量的計(jì)算公式如下。

    式中:C 為小麥粉中過(guò)氧化鈣含量,μg/g;c 為標(biāo)準(zhǔn)曲線中過(guò)氧化鈣的濃度,mg/L;m 為樣品質(zhì)量,g;10 為定容體積,L;100 為稀釋倍數(shù)。

    1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制備

    在最佳條件下進(jìn)行顯色后,使用顏色掃描器收集顯色后的圖像,使用Photoshop 將顏色按照漸變規(guī)律合成圖像,制備過(guò)氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)比色卡。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)均重復(fù)6 次,采用SPSS 19.0 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析,采用Origin 8.5 進(jìn)行繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Mb 的表征

    Mb 呈淡黃色液體,其在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的檢測(cè)下吸收光譜如圖1 所示。

    由圖1 可知,在258、302、338、398 nm 四處有明顯吸收峰,表明Mb 結(jié)構(gòu)完整。

    2.2 Mb-Cu 的結(jié)合

    圖2 為Mb-Cu 配位的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。

    圖2 Mb-Cu 配位的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.2 UV-visible absorption spectrum of Mb-Cu complex

    由圖2 可知,在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的檢測(cè)下,隨著Cu2+的加入,在338 nm 和398 nm 處的吸收峰值逐漸下降,說(shuō)明Cu2+分別與Mb 中的4-羥基-5-硫酰咪(4-hydroxy-5-thioimidazole,HTI)和4-硫酰-5-羥基咪唑(4-thioyl-5-hydroxyimidazole,THI)結(jié)合,398 nm處吸收峰值降低說(shuō)明Cu2+與THI 中的S 原子配位;338 nm 處吸收峰值降低表明Cu2+與HTI 基團(tuán)中的S原子配位。當(dāng)338 nm 和398 nm 處的吸收峰值下降停止時(shí),表明配位結(jié)束,Mb 與Cu 配位完成,結(jié)合為Mb-Cu。

    2.3 反應(yīng)機(jī)理

    CaO2與硫酸反應(yīng)生成過(guò)氧化氫,在Mb-Cu 的催化下,以KI 為增敏劑可加快反應(yīng)速度,提高反應(yīng)效率,季胺作為反應(yīng)底物被氧化并伴有顯黃色反應(yīng),試驗(yàn)反應(yīng)方程式如下。

    總反應(yīng)(1)+(2)+(3)+(4)+(5)為:

    2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

    圖3 為紫外光譜吸收曲線。

    圖3 紫外光譜吸收曲線Fig.3 UV absorption spectra of the color system

    如圖3 所示,不含CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的曲線趨勢(shì)平穩(wěn),無(wú)吸收峰出現(xiàn),而含有CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的2 條曲線在462 nm 處均出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰,且隨著CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的增加,其吸光度也隨之增大,說(shuō)明在462 nm 處該顯色體系具有較高靈敏度,因此,測(cè)定波長(zhǎng)為462 nm。

    2.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化

    2.5.1 Mb-Cu 濃度對(duì)顯色的影響

    Mb-Cu 濃度對(duì)反應(yīng)顯色的影響,結(jié)果如圖4 所示。

    圖4 Mb-Cu 濃度對(duì)顯色的影響Fig.4 Influence of the Mb-Cu concentration on the absorbancy

    由圖4 可知,當(dāng)Mb-Cu 濃度在0~4.5×10-5mol/L時(shí),吸光度隨著Mb-Cu 濃度的增加而增大,說(shuō)明Mb-Cu 濃度越高,酶促反應(yīng)進(jìn)行的越快,當(dāng)Mb-Cu 濃度超過(guò)4.5×10-5mol/L 時(shí),吸光度呈下降趨勢(shì),說(shuō)明此時(shí)酶促反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束,當(dāng)Mb-Cu 的濃度為4.5×10-5mol/L時(shí),體系吸光度最高,因此Mb-Cu 的最適濃度為4.5×10-5mol/L。

    2.5.2 季胺用量對(duì)顯色的影響

    季胺用量對(duì)顯色的影響如圖5 所示。

    圖5 季胺用量對(duì)顯色的影響Fig.5 Influence of the quaternary ammonium dosage on the absorbancy

    季胺作為反應(yīng)底物,其用量在一定程度上會(huì)影響反應(yīng)顯色,如圖5 所示,在季胺用量為0~60 μL 時(shí),吸光度迅速增加,此時(shí),季胺用量與吸光度成正比,吸光度隨底物的增加而增大,當(dāng)季胺用量超過(guò)60 μL 時(shí),吸光度呈下降趨勢(shì),此時(shí),酶以及增敏劑消耗完畢,底物過(guò)多會(huì)造成吸光度降低,因此,試驗(yàn)選取季胺用量為60 μL。

