韓秀枝,曹源,詹躍勇,2,秦令祥,2,3*
(1.漯河食品職業(yè)學(xué)院,河南 漯河 462300;2.漯河市食品研究院有限公司,河南 漯河 462300;3.河南和生食品有限公司,河南 漯河 462300)
萬壽菊(Tagetes erecta L.),又名金盞花、臭芙蓉等,是一年生草本植物,屬被子植物門、雙子葉植物綱、菊目、菊科、萬壽菊屬,原產(chǎn)于墨西哥及中美洲,在我國各地均有種植。萬壽菊中含有多糖、黃酮、揮發(fā)油、氨基酸、生物堿、萜類等多種功能成分[1-6],具有提高免疫力[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]、抑菌[11]、降血脂[12]和抗動脈粥樣硬化[13]等功效。萬壽菊黃酮(Tagetes erecta L.flavonoids,TEF)是萬壽菊中主要的生物活性成分之一,具有較高食用和保健價值,其花中含有的黃酮較多。
目前,常用的黃酮提取方法有熱回流法、溶劑法、微波法、超聲波法等[14],這些方法各有利弊。郭耀東等[5]在常壓條件下采用超聲輔助提取TEF,得到了最佳工藝條件;上述方法大都需要高溫或高壓或常壓,容易導(dǎo)致黃酮被破壞[15-16]。負(fù)壓技術(shù)利用原料在真空負(fù)壓下產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化和機(jī)械效應(yīng),使其細(xì)胞壁在較低溫度下破碎,其活性成分不易降解,最大限度地保留其生物活性。超聲法一般是在常壓下進(jìn)行,其提取溫度通常較高,容易使黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生降解和活性降低。為了彌補(bǔ)常壓法和黃酮在高溫下會降解的不足,本文擬采用負(fù)壓協(xié)同超聲波輔助提取TEF,利用Design-Expert 軟件設(shè)計優(yōu)化提取條件,通過數(shù)學(xué)模型獲得最佳條件,同時研究其抗氧化活性和抑菌活性,為TEF 的提取、應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化提供參考。
萬壽菊:亳州中藥材市場;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%):北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司;硫酸亞鐵、無水乙醇、氫氧化鈉、三氯甲烷、硝酸鋁、亞硝酸鈉、水楊酸、過氧化氫、四氯化碳、正丁醇、聯(lián)苯雙酯、維生素C(均為分析純):南京化學(xué)試劑股份有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-bitter hydrazine,DPPH)試劑:武漢卡諾斯科技有限公司。
超聲波清洗器(KM-300DE):昆山美美超聲儀器有限公司;無油真空泵(VP-1800V):東莞市盛飛真空設(shè)備有限公司;臺式高速離心機(jī)(TD6M):紹興市蘇珀儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE500):上海遠(yuǎn)懷實(shí)業(yè)有限公司;紫外可見分光光度計(N6000S):青島精誠儀器儀表有限公司;手提式高速萬能粉碎機(jī)(DFT-50):上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司;臺式真空干燥箱(DZF-6020):中新醫(yī)療儀器有限公司。
1.3.1 萬壽菊預(yù)處理
將萬壽菊清洗干凈,置于低溫烘箱烘干,再用粉碎機(jī)粉碎,過0.18 mm 篩,備用。
1.3.2 TEF 的提取流程
萬壽菊粉→按料液比1∶20(g/mL)加入70%乙醇溶液→放入超聲波清洗器中,按照負(fù)壓協(xié)同超聲波輔助法的條件提取→離心(5 000 r/min,15 min)→濃縮→純化[17](AB-8 型大孔樹脂)→濃縮→真空干燥→制得TEF。
1.3.3 TEF 得率測定
參照符群等[18]的方法,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法測定。TEF 得率(A,%)的計算公式如下。
式中:C 為提取液的質(zhì)量濃度,mg/mL;V 為提取液的體積,mL;M 為萬壽菊樣品質(zhì)量,mg。
1.3.4 TEF 提取單因素試驗(yàn)
以TEF 得率為指標(biāo),固定乙醇濃度70%、料液比1∶20(mg/mL)、提取溫度50 ℃、負(fù)壓0.08 MPa、超聲波功率400 W、超聲時間30 min。分別考察不同負(fù)壓(0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 MPa)、超聲功率(250、300、350、400、450 W)、超聲時間(10、20、30、40、50 min)對TEF 得率的影響,每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以TEF 得率為響應(yīng)值,利用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計。試驗(yàn)因素與水平見表1。
