周雅情,王瑩,王昱灃
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)
牛排菇(Fistulln hepatica),又名褐蘑菇、洋松茸、波多黎各菌、牛舌菌、豬肝菌,屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬,是雙孢蘑菇的近緣種[1]。其菌肉厚實緊密,口味獨特,暢銷歐美諸多國家,后被我國長江中下游地區(qū)引進(jìn)且成功馴化栽培。牛排菇含有豐富的蛋白質(zhì),其脂肪和膽固醇含量較低[2]。牛排菇可增加礦物質(zhì)含量[3],降低肌肉蛋白質(zhì)的損失、抑制胸腺萎縮和減少類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[4]。此外,研究者發(fā)現(xiàn)牛排菇不僅能預(yù)防腫瘤[5],還能通過生成白細(xì)胞介素來調(diào)節(jié)腸道免疫力[6]。牛排菇的營養(yǎng)功能和潛在的多種藥用價值賦予其廣闊的市場開發(fā)前景。
食用菌源多肽的研究近年來得到重視,相關(guān)多肽的提取研究和功能性價值被不斷報道,如利用靈芝水解物可分離出抗氧化肽[7],從羊肚菌中可發(fā)現(xiàn)一種具有腫瘤預(yù)防功能的新型多肽等[8]。食用菌源多肽不僅分子量小容易被人體吸收,且其食用安全,用于疾病預(yù)防和治療時,對人體沒有副作用,可以替代很多藥物用于人體治療[9]。但牛排菇多肽方面的研究目前鮮有報道,僅見劉瑩[10]利用耗時較長的水提醇沉法獲得該多肽。關(guān)于多肽的提取主要有酶解法、發(fā)酵法、化學(xué)合成法[11]。發(fā)酵法是利用微生物在適宜條件下發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶將原料代謝分解成多肽等小分子,此方法成本低但是過程不易于控制,生成的產(chǎn)物具有不確定性[12]?;瘜W(xué)合成法則對技術(shù)要求高,工藝繁瑣,多不被采用。酶解法在食品和生物醫(yī)藥業(yè)中應(yīng)用性很高,因為酶解的過程中不會加入有機溶劑,也不會產(chǎn)生對人體有毒害的物質(zhì),整個反應(yīng)體系便于調(diào)控[13]。因此本研究擬以珍稀食用菌——牛排菇為原料,采用酶解法進(jìn)行多肽提取,通過對反應(yīng)時間、底物濃度、pH 值、溫度、加酶量進(jìn)行考察,利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化多肽提取工藝,以期為后續(xù)該多肽的活性研究及相關(guān)功能產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗基礎(chǔ)。
牛排菇:市售;氫氧化鈉、甲醛(均為分析純):廣東光華科技股份有限公司;鹽酸(分析純):南京化學(xué)試劑有限公司;酸性蛋白酶(10 000 U/g)、堿性蛋白酶(20 000 U/g)、胃蛋白酶(3 000 U/g)、木瓜蛋白酶(80 000 U/g):南寧龐博生物工程有限公司;胰酶(4 000 U/g):上海麥克林生化科技有限公司。
電熱恒溫水槽(DK-8D 型):上海森信實驗儀器有限公司;電子天平(CP124C)、pH 計(STARTER 3100):奧豪斯儀器(上海)有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9240MBE):上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;離心機(TDZ5-WS):長沙湘智離心機儀器有限公司;高速多功能粉碎機(RHP-400):浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司。
1.3.1 牛排菇多肽提取工藝
將牛排菇清洗干凈后在50 ℃下烘干,粉碎,過100 目篩。稱量1.00 g 蘑菇粉,根據(jù)不同底物濃度加入水后混勻,放置在指定溫度的水浴鍋中預(yù)熱10 min,用1 mol/L NaOH 和HCl 溶液調(diào)節(jié)至適宜pH 值,然后根據(jù)一定的加酶量加入對應(yīng)的蛋白酶,再次混勻后放置水浴鍋中水浴一定時間。水浴結(jié)束后在100 ℃下滅酶10 min,冷卻后在4 000 r/min 下離心20 min,取上清液得粗多肽[14]。
