番石榴葉黃酮超聲輔助低共熔溶劑提取工藝及品種差異

羅朝丹，任二芳，黃燕婷，李建強(qiáng)*，蘇艷蘭，馮春梅，羅小杰，程三紅

（1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西亞熱帶水果加工工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530001）

番石榴葉，為桃金娘科植物番石榴（Psidium guajava Linn.）的葉，具有燥濕健脾，清熱解毒之功效。由于其具有良好的降血糖作用，在民間廣泛用于降糖治療[1]。番石榴葉顯著的降糖活性，是其食療產(chǎn)品研發(fā)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，黃酮類化合物是番石榴提取物降血糖功能的有效成分[2-3]。番石榴苷（槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷）、萹蓄苷（廣寄生苷）、瑞諾苷（槲皮素-3-O-β-D-木糖苷）和槲皮素是番石榴葉中主要的4 種黃酮類成分[4-5]，且已被證實(shí)是番石榴葉降糖、抑制游離脂肪酸釋放的主要活性物質(zhì)基礎(chǔ)[6]，在抗糖尿病方面具有潛力[7]。此外，番石榴葉中的黃酮化合物具有抗氧化、抑菌等生物活性[8-10]，是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ氖称诽砑觿?，可在食品加工和貯藏中應(yīng)用[11]。然而目前，鮮見番石榴葉黃酮含量品種差異及積累規(guī)律的分析研究。

黃酮的提取方法有溶劑提取、微波輔助提取、超臨界輔助萃取、酶浸漬萃取、超聲波輔助提取、回流、索氏提取、煎煮法和滲濾等。低共熔溶劑[12]（deep eutectic solvents，DES）是由氫鍵受體和氫鍵供體通過氫鍵交互影響形成的一個(gè)新體系，是一種綠色混合溶劑，具有環(huán)保無毒、生物相容性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)[13]，已應(yīng)用于野菊花[14]、雞骨草[15]、葛根[16]、黃芩[17]等植物黃酮成分的提取。以超聲波輔助DES 提取可顯著提高有效成分的提取率，且可改善現(xiàn)有技術(shù)存在的耗時(shí)長、操作繁瑣或長時(shí)間熱效應(yīng)導(dǎo)致有效成分分解氧化等弊端。本研究采用超聲波輔助DES 法對(duì)番石榴葉進(jìn)行提取，并分析總黃酮及4 種主要黃酮類成分的品種差異，以期從10 個(gè)代表性番石榴品種中篩選出富含總黃酮的品種，探究葉片生長過程中總黃酮類含量最高的時(shí)期，為其降糖活性提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，為天然食療產(chǎn)品（番石榴茶飲等）的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 個(gè)品種番石榴葉（珍珠、泰國1 號(hào)、荷西黃、汕紅、新世紀(jì)、蒙自紅、龍州1 號(hào)、紅寶石、西瓜、全紅）的成熟葉片，采集于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，顏色深綠，革質(zhì)，經(jīng)水果中心陳豪軍正高級(jí)農(nóng)藝師鑒定為桃金娘科番石榴屬植物番石榴Psidium guajava Linn.的葉片。

蘆?。ㄅ?hào)：Y2411Y17051）、番石榴苷（批號(hào)：P09J7F8764）、萹蓄苷（批號(hào)：P21S10S98394）、瑞諾苷（批號(hào)：P25J10S91433）、槲皮素（批號(hào)：C01J10Y91727）（≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；氯化膽堿[HOC2H4N（CH3）3Cl，ChCl）]、乙二醇[（CH2OH）2，EG]、丙三醇[（CH2OH）2CHOH，GLY]、乳酸[CH3CHOHCOOH，LA]、葡萄糖[CH2OH（CHOH）4CHO，GLU]、丁二醇[（CH2）4（OH）2，BDO]、硝酸鋁、亞硝酸鈉（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity II XL-30C）：安捷倫科技有限公司；萬能高速粉碎機(jī)（XL-30C）：濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；紫外可見光分光光度計(jì)（UV-1800PC）：濟(jì)南歐威騰生物科技有限公司；電子分析天平（CP214）：奧豪斯儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-5210A）：上海亞榮生化儀器廠；熱泵干燥機(jī)（L3.5TB1）：廣東威而信實(shí)業(yè)有限公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（GTSONIC-T20）：廣東固特超聲股份有限公司；Milli-Q 超純水儀：美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 低共熔溶劑（DES）水溶液的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[18]方法，氯化膽堿使用前放入真空干燥箱中于80 ℃干燥24 h，干燥后與不同的氫鍵供體以適當(dāng)?shù)谋壤旌虾蠓胖迷趫A底燒瓶中，90 ℃恒溫水浴鍋中加熱攪拌，直至形成均一穩(wěn)定的透明體系。將所得DES 冷卻至室溫后，密封置于干燥器中以P2O5干燥2 周以上，按照一定體積分?jǐn)?shù)將目標(biāo)DES 溶解于去離子水中，充分搖勻、靜置，得到一定含水量（0%、25%、40%、55%）的均一透明DES 水溶液。

