自噬在干眼病中的作用及調(diào)節(jié)自噬藥物的研究進(jìn)展

張迪,梁琦,胡凱

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 眼科,江蘇 南京 210008)

干眼病是一種以淚膜穩(wěn)態(tài)喪失為特征,伴有眼部不適癥狀的多因素眼表疾病,其中淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲、眼表炎癥損傷和神經(jīng)感覺異常是主要的病理因素[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),干眼病全球患病率為5%～50%,我國為21%～30%[2-3],且有患病率逐年增長(zhǎng)和患病人群低齡化的趨勢(shì)。干眼病的臨床癥狀如眼表干燥、異物感、燒灼感、瘙癢感等嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量,甚至導(dǎo)致抑郁癥等心理問題[4]。干眼病核心的發(fā)病機(jī)制是淚液高滲促進(jìn)眼表細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)等炎癥因子,并招募免疫細(xì)胞如輔助性T細(xì)胞1和17至眼表,過度的炎癥和氧化應(yīng)激造成眼表細(xì)胞凋亡以及腺體和角膜神經(jīng)損傷,加重淚膜不穩(wěn)定和淚液高滲,從而形成惡性循環(huán)。眼表穩(wěn)態(tài)失衡以及炎癥、氧化應(yīng)激等損傷是干眼病疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素[5]。

自噬是細(xì)胞收到應(yīng)激信號(hào)時(shí)重要的防御過程,在維持眼部細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[6]。自噬主要包括3種形式:巨自噬、伴侶介導(dǎo)的自噬和微自噬。其中,巨自噬(以下簡(jiǎn)稱“自噬”)是自噬的主要形式,是指胞質(zhì)內(nèi)容物被脂質(zhì)雙層膜包裹形成自噬小體,隨即與溶酶體結(jié)合,被其中蛋白酶降解的過程[7]。線粒體自噬是一種特殊的自噬形式,其過程是靶向功能障礙的線粒體進(jìn)行清除,從而抵御氧化應(yīng)激損傷,近年成為眼科疾病機(jī)制研究的新方向[8]。除此之外,自噬也是一種細(xì)胞死亡方式,在受到刺激時(shí)自噬過程加重細(xì)胞損傷[9]。Lin等[10]用印跡細(xì)胞學(xué)的新型冷凍切片技術(shù)觀察自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(MAP1LC3,LC3),發(fā)現(xiàn)臨床缺水性干眼患者細(xì)胞中的自噬應(yīng)激程度高于正常人,且淚液中自噬相關(guān)蛋白5(autophagy related protein 5, ATG5)也被證明可作為干燥綜合征型干眼有潛力的診斷標(biāo)志物[11],表明自噬可能參與了干眼病的發(fā)病機(jī)制。此外,靶向調(diào)節(jié)自噬治療干眼病的相關(guān)藥物研究也越來越多,我們對(duì)相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié),以期通過探究自噬機(jī)制為干眼病的臨床治療提供新角度。

1 自噬在干眼病發(fā)病機(jī)制中的作用

自噬對(duì)干眼病的作用具有雙面性,一方面,激活自噬可以幫助恢復(fù)眼表代謝穩(wěn)態(tài)并減輕炎癥及氧化應(yīng)激損傷;另一方面,自噬也可介導(dǎo)細(xì)胞死亡,加重眼表細(xì)胞的損傷,從而促進(jìn)疾病的進(jìn)展。

1.1 自噬在眼表的保護(hù)作用

1.1.1 自噬在眼表代謝穩(wěn)態(tài)中的保護(hù)作用 淚膜是眼表的重要屏障,由脂質(zhì)、水樣液和黏蛋白構(gòu)成,起著潤(rùn)滑、抗菌、屈光等多種作用[12]。在眼表的黏蛋白中,催淚蛋白(Lacritin)是一種由淚腺和瞼板腺分泌的保護(hù)性蛋白,在眼表起著穩(wěn)定淚膜、促進(jìn)淚液分泌、維持上皮穩(wěn)態(tài)的重要作用[13-14],在干眼病患者的淚液中Lacritin含量下降[15]。在Wang等[16]的研究中,在體外使用炎癥因子刺激角膜上皮細(xì)胞以模擬干眼眼表的炎癥環(huán)境,發(fā)現(xiàn)Lacritin可通過快速觸發(fā)叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型3蛋白蛋白乙?；捌渑c自噬相關(guān)蛋白101偶聯(lián)來誘導(dǎo)角膜上皮的自噬,從而維持眼表上皮的穩(wěn)態(tài)。

