角蛋白降解的研究進(jìn)展

汪偉航，羅鑫格，林 濤，鄭燕虹，陳張燕，劉湘晴，潘梓鈞，石 艷，張懷東,2，李 芹,2

（1.福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350117; 2.工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方 聯(lián)合工程研究中心，福州 350117）

角蛋白是自然界中豐度最高的纖維狀蛋白[1]，也是已知最堅(jiān)硬的生物材料之一，是羽毛、龜殼和禽爪等常見的表皮附屬物的主要構(gòu)成成分[2]。生產(chǎn)生活中每年都會(huì)產(chǎn)生百萬噸以上富含角蛋白的生物副產(chǎn)品[3]。這些副產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量很高，其中禽類羽毛中角蛋白質(zhì)含量約占90 %[4]，具有回收再利用的價(jià)值。若處理不當(dāng)，則會(huì)污染大陸與海洋[5]。例如，海鴨(Anas platyrhynchos）養(yǎng)殖中產(chǎn)生的大量鴨毛若不進(jìn)行妥善處理，不僅造成蛋白資源的浪費(fèi)，還會(huì)污染環(huán)境，甚至傳播疾病[6]。角蛋白富含半胱氨酸和甘氨酸。兩分子半胱氨酸易形成分子間二硫鍵轉(zhuǎn)化為胱氨酸。甘氨酸具有疏水性、硬度較高且不易降解的特點(diǎn)。這使得角蛋白難以被自然降解，且在水中的溶解度比大多數(shù)蛋白質(zhì)都低[7]。角蛋白也難以被動(dòng)物來源的胃蛋白酶、胰蛋白酶直接降解，需進(jìn)一步加工后才能利用，這也導(dǎo)致羽毛經(jīng)常被填埋或焚燒處理[8]。而角蛋白資源難以被有效開發(fā)利用，在增加環(huán)境壓力的同時(shí)，也造成巨大的蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)。利用酶法處理廢棄的角蛋白資源綠色環(huán)保，且降解產(chǎn)物適宜應(yīng)用于有高附加值的科技領(lǐng)域。目前已篩選出多種角蛋白酶，例如Huang等[9]發(fā)現(xiàn)一種S8家族角蛋白酶。Kang等[10]發(fā)現(xiàn)S16、M16和M38等多個(gè)家族的角蛋白酶。已報(bào)道的多數(shù)角蛋白酶對于溫度和離子濃度的耐受性較差。為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，需要篩選出耐高溫、耐高鹽的角蛋白酶。筆者從角蛋白的結(jié)構(gòu)特征、降解機(jī)理以及降解產(chǎn)物的利用等方面綜述了角蛋白降解的進(jìn)展，并著重介紹了酶法降解角蛋白這一最具潛力的降解方式。

1 角蛋白的結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)可將角蛋白分為α-角蛋白和β-角蛋白。α-角蛋白主要存在于哺乳動(dòng)物中，而β-角蛋白則主要存在于鳥類和爬行動(dòng)物中[11]。

α-角蛋白的分子單體由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括頭部結(jié)構(gòu)域、中央棒狀結(jié)構(gòu)域和末端結(jié)構(gòu)域。頭部結(jié)構(gòu)域由3部分組成，即末端子域E1、中間可變域V1和同源子域H1。棒狀結(jié)構(gòu)域由4個(gè)右旋的α螺旋和3個(gè)β轉(zhuǎn)角構(gòu)成，4個(gè)α螺旋分別命名為1A、1B、2A和2B，3個(gè)β轉(zhuǎn)角分別命名為L1、L12和L2（圖1）[12]。α螺旋和β轉(zhuǎn)角依次交替排列，共同組成由7個(gè)部分構(gòu)成的棒狀結(jié)構(gòu)域。尾端結(jié)構(gòu)域與頭部結(jié)構(gòu)域類似，由E2、V2和H2構(gòu)成[13]（圖1）。角蛋白分子單體可以分為Ⅰ型與Ⅱ型，Ⅰ型角蛋白分子不包含H1和H2，所以其分子量較Ⅱ型小6～9 kDa[14]。一分子Ⅰ型角蛋白可以和一分子Ⅱ型角蛋白形成左旋螺旋，聚合為異二聚體（圖1）。兩分子異二聚體可以聚合形成四聚體，兩分子四聚體可以結(jié)合形成原纖維，而四分子原纖維聚合會(huì)形成α-角蛋白中間絲，若干個(gè)α-角蛋白中間絲會(huì)與富含硫化物的角蛋白相關(guān)蛋白通過二硫鍵互相結(jié)合并交叉連接形成粗纖維[15]。角蛋白相關(guān)蛋白對α-角蛋白中間絲的組裝具有重要影響，直接決定了角蛋白組織的屬性，如強(qiáng)度、惰性和剛性[16]。由于角蛋白分子內(nèi)含有大量二硫鍵、氫鍵和離子鍵，極大地增加了角蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使其難以被降解。