1.3.2 番石榴葉有效部位提取

1.3.2.1 番石榴葉預(yù)處理

將不同品種番石榴葉洗凈、去除枝梗、泥沙等雜質(zhì)后經(jīng)50 ℃烘箱烘干，粉碎過40 目篩，備用。

1.3.2.2 樣品制備

將番石榴葉粉末以適宜的料液比、提取溫度、超聲功率輔助DES 提取3 次后，合并提取液，真空抽濾，去除殘?jiān)占癁V液，4 500 r/min 下離心15 min，取上清液，用于總黃酮含量測(cè)定；精確吸取0.1 mL 上清液，用甲醇定容至2.5 mL，經(jīng)微孔濾膜過濾，取濾液，用于黃酮類成分測(cè)定。

1.3.3 NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定總黃酮含量

番石榴葉總黃酮含量通過NaNO2-Al（NO3）3比色法[19]測(cè)定，以蘆丁為對(duì)照品，在505 nm 處測(cè)定其吸光度。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=3.918 4X+0.004 3（R2=0.998 3）。

1.3.4 HPLC 法測(cè)定黃酮類成分含量

1.3.4.1 色譜條件

參照文獻(xiàn)[20]方法測(cè)定，色譜條件為色譜柱：Agilent eclipse plus C18 柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～15 min，11%～13.5% A；15～30 min，13.5%～18% A；30～40 min，18%A；40～65 min，18%～49%A；65～70 min，49%～11%A）；檢測(cè)波長：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃。

1.3.4.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷、槲皮素濃度為1 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，依次精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液200、150、100、50、25、10 μL 于6 個(gè)10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。

1.3.4.3 精密度試驗(yàn)

按1.3.2.2 制備番石榴葉黃酮樣品液，按1.3.4.1 色譜條件測(cè)定番石榴苷的含量，連續(xù)測(cè)定6 次。

1.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.3.2.2 制備番石榴葉黃酮樣品液，按1.3.4.1 色譜條件分別于15、30、45、60、75、90 min 測(cè)定番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷和槲皮素的含量。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

取番石榴葉粗粉2 g，超聲功率600 W，提取時(shí)間50 min，水浴溫度30 ℃，提取3 次，DES 組合中氫鍵供體和氫鍵受體的摩爾比為1∶1，含水量為25%，料液比1∶30 （g/mL），測(cè)定不同DES 組合ChCl+EG、ChCl+GLY、ChCl+BDO、ChCl+LA、ChCl+GLU 的總黃酮提取率。以最佳DES 組合進(jìn)行提取，其它條件不變，測(cè)定DES 含水率分別為0%、10%、25%、40%、55%時(shí)的總黃酮提取率。以最佳DES 組合、最適含水率進(jìn)行提取，其它條件不變，測(cè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）時(shí)總黃酮提取率。

為了探究各單因素變化對(duì)番石榴葉總黃酮提取率的影響程度，通過公式計(jì)算每個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果的均方差，均方差越小，表明影響程度越小。均方差計(jì)算公式如下。