最近有研究提出了干眼疾病進(jìn)展中“副炎癥”的概念,這是一種介于基礎(chǔ)和慢性炎癥之間的狀態(tài)。在干眼病的初期,副炎癥響應(yīng)外部和內(nèi)部刺激因素的應(yīng)激信號(hào),幫助恢復(fù)和維持眼表穩(wěn)態(tài);當(dāng)刺激長(zhǎng)久存在,副炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y,激活適應(yīng)性免疫反應(yīng),干眼病發(fā)展為慢性的損害性疾病。由此,學(xué)者提出自噬作為一種細(xì)胞內(nèi)的清潔機(jī)制,可在干眼病副反應(yīng)時(shí)期消除炎性小體或功能障礙的線粒體,阻斷疾病進(jìn)展,是極具價(jià)值的疾病治療靶點(diǎn)[17]。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3, IGFBP-3)是一種由角膜上皮細(xì)胞分泌的蛋白。Stuard等[18]發(fā)現(xiàn),干眼病中淚液高滲的刺激會(huì)破壞眼表的代謝穩(wěn)態(tài),具體表現(xiàn)為角膜上皮糖酵解活動(dòng)抑制、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)加劇。而IGFBP-3在高滲應(yīng)激條件下,起著調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)、恢復(fù)平衡的關(guān)鍵作用。隨后,他們團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究[19]表明,IGFBP-3在角膜上皮中的保護(hù)作用與BNIP3L/NIX和MFN2介導(dǎo)的線粒體自噬有著密切聯(lián)系,并且這一結(jié)論在結(jié)膜上皮細(xì)胞中也得到了驗(yàn)證。

1.1.2 自噬在眼表炎癥中的保護(hù)作用 眼表免疫炎癥被認(rèn)為是干眼發(fā)病過程中的核心[20],自噬在調(diào)節(jié)免疫炎癥過程中的作用已被廣泛研究,TNF-α、γ干擾素等炎癥因子也可以反向調(diào)節(jié)自噬水平[21]。

眼表炎癥引起角膜細(xì)胞的損傷,尤其是角膜上皮細(xì)胞。有學(xué)者在體外使用高滲培養(yǎng)基處理角膜上皮細(xì)胞后觀察到炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-1β等)以及自噬標(biāo)志物Atg5、LC3、Unc-51樣激酶1(ULK1)和Beclin1表達(dá)量的增加,且自噬激活劑雷帕霉素的應(yīng)用可以抑制炎癥并促進(jìn)細(xì)胞存活,對(duì)干眼病有保護(hù)作用[22]。Ma等[23]在干眼小鼠角膜中觀察到自噬水平的輕微上升,并在使用自噬激活劑(LYN-1604)和抑制劑(3-甲基腺嘌呤)之后觀察小鼠角膜的炎癥因子水平以及臨床指標(biāo)(淚液分泌水平和角膜熒光素鈉染色評(píng)分),結(jié)果表明激活自噬可以降低小鼠眼表炎癥水平并改善干眼病的臨床癥狀,抑制自噬則效果相反。