圖1 α-角蛋白單體與二聚體分子結(jié)構(gòu)示意圖

β-角蛋白以羽毛和爬行動(dòng)物的鱗片為代表，二者具有很高的同源性。以羽毛為例，羽毛由羽根、羽軸和羽枝3部分組成，在這3部分中都包含32個(gè)蛋白殘基片段，構(gòu)成了β-角蛋白的纖維骨架。每個(gè)β-角蛋白分子單體由4條β鏈構(gòu)成[17]。4條鏈由疏水作用力平行或反平行結(jié)合在一起，非極性氨基酸（如纈氨酸和異亮氨酸）常位于片狀褶皺內(nèi)表面，而帶電殘基和半胱氨酸殘基位于側(cè)面或者轉(zhuǎn)彎處。2分子β-角蛋白單體可以通過疏水相互作用形成二聚體，在2個(gè)分子間特定氨基酸之間存在鹽橋、氫鍵和二硫鍵，共同維持二聚體的穩(wěn)定性。4個(gè)二聚體可以通過氫鍵和二硫鍵組裝形成螺旋狀重復(fù)單元，堆積的二聚體漸進(jìn)旋轉(zhuǎn)上升，每次旋轉(zhuǎn)約為45°，構(gòu)成β-角蛋白絲（圖2）[18]。

圖2 β-角蛋白單體與二聚體分子結(jié)構(gòu)示意圖

2 角蛋白的降解

2.1 物理法降解角蛋白物理法降解角蛋白包括高溫高壓水解法和膨化法。高溫高壓水解法是指在高溫（100～200 ℃）和高壓（0.294～0.980 MPa）的條件下徹底破壞角蛋白穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，降解產(chǎn)生可溶性多肽混合物。膨化法是指在高溫（230 ℃）、高壓（1.0～1.5 MPa）和高剪切力的條件下，快速（2.5 min）減壓膨化，使角蛋白纖維降解為小的蛋白亞單位和肽鏈群[19]。但是，物理法降解過程中，高溫可能會(huì)破壞熱敏性氨基酸，降低某些氨基酸的消化率和利用率；且由于設(shè)備參數(shù)不易控制，水解效果并不理想，也難以保持產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。同時(shí)，生產(chǎn)過程中所需耐高溫高壓的設(shè)備較多，生產(chǎn)成本和維護(hù)成本都相對較高[20]。

2.2 化學(xué)法降解角蛋白化學(xué)法降解角蛋白包括酸堿水解法、氧化還原降解法和電化學(xué)還原法。酸堿水解法是指利用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿破壞角蛋白分子空間結(jié)構(gòu)，這就需要精確控制反應(yīng)的pH值、溫度和反應(yīng)時(shí)間，其中反應(yīng)時(shí)間對產(chǎn)物分子量的大小和產(chǎn)率具有重要影響[21]。氧化還原降解法是利用氧化劑（如過氧化氫、過甲酸、過乙酸等）將角蛋白中的二硫鍵氧化為磺酸基，或利用還原劑（如巰基乙酸、巰基乙酸鈉等）將角蛋白分子中的二硫鍵還原成巰基，獲得可溶性角蛋白。其中，氧化法易斷裂肽鍵，不易形成高分子量產(chǎn)品；而還原法對肽鍵的影響較少，易獲得長鏈肽；但巰基的化學(xué)性質(zhì)較為活潑，需要加入保護(hù)劑（如鼠李糖脂）避免巰基被氧化，以獲得穩(wěn)定的角蛋白產(chǎn)品[22]。電化學(xué)還原法是指將角蛋白置于電解液中，利用電流使角蛋白發(fā)生還原反應(yīng)，斷裂二硫鍵形成巰基。同時(shí)巰基會(huì)與電解液中其他離子結(jié)合避免再次被氧化。在反復(fù)地滲透、透析后可以獲得可溶性角蛋白。但電化學(xué)還原法降解工藝操作較為復(fù)雜，且產(chǎn)物成分多樣。