1.3.2 蛋白酶篩選
將酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶5 種酶分別在各自的最適pH 值和最適溫度下對牛排菇進(jìn)行酶解,各自最適條件見表1[15]。根據(jù)1.3.1步驟,加酶量設(shè)為3 000 U/g,每隔1 h 測定不同蛋白酶對酶解過程中水解度的影響,持續(xù)6 h,篩選出最佳蛋白酶[16-17]。
表1 不同蛋白酶最適的pH 值和溫度Table 1 Optimal pH value and temperature of different proteases
1.3.3 單因素試驗
1.3.3.1 反應(yīng)時間對酶解效果的影響
固定底物濃度為4%,溫度為45 ℃,pH 值為7,加酶量3 000 U/g,分別設(shè)置反應(yīng)時間為1、2、3、4、5、6 h,以水解度為指標(biāo),考察不同反應(yīng)時間對水解度的影響。
1.3.3.2 底物濃度對酶解效果的影響
固定pH 值為8,溫度為45 ℃,反應(yīng)時間4 h,加酶量3 000 U/g,分別設(shè)置底物濃度為3%、4%、5%、6%、7%,以水解度為指標(biāo),考察不同底物濃度對水解度的影響。
1.3.3.3 pH 值對酶解效果的影響
當(dāng)反應(yīng)條件設(shè)為底物濃度為4%,溫度為45 ℃,反應(yīng)時間4 h,加酶量3 000 U/g,分別設(shè)置pH 值為6、7、8、9、10,以水解度為指標(biāo),考察不同pH 值對水解度的影響。
1.3.3.4 溫度對酶解效果的影響
當(dāng)反應(yīng)條件設(shè)為底物濃度為4%,pH 值為7,反應(yīng)時間4 h,加酶量3 000 U/g,分別設(shè)置溫度為40、45、50、55、60 ℃,以水解度為指標(biāo),考察不同溫度對水解度的影響。
1.3.3.5 加酶量對酶解效果的影響
當(dāng)反應(yīng)條件設(shè)為底物濃度為4%,pH 值為7,溫度為45 ℃,反應(yīng)時間4 h,分別設(shè)置加酶量為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g,以水解度為指標(biāo),考察不同加酶量對水解度的影響。
1.3.4 響應(yīng)面試驗
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇對水解度影響較大的反應(yīng)時間、底物濃度、pH 值、加酶量4 個因素為自變量,以水解度為響應(yīng)值,進(jìn)行Box-Behnken 試驗設(shè)計,因素水平如表2 所示。
表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計因素水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design
1.3.5 總氮量測定
根據(jù)GB 5009.5—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定牛排菇中總氮量。
1.3.6 氨基態(tài)氮含量測定
取5 mL 酶解液,加入60 mL 去CO2水(蒸餾水超聲20 min),混勻,用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至8.2,加入20 mL 中性甲醛溶液(取50 mL 甲醛加入3 mL 0.5%酚酞指示劑,用0.1 mol/L NaOH 滴加至顏色變?yōu)槲⒎奂t色,現(xiàn)配現(xiàn)用),用0.1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至9.2,記錄加入甲醛后所消耗的氫氧化鈉體積??瞻讓φ沼?5 mL 水重復(fù)上述試驗,記錄加入甲醛后消耗的體積[18]。氨基態(tài)氮含量計算公式如下[19]。
式中:M 為氨基態(tài)氮含量,mg/mL;C 為氫氧化鈉濃度,mol/L;V1為空白對照加入甲醛后消耗氫氧化鈉的體積,mL;V2為樣液加入甲醛后消耗氫氧化鈉的體積,mL;V3為所取樣液體積mL;14 為氮元素的相對分子質(zhì)量,g/mol。
1.3.7 水解度測定
水解度計算公式如下。
式中:h 為水解度,%;A 為氨基態(tài)氮含量,mg/mL;B 為總氮含量,mg/mL。