眼表炎癥也可導(dǎo)致淚腺細(xì)胞的損傷,而白細(xì)胞介素1(interleukin-1, IL-1)家族成員在其中的作用最為顯著,Zoukhri等[24]發(fā)現(xiàn)向小鼠眶外淚腺注射IL-1α,早期會(huì)導(dǎo)致淚腺腺泡和導(dǎo)管上皮細(xì)胞的丟失,加重淚液分泌減少的癥狀,但在注射7 d之后,炎癥反應(yīng)消退,淚液分泌恢復(fù)到正常水平,表明淚腺有針對(duì)炎癥的自我修復(fù)反應(yīng)。隨后該團(tuán)隊(duì)對(duì)淚腺修復(fù)的機(jī)制進(jìn)行了深入探究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射早期小鼠淚腺腺泡細(xì)胞中自噬泡數(shù)量增加,LC3和溶酶體相關(guān)膜蛋白1的含量升高,表明炎癥發(fā)生后自噬參與了淚腺的修復(fù)過程[25]。在此基礎(chǔ)上,有團(tuán)隊(duì)對(duì)淚腺修復(fù)中自噬激活的具體機(jī)制進(jìn)行了研究,結(jié)果表明缺氧誘導(dǎo)因子1α信號(hào)的增強(qiáng)可上調(diào)自噬水平以防止腺泡細(xì)胞損傷并維持正常的淚腺功能[26]。

1.1.3 自噬在眼表氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用 氧化應(yīng)激是干眼病病理過程中的重要環(huán)節(jié)。淚液高滲會(huì)增加眼表活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生,破壞氧化還原平衡,最終誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[27]。氧化應(yīng)激一方面可引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和DNA損傷[28],另一方面激活核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)炎癥信號(hào)通路,加重眼表炎癥,促進(jìn)干眼病的疾病進(jìn)展[29]。

有研究團(tuán)隊(duì)在體外用過氧化氫對(duì)人角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)可加重氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡,并抑制了細(xì)胞的自噬活性[30]。隨后他們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以上調(diào)自噬水平以抵抗氧化損傷,在體外初步驗(yàn)證了干眼病中氧化應(yīng)激與自噬過程的聯(lián)系。香煙煙霧等環(huán)境污染已被證明可引發(fā)眼表氧化應(yīng)激,導(dǎo)致淚液不穩(wěn)定和眼表上皮損傷,成為干眼病的危險(xiǎn)因素。Miao等[31]用香煙煙霧暴露作為人角膜上皮細(xì)胞和小鼠的病理?xiàng)l件,結(jié)果顯示,煙霧通過損傷自噬正常清除受損蛋白質(zhì)的過程,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇,而半胱胺可以通過增加自噬活性來減輕相關(guān)損傷并改善小鼠角膜上皮細(xì)胞的狀態(tài)。在此基礎(chǔ)上,Wang等[32]探究了眼表氧化應(yīng)激損傷自噬的機(jī)制,結(jié)果表明眼表DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物4(DNA damage inducible transcript 4,DDIT4)的表達(dá)升高會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞的自噬受損和細(xì)胞活力降低,敲低DDIT4的表達(dá)可恢復(fù)正常自噬過程并減輕相關(guān)損傷。這些研究共同驗(yàn)證了眼表自噬受損是氧化應(yīng)激造成病理損傷的重要環(huán)節(jié),增強(qiáng)自噬活性對(duì)于改善干眼病的癥狀十分重要。

1.2 自噬在眼表損傷中的作用

1.2.1 自噬在淚腺和瞼板腺損傷中的作用 在干眼病的疾病進(jìn)展中,自噬作為一種細(xì)胞死亡方式,可造成淚腺損傷。有研究表明,機(jī)體血液中血清素含量持續(xù)下降會(huì)導(dǎo)致淚腺自噬性細(xì)胞死亡和腺泡萎縮,阻礙淚液的分泌[33]。

眼表炎癥誘導(dǎo)的瞼板腺功能障礙可造成淚液脂質(zhì)缺少,破壞淚膜穩(wěn)定性,增加淚液蒸發(fā),是干眼病最常見的原因[34]。臨床證據(jù)顯示使用碳酸酐酶抑制劑類的青光眼藥物可誘發(fā)瞼板腺功能障礙[35],成為干眼病的危險(xiǎn)因素。Han等[36]用碳酸酐酶抑制劑多佐胺處理人瞼板腺上皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)多佐胺可通過提升細(xì)胞中溶酶體數(shù)量和自噬體輕鏈標(biāo)志物表達(dá)來影響細(xì)胞分化,進(jìn)一步導(dǎo)致瞼板腺的功能受損,促進(jìn)干眼病的進(jìn)展。