化學(xué)法降解角蛋白存在的主要問題是會(huì)破壞角蛋白中部分氨基酸，且工藝較為復(fù)雜，成本偏高。同時(shí)，在降解角蛋白的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水，嚴(yán)重污染環(huán)境[23]，這些問題都阻礙了化學(xué)法降解角蛋白的應(yīng)用與推廣。

2.3 生物法降解角蛋白

2.3.1 微生物法降解角蛋白微生物降解法是指在一種或多種微生物的共同作用下降解角蛋白，具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物利用率較高的特點(diǎn)。目前，已發(fā)現(xiàn)的可降解角蛋白的微生物包括真菌、放線菌和細(xì)菌。1899年Ward[24]首次發(fā)現(xiàn)可以降解羽毛的真菌——馬爪甲團(tuán)囊菌Onygena equina。后來，發(fā)現(xiàn)多種真菌都具有降解角蛋白的能力[25-26]，例如Microsporum canis[27]，Trichophyton mentagrophytes[28]，Scopulariopsis brevicaulis[29]等。然而，降解角蛋白的真菌大多數(shù)為皮膚致病菌，存在環(huán)境外溢污染的風(fēng)險(xiǎn)，在工業(yè)中難以被直接利用。當(dāng)前，大多數(shù)可以降解角蛋白的放線菌屬于鏈霉菌屬，已篩選出多株可以降解頭發(fā)、羽毛和羊毛的鏈霉菌菌株，比真菌安全性高，如Streptomyces pactim[30], Streptomyces fradiae[31]等。部分細(xì)菌也可以降解角蛋白[26]，已發(fā)現(xiàn)了部分可耐受高溫或耐受堿性環(huán)境的角蛋白降解細(xì)菌，如Fervidobacterium islandicum[10]，Thermoanaerobactersp.[32]等，這類細(xì)菌在工業(yè)應(yīng)用中具有顯著的優(yōu)勢。

2.3.2 酶法降解角蛋白生物法降解角蛋白相較于物理法或化學(xué)法更具優(yōu)勢。然而，部分微生物由于是致病菌或條件致病菌，使用過程中外溢擴(kuò)散導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)很高，極大地限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的大范圍應(yīng)用，且菌體生長過程中也會(huì)利用降解的角蛋白作為碳氮源，直接影響了最終的降解得率。因此，使用重組表達(dá)、純化獲得的角蛋白酶進(jìn)行角蛋白降解的優(yōu)勢凸顯。

目前已被鑒定的角蛋白酶都屬于絲氨酸蛋白酶家族和金屬蛋白酶家族，根據(jù)MEROPS肽酶數(shù)據(jù)庫（https://www.ebi.ac.uk/merops/）對角蛋白酶的分類，可細(xì)分為14個(gè)蛋白家族，分別為絲氨酸蛋白酶S1、S8、S9、S10、S16和金屬蛋白酶M3、M4、M14、M16、M28、M32、M36、M38、M55[7]。大多數(shù)角蛋白酶不能單獨(dú)降解角蛋白，需要與能夠打開二硫鍵的酶聯(lián)用共同降解角蛋白[33]。根據(jù)角蛋白酶攻擊角蛋白的位點(diǎn)，又可以分為內(nèi)切角蛋白酶、外切角蛋白酶和寡肽酶（表1）。