式中：R 為均方差；Yi為每組單因素試驗(yàn)中各水平的提取率，%；Y 為每組單因素試驗(yàn)中各水平提取率的平均值，%；n 為每組單因素試驗(yàn)水平數(shù)量。

1.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助DES 提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用L9（33）正交設(shè)計(jì)，確定超聲波輔助EDS 提取番石榴葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The design of orthogonal test

1.3.7 不同品種番石榴葉總黃酮含量測(cè)定

采用優(yōu)化后的超聲波輔助DES 提取法分別提取10 個(gè)品種番石榴老葉中的黃酮類物質(zhì)，測(cè)定其中總黃酮和黃酮類成分含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2016 進(jìn)行處理，采用GraphPad Prism 7.0 軟件作圖。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05 示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以不同英文字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類成分HPLC 線性關(guān)系考察

混合對(duì)照品的HPLC 圖譜如圖1 所示，線性關(guān)系如表2 所示。

圖1 混合對(duì)照品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC of reference substances

表2 4 種黃酮類成分線性關(guān)系考察Table 2 Linearity of four kinds of flavonoids

如圖1 所示，4 種黃酮類成分在該HPLC 方法中分離度良好，互相無干擾。由表2 可知，各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)

本研究建立的HPLC 法精密度為1.21%，精密度符合測(cè)定黃酮類成分含量的要求。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表3，在90 min 內(nèi)樣品中黃酮類成分基本不變，穩(wěn)定性良好，符合試驗(yàn)要求。

表3 樣品黃酮類成分穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Stability test of flavonoid constitutes in sample

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 DES 組成對(duì)番石榴葉總黃酮提取率的影響

低共熔溶劑具有極性可調(diào)諧性、黏度可調(diào)諧性、增溶性等特性，直接影響目標(biāo)化合物的提取效率。不同DES 組成對(duì)番石榴葉總黃酮提取率的影響如圖2 所示。

圖2 不同DES 組成條件下總黃酮提取率Fig.2 Extraction rate of total flavonoids under different DES solvent

如圖2 所示，在含水率為25%的條件下，不同組成的DES 對(duì)總黃酮的提取率為5.58%～15.16%，總黃酮提取率最高的DES 為ChCl+EG，其余依次為ChCl+BDO、ChCl+GLY、ChCl+GLU、ChCl+LA。由于DES 主要通過與目標(biāo)物形成分子間氫鍵和靜電作用而增加其溶解度[15]，5 種DES 的氫鍵供體中，乙二醇、丙三醇、丁二醇、葡萄糖均含有大量的羥基，乳酸含有大量的羧基，均能與黃酮類化合物形成分子間氫鍵[21-23]。黃酮化合物具有多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，形成了π-π 大共軛體系，具有很高的電子云密度，而DES 中乳酸的羧基C O 鍵的電負(fù)性強(qiáng)，也具有較高的電子云密度，二者接近時(shí)，會(huì)因電子云相互排斥而導(dǎo)致氫鍵不穩(wěn)定，因此含羧基的DES（ChCl+LA）對(duì)總黃酮的提取效果最差。

2.3.2 DES 含水率對(duì)番石榴葉總黃酮提取率的影響

少量水的加入能降低DES 的黏度且增加其極性，但過量的水反而會(huì)破壞DES 因氫鍵構(gòu)建的超分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)降低DES 與目標(biāo)組分間的相互作用[23]。本研究對(duì)含水量的考察結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同DES 含水率條件下總黃酮提取率Fig.3 Extraction rate of total flavonoids under different moisture content of DES

由圖3 可知，DES（ChCl+EG）的含水率由0%上升到55%的過程中，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，并在含水率為25%時(shí)達(dá)到最大值，提取率為15.17%。

2.3.3 料液比對(duì)番石榴葉總黃酮提取率的影響

不同料液比條件下總黃酮提取率如圖4 所示。

圖4 不同料液比條件下總黃酮提取率Fig.4 Extraction rate of total flavonoids under different solidliquid ratio conditions