1.2.2 自噬在角膜神經(jīng)損傷中的作用 角膜神經(jīng)數(shù)量減少和敏感性增加會(huì)影響疼痛信號(hào)的傳遞和處理,這是干眼病患者眼部慢性疼痛癥狀的主要原因[37]。CD25是白細(xì)胞介素2受體的重要組成部分,與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)[38]。有研究表明,缺乏CD25的小鼠更容易患干眼病,表現(xiàn)為眼表細(xì)胞凋亡和炎癥浸潤(rùn)[39]。Stepp等[40]在此基礎(chǔ)上探究了CD25缺失導(dǎo)致干眼病的機(jī)制,研究結(jié)果顯示,在CD25敲除的干眼病小鼠中觀察到自噬蛋白(LC3、Beclin1等)表達(dá)增加,表明CD25缺失通過上調(diào)感覺神經(jīng)自噬性死亡的水平導(dǎo)致其形態(tài)改變和功能降低,加速了干眼病的疾病進(jìn)程。

2 靶向調(diào)節(jié)自噬治療干眼病的藥物

2.1 靶向激活自噬的藥物

2.1.1 雷帕霉素 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可以通過阻止自噬起始分子ULK1的激活,從而抑制自噬啟動(dòng),是自噬負(fù)調(diào)控的主要靶點(diǎn)。雷帕霉素是靶向抑制mTOR的自噬激活劑[41]。有研究[42]表明,靜脈注射納米顆粒包裹的雷帕霉素結(jié)合蛋白聚合物可顯著改善小鼠淚腺中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的情況,在此過程中自噬調(diào)控基因ULK1和ULK2的表達(dá)顯著升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是干眼病發(fā)病機(jī)制研究的新方向,衣霉素可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成淚腺毛細(xì)血管脫落和腺泡萎縮,最終引發(fā)干眼病。因此,有團(tuán)隊(duì)以此為疾病模型研究[43]顯示,腹腔注射雷帕霉素可增加LC3B的含量,從而保護(hù)淚腺血管和腺泡細(xì)胞來改善干眼病。但雷帕霉素的注射給藥有生物利用度低、副作用大、流程繁瑣等缺點(diǎn)。所以,有團(tuán)隊(duì)嘗試使用聚乙二醇等材料包裹雷帕霉素制成滴眼液進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)雷帕霉素滴眼治療可通過上調(diào)ULK1的表達(dá)而發(fā)揮緩解淚腺炎癥、增加淚液分泌并改善眼表狀態(tài)的作用[44]。衰老也是干眼病重要的危險(xiǎn)因素,眼表組織的老化可導(dǎo)致淚腺萎縮和纖維化以及瞼板腺功能障礙等病理變化。Trujillo-Vargas等[45]對(duì)衰老小鼠進(jìn)行雷帕霉素滴眼治療,結(jié)果也顯示了雷帕霉素對(duì)衰老所致的眼表炎癥和杯狀細(xì)胞丟失等癥狀的改善效果。這些結(jié)果表明了雷帕霉素調(diào)節(jié)自噬活性在干眼病中的治療潛力,有望成為干眼病治療的新選擇。

2.1.2 海藻糖 海藻糖是一種天然的雙糖,早在2002年,海藻糖已經(jīng)成為治療中重度干眼病有效且安全的藥物[46]。一項(xiàng)臨床研究招募了9名干眼病患者,用海藻糖和羧甲基纖維素進(jìn)行對(duì)比治療,發(fā)現(xiàn)海藻糖能更好緩解干眼病的癥狀,對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入探究發(fā)現(xiàn),海藻糖通過自噬激活和對(duì)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)炎癥通路的抑制來緩解眼表的炎癥[47]。而另一項(xiàng)臨床研究顯示,與單獨(dú)使用透明質(zhì)酸鈉(一種常用人工淚液的成分)治療干眼病相比,在其中加入海藻糖可使治療效果更顯著[48]。這些臨床試驗(yàn)顯示了海藻糖治療干眼病的臨床價(jià)值。關(guān)于海藻糖調(diào)控自噬的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),與雷帕霉素不同的是,海藻糖激活自噬不依賴于mTOR通路,而是作用于轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB, TFEB),它的功能為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的自噬-溶酶體途徑,海藻糖通過促進(jìn)TFEB入核以提高自噬通量來緩解干眼病的炎癥反應(yīng)[49-50]。如今,海藻糖已成為市售滴眼液的主要成分,也有研究證明了這類滴眼液可通過激活自噬的方式來發(fā)揮對(duì)干眼病的治療效果[51]。