表1 角蛋白酶分類及其降解機(jī)制

內(nèi)切角蛋白酶催化角蛋白內(nèi)部肽鍵的斷裂，S1、S8、S16、M4、M16、M36蛋白家族的角蛋白酶屬于內(nèi)切酶（表1）[7]。S1與S8蛋白酶家族的角蛋白酶通過經(jīng)典的催化三聯(lián)體（Ser-Asp-His）行使功能。馬怡茗等[30]將Streptomyces albidoflavus基因組中發(fā)現(xiàn)的基因gm2886構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒pSET152上，在Streptomyces pactum中異源表達(dá)，獲得一種S1蛋白家族角蛋白酶, 在還原劑DTT的存在時(shí)可以水解天青角蛋白和羽毛。Huang等[9]挖掘非致病菌Onygena corvina基因組，將獲取的角蛋白酶基因于畢赤酵母中表達(dá)，獲得一種S8蛋白家族的角蛋白酶6 877，這似乎是一種真正的角蛋白酶，因?yàn)樗軌騿为?dú)催化豬鬃降解，而不需要添加還原劑來破壞角蛋白中的二硫鍵。Kang等[10]從可降解羽毛的極端嗜熱菌Fervidobacterium islandicum中分離出S16和M16蛋白家族的角蛋白酶。與S1與S8蛋白家族的角蛋白酶不同，S16蛋白家族的角蛋白酶催化活性位點(diǎn)為Ser-Lys二元催化機(jī)制。將S16或M16角蛋白酶添加到F.islandicum細(xì)胞提取物中，可以提高羽毛在體外的降解效率[10]。Gegeckas等[34]從嗜熱細(xì)菌Geobacillus stearothermophilus發(fā)現(xiàn)M4蛋白家族的角蛋白酶GEOker。該酶屬于鋅金屬蛋白酶，His372-Glu373-His376催化三聯(lián)體對GEOker酶的催化能力起至關(guān)重要的作用，可以與DTT共同作用降解羊毛。Chaya等[35]從Fusarium oxysporum中鑒定出2種蛋白酶KrtA和KrtC。對編碼這些蛋白的基因krtA和krtC進(jìn)行了分離和鑒定。在Aspergillus oryzae中成功表達(dá)并分泌rKrtA和rKrtC。同時(shí)添加rKrtA和rKrtC可以完全去除羊毛纖維的角質(zhì)層，經(jīng)鑒定KrtA屬于S8蛋白家族，KrtC為M36蛋白家族的角蛋白酶。

外切角蛋白酶攻擊角蛋白多肽鏈的末端，S9、M38、M55蛋白家族的角蛋白酶由N端開始降解肽鏈，S10、M14、M28蛋白家族的角蛋白酶則由C端開始降解角蛋白肽鏈[7]。Monod等[36]從Trichophyton rubrum中分離出來2種來自于S9蛋白家族的經(jīng)典角蛋白酶，也是通過Ser-Asp-His催化三聯(lián)體行使功能。Kang等[10]從F.islandicum中基因組中挖掘到M38和M55蛋白家族的角蛋白酶基因，與僅使用F.islandicum的細(xì)胞提取物相比，加入純化后的M38和M55蛋白家族角蛋白酶可以提高游離氨基酸的釋放率，M38蛋白家族角蛋白酶可能負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)角蛋白水解，而M55蛋白家族角蛋白酶可能在饑餓條件下被激活，控制細(xì)胞內(nèi)被降解的小肽片段的流動(dòng)。Zaugg等[37]從人類致病性皮膚癬菌T.rubrum中分離出可以降解致密角質(zhì)的角蛋白酶TruScpA和TruScpB，由于這2個(gè)酶與細(xì)胞膜上的糖基磷脂酰肌醇錨定，不能分泌到胞外，它們都屬于S10蛋白家族，其核心催化組件依然是Ser-Asp-His催化三聯(lián)體。在感染過程中糖基磷脂酰肌醇錨定的TruScpA和TruScpB與內(nèi)切角蛋白酶和寡肽酶聯(lián)用共同降解致密的角化組織，從而增強(qiáng)T.rubrum的侵染能力。T.rubrum在以角蛋白和大豆為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基中可以分泌表達(dá)角蛋白酶McpA，它屬于M14蛋白家族，氨基酸殘基Arg237、Arg255、Tyr311、Tyr362和Glu385對M14家族角蛋白酶的底物結(jié)合和催化非常重要，而His179、Glu182和His309則作為鋅離子的配體[37-38]。Wu等[39]從角蛋白降解菌S.fradiae變種K11中發(fā)現(xiàn)了屬于M28蛋白家族的角蛋白酶，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功異源表達(dá)。EDTA可抑制該酶的酶活，而Ca2+與Co2+則對該酶有激活作用。