如圖4 所示，料液比為1∶10～1∶30（g/mL）時(shí)，總黃酮提取率隨DES 溶劑量的增加而穩(wěn)定上升，為5.60%～11.61%；料液比從1∶30（g/mL）變化到1∶50（g/mL）時(shí)，提取率變化趨于平緩，提取率僅相差0.54%。從成本、環(huán)保等方面考量，初步確定1∶30（g/mL）為最佳提取料液比。

2.4 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。

表4 超聲波輔助DES 提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Ultrasonic assisted extraction with DES orthogonal test results

由表4 可知，3 個(gè)因素對(duì)總黃酮得率影響程度為DES 含水率＞DES 組成＞料液比，超聲輔助DES 提取最優(yōu)工藝為A1B2C3，即DES 組成為ChCl+EG，含水率為25%，料液比為1∶30（g/mL）。而此條件與最高提取率13.96%所對(duì)應(yīng)的提取條件A1B2C2不一致，即DES 組成為ChCl+EG，含水率為25%，料液比為1∶25，因此需對(duì)這兩種條件進(jìn)行驗(yàn)證。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表5 所示。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Verification test results

如表5 所示，在A1B2C3和A1B2C2兩種提取條件下，番石榴葉總黃酮提取率較高的提取條件為A1B2C3，即DES 組成為ChCl+EG，含水率為25%，料液比為1∶30（g/mL），此條件下總黃酮平均提取率為14.95%，高于以往研究中利用回流或超聲輔助提取法的提取率（0.497%～5%）[10，24-25]，與蔣利榮等[26]利用超聲輔助DES 提取法達(dá)到的提取率（15.97%～22.06%）相當(dāng)。這是由于形成DES 時(shí)兩種組分之間的協(xié)同效應(yīng)促使DES 對(duì)物質(zhì)的溶解能力增強(qiáng)，無論是極性或非極性的化合物，DES 均具有增溶作用。槲皮素、蘆丁、DNA、淀粉等在DES 中的溶解度是在水中的18～460 000 倍，而在水中溶解性較差的苯甲酸、灰黃霉素等藥物在DES中的溶解度是在水中的5～22 000 倍[27]。此外，超聲波所具有的空化效應(yīng)能促使溶劑更大程度地滲入細(xì)胞中，不斷刺激胞內(nèi)腺體，增加傳質(zhì)速率[28]；同時(shí)利用它的機(jī)械效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)等使細(xì)胞壁破裂而加速植物中有效成分的擴(kuò)散和釋放，能有效避免熱敏性物質(zhì)在高溫環(huán)境下被破壞[29]。

2.5 不同品種番石榴葉總黃酮含量及其聚類分析

黃酮是植物體重要的次生代謝產(chǎn)物，其合成、分布受基因等遺傳因素和外界環(huán)境因素的共同調(diào)控。不同品種番石榴葉總黃酮含量如圖5 所示，總黃酮含量聚類分析如圖6 所示。

圖5 不同品種番石榴葉總黃酮含量Fig.5 Contents of total flavonoids in Guava leaves of different cultivars

圖6 不同品種番石榴葉總黃酮含量聚類分析Fig.6 Cluster analysis of total flavonoids content in Guava leaves of different cultivars

如圖5 所示，不同品種番石榴材料老葉中總黃酮含量差異明顯。‘全紅’總黃酮含量顯著高于其它品種，達(dá)到226.62 mg/g；‘紅寶石’總黃酮含量最低，為45.12 mg/g；其余8 個(gè)品種總黃酮含量為67.48～183.56 mg/g。在歐氏距離為10 時(shí)進(jìn)行組間平均聚類分析（圖6），不同番石榴葉材料總黃酮含量可分為3 組，代表3 個(gè)不同的含量水平，結(jié)合圖5 中不同品種番石榴葉總黃酮含量測(cè)定結(jié)果，將含量水平分成低、中、高，其中低含量的品種包括‘蒙自紅’、‘汕紅’、‘新世紀(jì)’和‘紅寶石’，中含量材料包括‘珍珠’、‘龍州1 號(hào)’、‘西瓜’、‘荷西黃’和‘泰國1 號(hào)’；高含量品種為‘全紅’。