每組試驗重復(fù)3 次,試驗結(jié)果利用SAS V8 中單因素方差分析Duncan 法進(jìn)行顯著性分析,并用Origin 8.5 軟件作圖。通過Design-Expert 8.0.6 設(shè)計響應(yīng)面試驗,并對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及二次多項式回歸擬合,當(dāng)P<0.05 時,結(jié)果具有顯著差異。
胰酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶5 種酶的水解度結(jié)果如圖1 所示。
圖1 不同種類酶對酶解程度的影響Fig.1 Effects of different kinds of enzymes on the degree of enzymatic hydrolysis
由圖1 可知,在同一時間下,幾種酶對牛排菇酶解的程度依次為胰酶>木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶>胃蛋白酶>酸性蛋白酶。因為不同酶的酶切位點不同,酶解效果不一樣,結(jié)果顯示胰酶水解度明顯高于其他4 種酶,所以選擇胰酶對牛排菇進(jìn)行酶解。
2.2.1 反應(yīng)時間對水解度的影響
不同反應(yīng)時間對酶解效果的影響如圖2 所示。
圖2 不同反應(yīng)時間對酶解效果的影響Fig.2 Effects of different reaction times on enzymatic hydrolysis
由圖2 可知,隨著反應(yīng)時間延長,水解度增加,到達(dá)5 h 后雖有所下降,但是并不顯著(P>0.05)。因為酶解時間過短,酶與底物的接觸時間不足,影響酶解效果,當(dāng)酶解時間過長,則酶解過度,使多肽分解成小分子氨基酸。又因為4 h 與5 h 的水解度并沒有顯著差異(P>0.05),從節(jié)能節(jié)時角度考慮,4 h 可作為酶解時間的中心點。
2.2.2 底物濃度對水解度的影響
不同底物濃度對酶解效果的影響如圖3 所示。
圖3 不同底物濃度對酶解效果的影響Fig.3 Effects of substrate concentrations on enzymatic hydrolysis
由圖3 可知,隨著底物濃度增加,水解度先增加后降低,在底物濃度為4%時水解度達(dá)到最大。當(dāng)?shù)孜餄舛忍髸r,酶與底物不能充分接觸,導(dǎo)致反應(yīng)不完全,而當(dāng)?shù)孜餄舛忍r,酶的濃度被稀釋,影響了酶解反應(yīng)的進(jìn)行[20-21]。因此選擇3%、4%和5%作為底物濃度的3 個水平進(jìn)行后續(xù)試驗。
2.2.3 pH 值對水解度的影響
不同pH 值對酶解效果的影響如圖4 所示。
圖4 不同pH 值對酶解效果的影響Fig.4 Effects of different pH values on enzymatic hydrolysis
由圖4 可知,水解度隨著pH 值的增大先升高后降低。每種酶都有最適pH 值范圍,過高或過低都會直接影響酶活,當(dāng)pH 值大于7 時,酶的生物活性下降,其酶解能力也隨之下降[22]。所以選擇6、7、8 作為pH 值的3 個水平進(jìn)行后續(xù)試驗。
2.2.4 溫度對水解度的影響
不同溫度對酶解效果的影響如圖5 所示。
圖5 不同溫度對酶解效果的影響Fig.5 Effects of different reaction temperatures on enzymatic hydrolysis
由圖5 可知,隨著反應(yīng)溫度的升高,其水解度先升高后降低,在45 ℃達(dá)到最高點。因為溫度適當(dāng)上升,可以增加酶活力,提高酶促反應(yīng)速率,但是溫度過高會破壞酶的結(jié)構(gòu),使得酶活性降低[23]。因此選擇45 ℃作為后續(xù)試驗的最適溫度,不再對反應(yīng)溫度進(jìn)一步優(yōu)化。
2.2.5 加酶量對水解度的影響
不同加酶量對酶解效果的影響如圖6 所示。
圖6 加酶量對酶解效果的影響Fig.6 Effects of different enzyme additions on enzymatic hydrolysis