目前發(fā)現(xiàn)的寡肽酶僅存在于2個(gè)金屬蛋白酶家族M3與M32，皆為鋅依賴性金屬蛋白酶[7]。Huang等[9]通過對Onygena corvina基因組的分析，推測有18種酶可能有降解角蛋白的功能，并最終在畢赤酵母中成功異源表達(dá)了分屬3個(gè)蛋白家族（S8，M28和M3）的5個(gè)角蛋白酶，其中M3蛋白家族角蛋白酶為寡肽酶，由這5個(gè)蛋白酶中的3種（每個(gè)蛋白家族各1種）組成的混合酶在體外表現(xiàn)出高度的角蛋白降解活性。Lee等[40]通過比較分析具有角蛋白降解活性的F.islandicumAW-1和無角蛋白降解活性的Fervidobacterium nodosum的基因組信息，發(fā)現(xiàn)FIAW1_1 600基因在角蛋白降解過程中發(fā)揮著重要作用，并在大腸桿菌中成功異源表達(dá)出分子量為107 kDa的蛋白，為同型二聚體，且在Co2+存在時(shí)，80℃、pH 7.0條件下酶活性最高。該酶主要裂解具有堿性氨基酸序列的多肽鏈C端，加入細(xì)胞提取物后，顯著促進(jìn)了雞毛的降解。

2.3.2.1 角蛋白酶的發(fā)育進(jìn)化分析 為探究角蛋白酶在自然界中的發(fā)育進(jìn)化關(guān)系，筆者使用軟件MEGA11中最大簡約法（Maximum parsimony,MP）[41]構(gòu)建部分角蛋白酶系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。筆者從NCBI下載了17個(gè)角蛋白酶氨基酸序列。聚類分析發(fā)現(xiàn)，（1）由同種微生物產(chǎn)生的同家族角蛋白酶的親緣關(guān)系十分接近，如由O.corvina分泌的2種S8家族角蛋白酶在進(jìn)化樹中的同一簇上（圖3）。（2）同種微生物產(chǎn)生的不同蛋白家族的角蛋白酶親緣關(guān)系則不一定接近，如F.islandicum可以分泌分屬5種不同家族（S16，M32，M38，M55和M16蛋白家族）角蛋白酶，其中S16與M32蛋白家族的角蛋白酶親緣關(guān)系較近，而M38，M55和M16蛋白家族的角蛋白酶親緣關(guān)系則較為接近。T.rubrum可以分泌分屬于3個(gè)不同蛋白家族（S10，S9和M14）的5個(gè)角蛋白酶——S9和S10蛋白家族各2個(gè)，M14蛋白家族1個(gè)，其中S9和S10蛋白家族內(nèi)2種角蛋白酶親緣關(guān)系較近，M14蛋白家族與S9和S10蛋白家族的角蛋白酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）?？傮w來看，絲氨酸蛋白酶家族或金屬蛋白酶家族內(nèi)部的角蛋白酶親緣關(guān)系相對較近，不同蛋白家族的角蛋白酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。不過也存在例外，如F.islandicum分泌的屬于S16絲氨酸蛋白家族角蛋白酶與M32金屬蛋白酶家族角蛋白酶的親緣關(guān)系較近，與金屬蛋白家族M38，M55和M16角蛋白酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 角蛋白酶氨基酸序列聚類系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.2.2 角蛋白酶解的分子機(jī)制 降解角蛋白的第一步反應(yīng)是還原角蛋白中的二硫鍵，能夠催化二硫鍵斷裂的酶包括二氫硫辛酰胺脫氫酶（EC 1.8.1.4）、谷胱甘肽還原酶（EC 1.8.1.7）、硫氧還蛋白還原酶（EC 1.8.1.9）、磷酸腺苷硫酸鹽還原酶（EC 1.8.4.8）、肽甲硫氨酸亞砜還原酶（EC 1.8.4.11）、烷基過氧化氫還原酶（EC 1.11.1.15）、半胱氨酸雙加氧酶（EC 1.13.11.20）、核糖核苷二磷酸還原酶（EC 1.17.4.1），這些酶都可能與角蛋白的降解相關(guān)[42]。其中，二硫鍵還原酶、半胱氨酸雙加氧酶和谷胱甘肽還原酶在角質(zhì)分解中發(fā)揮重要作用，如皮膚癬菌在角質(zhì)組織生長時(shí)，半胱氨酸雙加氧酶Cdo1會(huì)催化半胱氨酸形成亞硫酸鹽，隨后由亞硫酸鹽外排泵Ssu1排出，而亞硫酸鹽作為一種還原劑，可以直接破壞角蛋白中的二硫鍵，從而促進(jìn)角蛋白降解[43]。