表1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Test factors and levels
1.3.6 抗氧化活性的測定
1.3.6.1 DPPH 自由基清除能力測定
根據(jù)吳楊洋等[19]的方法進(jìn)行測定。
1.3.6.2 羥基自由基清除能力測定
根據(jù)王迦琦等[20]的方法進(jìn)行測定。
1.3.7 抑菌活性的測定
根據(jù)李曉嬌等[21]的方法,利用2 倍稀釋法,將TEF用無菌水配成系列梯度濃度的樣品液,備用。采用龔祥等[22]的濾紙片法,將圓形濾紙片滅菌后,放在含供試菌的培養(yǎng)皿上,用移液管移取5 μL TEF 樣品液滴在濾紙片上,置于生化培養(yǎng)箱中,35 ℃培養(yǎng)24 h,測其抑菌圈直徑,加無菌水的濾紙片作對照,最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)為開始出現(xiàn)抑菌圈時的濃度。
1.3.8 數(shù)據(jù)處理
各試驗(yàn)均重復(fù)3 次取平均值。采用SPSS 軟件和Design-Expert 12 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2.1.1 負(fù)壓對TEF 得率的影響
負(fù)壓對TEF 得率的影響見圖1。
圖1 負(fù)壓對TEF 得率的影響Fig.1 The effect of negative pressure on TEF yield
由圖1 可知,隨著負(fù)壓的升高,TEF 得率先升高后下降,在負(fù)壓為0.08 MPa 時,達(dá)到最大值。這是由于負(fù)壓升高,負(fù)壓作用于料液產(chǎn)生的空化氣泡增多,其空化效應(yīng)和機(jī)械振動作用增強(qiáng),導(dǎo)致萬壽菊細(xì)胞壁破裂速度、程度和數(shù)量增加,胞內(nèi)黃酮擴(kuò)散、溶解增多,得率升高;當(dāng)負(fù)壓為0.08 MPa 時,由負(fù)壓導(dǎo)致的細(xì)胞破裂基本完全,黃酮溶出基本徹底,再繼續(xù)升高負(fù)壓,提取溫度會下降,黃酮的擴(kuò)散、溶出減小,得率略有下降。因此,負(fù)壓取0.08 MPa 為宜。
2.1.2 超聲功率對TEF 得率的影響
超聲功率對TEF 得率的影響見圖2。
圖2 超聲功率對TEF 得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic power on TEF yield
由圖2 可知,隨著超聲功率的增大,TEF 得率先升高后略有降低,在400 W 時達(dá)到最高。這是因?yàn)槌暪β试龃?,其空化、機(jī)械效應(yīng)增強(qiáng),萬壽菊細(xì)胞的破裂程度、數(shù)量增大,得率提高;當(dāng)超聲功率400 W 時,細(xì)胞破裂基本完全,黃酮基本溶出完全,再繼續(xù)增大超聲功率,黃酮溶出也不再增加,反而過高的超聲功率會破壞部分黃酮結(jié)構(gòu),降低其得率。因此,超聲功率取400 W 為宜。
2.1.3 超聲時間對TEF 得率的影響
超聲時間對TEF 得率的影響見圖3。
圖3 超聲時間對TEF 得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on TEF yield
由圖3 可知,隨著超聲時間的延長,TEF 得率呈先升高后下降的趨勢,并在30 min 時達(dá)到最大。這是因?yàn)槌晻r間延長,超聲波的空化和機(jī)械作用增強(qiáng),萬壽菊細(xì)胞壁破裂程度和數(shù)量增大,黃酮溶出增多,得率提高;當(dāng)時間超過30 min 后,過長的超聲時間,會使部分黃酮結(jié)構(gòu)破壞,得率下降。因此,超聲時間取30 min為宜。
2.2.1 回歸方程的建立
在單因素的基礎(chǔ)上,以負(fù)壓(A)、超聲功率(B)和超聲時間(C)為3 個影響因素,TEF 得率(Y)為響應(yīng)值,試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results
采用Design-Expert 12 軟件,對表2 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到回歸方程Y=5.16+0.352 5A+0.053 8B+0.108 8C+0.042 5AB-0.032 5AC-0.030 0BC-0.730 0A2-0.852 5B2-0.757 5C2。
2.2.2 回歸模型的方差分析
對上述回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。
表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of regression model