由圖6 可知,隨著加酶量的增加,底物水解度不斷升高,超過8 000 U/g 后增加不顯著(P>0.05),這是因為隨著加酶量增加,酶與底物結(jié)合位點不斷增加,水解程度不斷加大,但是當(dāng)加酶量達(dá)到一定程度,結(jié)合位點趨向飽和,繼續(xù)提高加酶量也不會提升水解效果[24]。又因為加酶量在8 000 U/g 與10 000 U/g 時不顯著(P>0.05),所以選擇加酶量6 000、8 000、10 000 U/g 3 個水平進(jìn)行后續(xù)試驗。
2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果
Box-Behnken 設(shè)計試驗方案和結(jié)果見表3,方差分析見表4。
表3 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results
表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface experimental design
采用Design-Expert.8.0.6 軟件得到響應(yīng)值與各影響因素之間的二元多項式回歸方程:水解度=57.41+1.44A-2.11B+2.55C+1.31D+0.13AB+0.11AC-1.21AD-0.088BC-0.13BD+0.66CD+0.91A2-0.053B2+0.092C2-0.97D2。
續(xù)表3 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果Continue table 3 Response surface experimental design and results
通過表4 結(jié)果可知,該模型P<0.000 1<0.01 說明該響應(yīng)面擬合模型極顯著,可以較好地反映試驗因素對響應(yīng)值的影響,失擬項P=0.363 7,不顯著(P>0.05),說明回歸模型擬合程度良好,非試驗因素對試驗結(jié)果影響較小。決定系數(shù)R2值越接近1,說明模型的預(yù)測值與實際值越接近,該模型R2=0.982 3,矯正后模型決定系數(shù)R2Adj=0.964 5,說明該回歸方程擬合度較好,可以用此模型分析和預(yù)測各因素對水解度的影響。由F值得到各因素對水解度影響的主次順序為C>B>A>D,所以對牛排菇多肽的水解度影響最大的是加酶量,然后是底物濃度、反應(yīng)時間,最后是pH 值。由回歸方程和方差分析可知,模型中各因素對水解度的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.01);對于交互項因素而言,AD 交互作用極顯著(P<0.01)、CD 因素的交互作用顯著(P<0.05)。對于二次項因素而言,A2、D2因素的交互作用均極顯著(P<0.01)。
2.3.2 工藝優(yōu)化與驗證試驗
為了進(jìn)一步確定提取的最佳工藝條件,利用Design-Expert 8.0.6 分析,最終分析得到牛排菇多肽的最佳提取工藝條件為反應(yīng)時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶(胰酶)量9 998.11 U/g、多肽水解度的預(yù)測值為59.97%??紤]實際情況,調(diào)整提取工藝為反應(yīng)時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶(胰酶)量10 000 U/g。為檢驗試驗結(jié)果與真實情況的一致性和可靠性,進(jìn)行3 次驗證試驗,在最佳工藝條件下,水解度實測值為59.17%,與預(yù)測值相差0.8%,該響應(yīng)面法優(yōu)化所得的最佳工藝條件有較好的實際應(yīng)用價值。
本研究以牛排菇為原料,利用胰酶進(jìn)行酶解獲得其多肽,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,對酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,得到最優(yōu)條件:反應(yīng)時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶(胰酶)量10 000 U/g。在最優(yōu)工藝條件下牛排菇多肽的水解度與理論值接近,該響應(yīng)面模型準(zhǔn)確可靠,具有實際應(yīng)用價值。本文對牛排菇多肽的深入研究提供了試驗基礎(chǔ),后續(xù)將進(jìn)而探究牛排菇多肽的特性和生物活性。