盡管角蛋白酶降解角蛋白的詳細(xì)分子機(jī)制尚未完全清楚，但已有部分假說嘗試解釋角蛋白的酶解過程及分子機(jī)制。角蛋白含有大量的二硫鍵和氫鍵，在角蛋白酶開始降解前，需要對二硫鍵進(jìn)行初步的降解以松動(dòng)角蛋白的結(jié)構(gòu)，使角蛋白酶便于攻擊肽鏈[42]。因此，對于角蛋白的降解主要分為2個(gè)過程，即二硫鍵的還原和角蛋白水解酶降解蛋白多肽鏈。如果二硫鍵不被破壞，大多數(shù)角蛋白酶無法有效降解天然角蛋白，如在沒有還原劑存在的情況下，Bacillussp.中分離出的角蛋白酶WF146無法降解羽毛[44]；角蛋白酶Cibenza DP100無法在沒有還原劑的條件下降解毛發(fā)，產(chǎn)生可溶性多肽[45]。也有部分微生物無法分泌二硫鍵還原酶或亞硫酸鹽，但是可以依賴細(xì)胞代謝還原二硫鍵，這可能是膜電位發(fā)揮了關(guān)鍵作用[46]。角蛋白致密的結(jié)構(gòu)松動(dòng)后，角蛋白酶即可發(fā)揮降解作用。這些微生物利用了代謝中產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)或膜電位與角蛋白酶共同作用降解角蛋白。例如，在皮膚癬菌侵染角質(zhì)組織時(shí)，一旦角蛋白中二硫鍵被破壞，外切角蛋白酶家族（S9、S10、M14和M28）從兩端切割肽鏈，內(nèi)切角蛋白酶家族（S1、8、M4和M36）成員將長鏈角蛋白多肽切割為短肽，而寡肽酶家族（M3和M32）則作用于寡肽以釋放單個(gè)氨基酸或短肽[47]。羊毛纖維表面含有大量脂質(zhì)，脂質(zhì)層包含18-甲基二十碳烯酸和其他脂肪酸，它們主要通過硫酯鍵與富含半胱氨酸的底層蛋白質(zhì)結(jié)合[48]，推測脂肪酸降解相關(guān)的酶有助于破壞角蛋白的外部脂質(zhì)層，從而使蛋白水解酶更容易接近內(nèi)部角蛋白結(jié)構(gòu)。此外，角質(zhì)酶（EC 3.1.1.74）也可能有助于角蛋白的消化。與角蛋白酶相似，角質(zhì)酶可以與疏水性極強(qiáng)的底物結(jié)合，不少天然角蛋白材料中含有角質(zhì)成分，例如羊毛等。推測在降解天然角蛋白材料的過程中，角蛋白酶與角質(zhì)酶之間可能存在協(xié)同作用。

綜上所述，單靠一種角蛋白酶一般難以將角蛋白高效降解為游離氨基酸，通常需要多種酶互相配合才能完成。例如，Aspergillusspp.和Lactobacillusspp.，通過Laps(M28)和Dpp Ⅳ(S9)協(xié)同消化由角蛋白內(nèi)切酶產(chǎn)生的肽鏈[49]。對O.corvina的角蛋白酶的研究表明，由S8蛋白家族、M28蛋白家族和M3蛋白家族構(gòu)成的角蛋白酶混合物協(xié)同分解豬鬃角蛋白[9]。近期報(bào)道的F.islandicumAW-1降解羽毛的酶學(xué)性質(zhì)也指出，不同類型角蛋白酶之間的協(xié)同作用有助于天然角蛋白的降解，羽毛亞硫酸化后，膜內(nèi)金屬蛋白酶（M48）和至少3種其他的膜蛋白酶（分別屬于S41、S54和S8蛋白家族）參與催化羽毛降解。隨后，釋放的氨基酸和多肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到F.islandicum細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步降解，所涉及的角蛋白酶包括屬于M16，M38，M55和S16蛋白家族的蛋白酶[10]。