由表3 可知,該回歸模型的P<0.01,表明模型極顯著;失擬項P=0.151 5>0.05,不顯著,擬合度較好,說明該模型可信度高;另外,模型的決定系數(shù)R2=0.999 7,說明模型擬合程度良好。R2Adj=0.999 2,說明該模型能解釋99.92%響應(yīng)值的變化,自變量和響應(yīng)值間線性關(guān)系顯著。綜上所述,該模型可用于TEF 的提取工藝優(yōu)化。從顯著性結(jié)果可知,A、B、C、AB、A2、B2和C2項影響極顯著(P<0.01),AC、BC 影響顯著(P<0.05)。根據(jù)F 值大小可知,各因素影響順序?yàn)锳>C>B。
2.2.3 響應(yīng)面分析
利用Desgin-Expert 12 軟件繪制的各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線見圖4。
圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.4 Response surface and contour map of interaction of various factors
由圖4 可知,AC 和BC 響應(yīng)面較彎曲,等高線呈橢圓形,說明AC 和BC 之間的交互作用顯著(P<0.05),AB 的響應(yīng)曲面更陡峭,曲面更彎曲,說明該交互作用極顯著(P<0.01),這與方差分析結(jié)果一致。
2.2.4 最佳條件的預(yù)測及驗(yàn)證試驗(yàn)
通過模型的建立,預(yù)測最佳工藝條件為負(fù)壓0.082 MPa、超聲功率401.81 W、超聲時間30.66 min,理論TEF 得率為5.21%??紤]到實(shí)際操作,對最佳工藝條件修正為負(fù)壓0.08 MPa、超聲功率402 W、超聲時間30 min,對此條件下建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),重復(fù)3 次,得到實(shí)際TEF 得率平均值為5.18%,與預(yù)測值相對誤差0.58%,表明該模型可靠。
2.3.1 DPPH 自由基清除能力
不同濃度的TEF 對DPPH 自由基的清除能力見圖5。
圖5 不同濃度的TEF 對DPPH 自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of different concentrations of TEF on DPPH free radicals
由圖5 可知,隨著TEF 和VC質(zhì)量濃度的增大,其清除DPPH 自由基的能力均不斷增強(qiáng)。當(dāng)TEF 濃度為250 μg/mL 時,清除率為81.73%,弱于同濃度的VC,說明其在適宜的濃度下,有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基能力。
2.3.2 羥基自由基清除能力
不同濃度的TEF 對羥基自由基的清除活性見圖6。
圖6 不同濃度的TEF 對羥基自由基的清除活性Fig.6 The scavenging activity of different concentrations of TEF on hydroxyl radicals
由圖6 可知,隨著TEF 和VC質(zhì)量濃度的增大,其羥基自由基清除能力逐漸增強(qiáng),并呈正相關(guān),當(dāng)TEF濃度為250 μg/mL 時,羥基自由基清除率為83.28%,比同濃度的VC略低,表明其在適宜的濃度下,具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力。
不同質(zhì)量濃度TEF 抑菌活性結(jié)果見表4。
表4 不同質(zhì)量濃度TEF 抑菌活性結(jié)果Table 4 The bacteriostatic activity results of TEF with different mass concentrations
由表4 可知,TEF 在一定質(zhì)量濃度下,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用,而對照組無抑菌圈出現(xiàn)。TEF 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL,且抑菌效果隨著TEF 質(zhì)量濃度的增加不斷增強(qiáng)。
本試驗(yàn)采用負(fù)壓協(xié)同超聲波輔助提取TEF,并經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝,得到最佳提取工藝條件為負(fù)壓0.08 MPa、超聲功率402 W、超聲時間30 min,在此條件下,TEF 得率為5.18%。TEF 抗氧化活性研究表明,隨著TEF 濃度的增加,其對DPPH 自由基和羥基自由基的清除能力逐漸增強(qiáng),當(dāng)其濃度為250 μg/mL 時,清除率分別為81.73%和83.28%,表明TEF 抗氧化能力較強(qiáng),是一種理想的天然抗氧化劑。TEF 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑菌作用,最低抑菌濃度分別為1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL,且隨著TEF 濃度的增加而不斷增強(qiáng)。本試驗(yàn)可為TEF 的提取及應(yīng)用提供理論依據(jù)。