    2.5.3 KI 用量對(duì)顯色的影響

    KI 用量對(duì)顯色的影響如圖6 所示。

    圖6 KI 用量對(duì)顯色的影響Fig.6 Influence of the KI dosage on the absorbancy

    KI 在體系中為增敏劑,可增加體系靈敏度,提高反應(yīng)速度,如圖6 所示,在0~12 μL 時(shí),吸光度快速增加,說(shuō)明在此區(qū)間內(nèi),KI 與反應(yīng)速度成正比;在12~18 μL時(shí),體系吸光度達(dá)到較高水平,此時(shí)反應(yīng)已達(dá)到飽和;超過(guò)18 μL 時(shí),吸光度逐漸降低,因此試驗(yàn)選取KI 用量為12 μL。

    2.5.4 反應(yīng)溫度對(duì)顯色的影響

    反應(yīng)溫度對(duì)顯色的影響如圖7 所示。

    圖7 反應(yīng)溫度對(duì)顯色的影響Fig.7 Influence of reaction temperature on the absorbancy

    酶催化反應(yīng)中,反應(yīng)溫度對(duì)酶催化速度產(chǎn)生重要影響,模擬酶通??梢酝ㄟ^(guò)提高反應(yīng)溫度加快反應(yīng)速度,比天然酶更耐高溫。由圖7 可知,吸光度隨著溫度的升高而增加,50 ℃時(shí)到達(dá)最高,且溫度過(guò)高M(jìn)b-Cu可能發(fā)生部分變性,最終導(dǎo)致失活,高溫也易發(fā)生副反應(yīng),因此試驗(yàn)選擇50 ℃作為反應(yīng)溫度。

    2.5.5 pH 值對(duì)顯色的影響

    pH 值對(duì)顯色的影響如圖8 所示。

    圖8 pH 值對(duì)顯色的影響Fig.8 Influence of pH on the absorbancy

    由圖8 可知,催化反應(yīng)需要在適宜pH 值環(huán)境下進(jìn)行,本試驗(yàn)選取pH 值范圍為1~5,采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值,結(jié)果表明,pH 值對(duì)顯色體系影響較小,可忽略不計(jì),說(shuō)明Mb-Cu 模擬酶不易受環(huán)境因素影響。因此,模擬酶催化反應(yīng)可省略調(diào)節(jié)pH 值這一過(guò)程,使試驗(yàn)更加簡(jiǎn)便。

    2.5.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色的影響

    反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色的影響如圖9 所示。

    圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色的影響Fig.9 Influence of reaction time on the absorbancy

    由圖9 可知,體系吸光度在反應(yīng)10 min 時(shí)達(dá)到最大,10 min 后幾乎不變,因此反應(yīng)時(shí)間為10 min。

    2.5.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在最佳反應(yīng)條件下,繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖10 所示。

    圖10 CaO2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 CaO2 standard curve

    由圖10 可知,體系中的CaO2濃度為0~10 mg/L時(shí),CaO2濃度與462 nm 處的吸光度呈正相關(guān)。線性方程為y=0.078 1x+0.019 6,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6。計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.75×10-4,檢出限(limit of detection,LOD)為1.82×10-2mg/L(相當(dāng)于2.25 mg/kg 小麥粉)。

    2.5.8 精密度與準(zhǔn)確度

    加標(biāo)回收結(jié)果如表1 所示。

    表1 加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)Table 1 Results of spike recovery(n=6)

    由表1 可知,平均加標(biāo)回收率為99.21%~100.35%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為0.31%~1.22%,試驗(yàn)結(jié)果表明上述檢測(cè)小麥粉中過(guò)氧化鈣含量的方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

    2.5.9 標(biāo)準(zhǔn)比色卡

    過(guò)氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)比色卡如圖11 所示。根據(jù)反應(yīng)后的顏色變化,可直接將過(guò)氧化鈣含量與標(biāo)準(zhǔn)色卡進(jìn)行比較,實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化鈣含量的可視化檢測(cè)。

    圖11 CaO2 標(biāo)準(zhǔn)比色卡Fig.11 CaO2 standard colorimetric card

    3 結(jié)論

    本文建立并優(yōu)化了甲烷氧化菌素模擬酶催化顯色法測(cè)定小麥粉中過(guò)氧化鈣的方法,根據(jù)過(guò)氧化鈣與硫酸反應(yīng)生成過(guò)氧化氫的原理,利用Mb-Cu 模擬過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫,并在碘化鉀存在的條件下氧化季胺顯色,建立了對(duì)小麥粉中過(guò)氧化鈣含量測(cè)定的目視比色法,本方法可操作性強(qiáng)、操作步驟簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠,適用于過(guò)氧化鈣的檢測(cè)。

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