3 角蛋白降解產(chǎn)物及其應(yīng)用

角蛋白的降解液中含有多種氨基酸和小肽，包括必需氨基酸和非必需氨基酸，具有一定的醫(yī)藥、工業(yè)生產(chǎn)原料和飼料添加的應(yīng)用價(jià)值。角蛋白的降解液有較高的抗氧化活性，具有維持還原環(huán)境的應(yīng)用前景[50]。不同角蛋白降解后獲得的多肽成分也有明顯差異。

3.1 降解產(chǎn)物在醫(yī)藥中的應(yīng)用Fontoura等[51]發(fā)現(xiàn)Chryseobacteriumsp.kr6降解羽毛的發(fā)酵產(chǎn)物有抗氧化和抗高血壓的活性，可以有效抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和二胎基肽酶-4的活性，這為防治高血壓和糖尿病提供了新的可能性。角蛋白具有良好的細(xì)胞親和性和生物相容性，這使得角蛋白具有成為醫(yī)療材料的潛力，例如羽毛的降解產(chǎn)物可以與其他高分子材料聚合應(yīng)用于人工支架或人工關(guān)節(jié)材料[52]。

3.2 降解產(chǎn)物在工業(yè)中的應(yīng)用角蛋白的降解液也可以直接作為其他發(fā)酵過程的培養(yǎng)基添加劑。Hassan等[53]利用Bacillus thuringiensisMT1分泌的角蛋白酶降解驢毛，在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeATCC 64 712發(fā)酵生產(chǎn)維生素B的過程中額外添加驢毛降解產(chǎn)物，添加量為1.5%時(shí)，顯著提高了維生素B1、維生素B2和維生素B12的產(chǎn)量。

3.3 降解產(chǎn)物在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用我國的角蛋白資源十分豐富，禽肉產(chǎn)量在2019年已經(jīng)達(dá)到2 239萬t，按照雞毛質(zhì)量占總質(zhì)量的7 %計(jì)算，羽毛的年產(chǎn)量約為156.73萬t[54]。羽毛中含有蛋白質(zhì)、微量元素、維生素以及未知生長因子，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料，合理地利用角蛋白資源可以緩解我國蛋白質(zhì)飼料的短缺。

4 小結(jié)與展望

角蛋白在自然界中豐度高，但結(jié)構(gòu)穩(wěn)定難以被降解。如無法妥善處理，則會(huì)造成資源浪費(fèi)，污染環(huán)境甚至傳播疾病。目前，通過物理或化學(xué)方法處理角蛋白的成本較高，對環(huán)境不友好并且無法獲得高價(jià)值的降解產(chǎn)物。利用生物法，尤其是使用角蛋白酶直接分解角蛋白可以克服物理、化學(xué)法的劣勢，在不破壞環(huán)境的前提下獲得可以在醫(yī)藥，工業(yè)生產(chǎn)及養(yǎng)殖業(yè)中有效利用的高價(jià)值的降解產(chǎn)物。

角蛋白作為一種難溶于水的蛋白質(zhì)，探明角蛋白酶如何在疏水界面識(shí)別、結(jié)合角蛋白具有重要的生物學(xué)意義和應(yīng)用潛力。這對于明確角蛋白酶如何在兩性界面正常發(fā)揮作用也具有重要的科學(xué)研究價(jià)值。同時(shí)這些研究成果勢必在極大程度上促進(jìn)角蛋白在醫(yī)藥、健康、工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。當(dāng)前，對于角蛋白酶的研究還不夠完善，大多數(shù)篩選出的角蛋白酶無法單獨(dú)降解角蛋白，需要在還原環(huán)境中破壞角蛋白二硫鍵后才能發(fā)揮作用，或者同時(shí)使用多種不同的酶才能完全降解羽毛。目前發(fā)現(xiàn)有單獨(dú)降解能力的角蛋白酶數(shù)量很少，如Huang等[9]發(fā)現(xiàn)的蛋白酶6 877 （S8），這些角蛋白酶資源無法滿足大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用需求。篩選和純化耐高溫、耐酸堿和更加高效的角蛋白酶、探明角蛋白酶降解角蛋白的分子機(jī)制以及充分利用角蛋白酶對角蛋白進(jìn)行有目的的剪切，獲得高純度、高附加值的目標(biāo)降解產(chǎn)物仍是今后研究的重點(diǎn)。