2.6 番石榴嫩芽、嫩葉、老葉中總黃酮含量分布情況

選取總黃酮高、中、低含量水平的番石榴品種‘全紅’、‘珍珠’以及‘新世紀(jì)’，其嫩芽、嫩葉和老葉中總黃酮含量差異如圖7 所示。

圖7 番石榴嫩芽、嫩葉、老葉總黃酮含量Fig.7 Content of total flavonoids in tender buds，tender leaves and old leaves of Guava

‘全紅’各部位總黃酮含量為95.96～212.61 mg/g，‘珍珠’為66.69～174.98 mg/g，‘新世紀(jì)’為25.70～76.58 mg/g；3 個(gè)品種番石榴葉總黃酮含量的分布情況為嫩芽＜嫩葉＜老葉，且從嫩芽到嫩葉期，總黃酮含量增長迅猛，從嫩葉到老葉，增長趨于平緩。這是因?yàn)辄S酮類化合物作為植物體內(nèi)一大次生代謝產(chǎn)物，能抵御一定惡劣的生態(tài)環(huán)境以及動(dòng)物和微生物等帶來的傷害[30]，番石榴植株在嫩芽時(shí)期最為嬌嫩脆弱，為避免惡劣環(huán)境如強(qiáng)光照、病蟲害等對(duì)植株生長過程的不利影響，會(huì)增加其次生代謝物的合成量[31]，因此在嫩芽到嫩葉的生長階段，黃酮類物質(zhì)大量分泌釋放，隨著番石榴葉的生長過程而不斷累積，在老葉期含量達(dá)到峰值。

2.7 不同品種番石榴葉黃酮類成分含量

目前針對(duì)番石榴品種差異，相關(guān)研究者進(jìn)行了番石榴種質(zhì)資源親緣關(guān)系研究[32]、不同品種番石榴果實(shí)的酚類物質(zhì)、糖酸組分及其抗氧化活性分析[33-34]以及果實(shí)耐藏性和采后品質(zhì)變化比較[35]，但未對(duì)番石榴葉片中有效成分品種差異進(jìn)行分析。不同品種番石榴葉樣品HPLC 圖譜見圖8。

圖8 不同品種番石榴葉樣品HPLC 圖譜Fig.8 HPLC of Guava leaves of different cultivars

不同品種番石榴葉中黃酮類成分含量如表6 所示。

表6 不同品種番石榴葉中黃酮類成分含量（n=3）Table 6 Flavonoids content in Guava leaves of different cultivars（n=3） mg/L

如圖8 所示，不同品種番石榴葉中4 種黃酮類成分含量差異明顯。由表6 所知，所研究的10 個(gè)番石榴品種中，主要的黃酮類成分為番石榴苷和萹蓄苷，含量高于瑞諾苷和槲皮素；4 種黃酮類成分總含量最低的品種為‘西瓜’（6.70 mg/L）；黃酮類成分總含量最高的品種為‘全紅’（21.03 mg/L），其中番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷的含量分別為7.25、7.94、3.96 mg/L，均顯著高于其余9 個(gè)品種（p＜0.05）。槲皮素含量最高的品種為‘紅寶石’（2.32 mg/L）。

3 結(jié)論

黃酮類化合物是番石榴葉的主要有效成分，其含量差異將直接影響產(chǎn)品的應(yīng)用功效。本研究采用超聲輔助DES 法提取番石榴葉總黃酮，并對(duì)不同品種總黃酮含量進(jìn)行對(duì)比研究。通過單因素試驗(yàn)表明3 個(gè)考察因素對(duì)總黃酮得率影響程度為DES 含水率＞DES 組成＞料液比。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝：以ChCl+EG 組成的DES 為提取溶劑，DES 含水率為25%，料液比為1∶30（g/mL），此條件下總黃酮平均提取率為14.95%?？傸S酮含量最高的番石榴品種為‘全紅’，在老葉期達(dá)到頂峰；且‘全紅’中4種主要的黃酮類成分番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷和槲皮素總含量最高。綜合總黃酮和4 種主要的黃酮類單體成分含量結(jié)果，表明‘全紅’老葉是最適于番石榴葉保健產(chǎn)品開發(fā)的原料，為其加工選材提供科學(xué)依據(jù)。