2.1.3 褪黑素 褪黑素是一種由松果體分泌的主要成分為吲哚胺的激素,具有抗氧化和抗炎的顯著特性[52],大量研究證明了褪黑素對(duì)自噬尤其是線粒體自噬的調(diào)控,對(duì)神經(jīng)退行性疾病、缺血再灌注損傷以及癌癥等疾病起有益作用[53]。Wang等[54]先在體外用叔丁基過氧化氫處理人角膜上皮細(xì)胞的模型中進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明褪黑素通過激活血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)通路來挽救角膜上皮細(xì)胞受損的自噬通量以顯著改善線粒體功能,減少ROS的累積并抑制細(xì)胞凋亡,隨后在干眼小鼠模型中發(fā)現(xiàn)腹腔注射褪黑素明顯改善了臨床癥狀。Xu等[55]用共聚膠束的材料負(fù)載褪黑素以提高藥物在水溶液中的溶解度和生物活性,結(jié)果表明,褪黑素共聚膠束可通過激活PINK分子介導(dǎo)的線粒體自噬來改善干眼病相關(guān)的眼表損傷。

2.1.4 骨化三醇 骨化三醇是維生素D3的活性代謝物,具有抗炎和抗凋亡的作用,已被證明具有治療干眼病的潛力[56]。Lyu等[57]研究表明,用骨化三醇治療可以通過激活維生素D受體(VDR)信號(hào)通路以增加自噬通量,從而減輕干眼病中細(xì)胞凋亡引起的病理損傷。

2.2 靶向抑制自噬的藥物

隨著研究深入,更多的藥物被證明通過靶向調(diào)節(jié)自噬來緩解干眼病,但調(diào)節(jié)自噬的機(jī)制不同。α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)是一種具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎功能的神經(jīng)肽,Chu等[58]研究表明,在干眼病的應(yīng)激刺激下,自噬過度激活可以促進(jìn)炎癥增強(qiáng)和細(xì)胞凋亡,而α-MSH的治療通過作用于酪氨酸激酶JAK-STAT信號(hào)通路中的上皮生長(zhǎng)因子受體而降低自噬水平,從而改善病變并保證眼表正常的功能。有研究[59]表明,長(zhǎng)期服用抑郁癥的主要藥物選擇性5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine, 5-HT)會(huì)加重干眼病中的眼表炎癥和上皮細(xì)胞凋亡。因此,有學(xué)者猜測(cè)5-HT1A受體抑制劑(WAY-100635)可以改善干眼病的癥狀,結(jié)果表明WAY-100635通過抑制ROS的累積來抑制自噬水平從而在干眼病中發(fā)揮保護(hù)作用[60]。

3 結(jié) 語

干眼病的公認(rèn)機(jī)制是淚膜不穩(wěn)定和眼表免疫失衡,隨著研究的深入,我們對(duì)疾病的病理變化不斷有著新的認(rèn)知。自噬作為細(xì)胞內(nèi)重要的代謝過程,在干眼病的疾病進(jìn)展中起著雙重的作用。一方面,自噬幫助清除多余或有害的細(xì)胞成分,起到維持穩(wěn)態(tài)和減輕損傷的作用;另一方面,過度的自我降解可促進(jìn)細(xì)胞損傷,推進(jìn)干眼病的進(jìn)程。然而總體來看,自噬在干眼病中的保護(hù)作用更加顯著,關(guān)于激活自噬延緩疾病進(jìn)展的分子機(jī)制和靶向激活自噬的藥物可能是該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),相關(guān)研究可幫助我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和治療干眼病。