油棕乙?；；d體蛋白硫酯酶EgFATA基因的克隆與功能分析

金 柳，李萌晗，鄭育聲，李東棟,

（1.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，?？冢?70228; 2.海南大學(xué) 三亞南繁研究院，三亞，572024）

油棕（Elaeis guineensisJacq.）又名油椰子，為原產(chǎn)于熱帶非洲的棕櫚科多年生單子葉木本植物[1]，在中國(guó)主要分布于海南省南部、云南省西雙版納等地區(qū)，壽命長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，年均單位面積產(chǎn)油量（CPO）高達(dá) 3.7 t·hm-2[2]，是世界油料的重要來(lái)源之一。油棕果實(shí)的中果皮是重要的油脂積累組織，主要產(chǎn)物為棕櫚油，棕櫚油的用途廣泛，在食品加工、輕工業(yè)、機(jī)械和生物清潔能源等領(lǐng)域均有應(yīng)用[3-6]。棕櫚油中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例約為 1∶1 。新鮮油棕果肉含有約38%～45% 的棕櫚酸（C16:0），38%～44% 的油酸（C18:1），10%～12% 的亞油酸（C18:2）和 3%～5%硬脂酸（C18:0），總飽和度約為 50%。提高食用油中油酸（C18：1）等不飽和脂肪酸含量，降低飽和脂肪酸在總油脂中的比例，一直是油棕遺傳改良的重要目標(biāo)之一。

乙酰基?；d體蛋白硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase, FAT）是一種由核基因編碼的可溶性酶，主要作用于?；虯CP間的硫酯鍵，水解硫酯鍵、釋放ACP和游離的脂肪酸，從而停止碳鏈的延長(zhǎng)[7-8]。目前研究的高等植物中?；?ACP硫酯酶根據(jù)其分解底物的特異性可分為兩類[9]：一類是FATA（?；d體蛋白硫酯酶A），在油棕中主要作用于十八碳鏈脂肪酸鏈（C18:X-ACP），但在不同的物種中具體對(duì)應(yīng)關(guān)系有較大差異；另一類則是FATB（?；d體蛋白硫酯酶B），主要作用飽和脂?；?ACP[10]，對(duì)C16:0-ACP的催化活性最高[11]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默 （virus induced gene silencing, VIGS）利用插入了植物靶基因cDNA片段的病毒載體侵染植物，進(jìn)入植株的病毒在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中能夠特異性識(shí)別與插入片段序列同源的mRNA，使其降解從而抑制靶基因的表達(dá)[12]。常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證基因功能時(shí)，常需要植物生長(zhǎng)至F2代甚至F3代時(shí)才能展開(kāi)研究，而VIGS體系的應(yīng)用，可在較短時(shí)間內(nèi)通過(guò)觀察植株的表型或生理指標(biāo)的變化，應(yīng)用VIGS技術(shù)對(duì)基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證。VIGS體系的應(yīng)用特別適合于多年生木本植物中基因的功能鑒定[13]。在本研究中，油棕胚狀體實(shí)驗(yàn)材料的選擇可以克服油棕遺傳轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)的困難，加快基因功能的鑒定與研究，同時(shí)保持了油棕的物種特性。

油棕是熱帶重要油料作物，產(chǎn)油量較高且用途廣泛。然而，作為食用油來(lái)說(shuō)，棕櫚油脂肪酸比例的改善一直是油棕的重要育種目標(biāo)之一[14-15]。其中，油棕乙?；?ACP硫酯酶決定了脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和飽和度，被認(rèn)為對(duì)脂肪酸組分的改善有重要的價(jià)值。目前，油棕中油棕乙酰基-ACP硫酯酶的具體功能尚不明確，沉默EgFATA基因的表達(dá)并測(cè)定基因沉默前后脂肪酸種類的變化，能夠解析EgFATA的具體功能及其在脂肪酸調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料試驗(yàn)使用的油棕胚狀體由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室提供、誘導(dǎo)并保存。保存方式：溫度28 ℃，相對(duì)濕度 65%，光照強(qiáng)度 400 μmol·m-2·s-1，28 d繼代培養(yǎng)1次，光照 16 h，黑暗 8 h交替培養(yǎng)。pTRV1、pTRV2載體由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)李媛媛老師惠贈(zèng)；pEASY-T1-Simple-Cloning Kit試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物公司。

1.2 EgFATA的克隆和生物信息學(xué)分析參照NCBI公布的基因序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_029265988.1?report=fasta），使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)帶接頭的FATA引物(F:atgaattcATGCTGAAGGGGTACCACGTG；R：atgagctcTCATCGAACCAACTTCCTCCA），酶切位點(diǎn)為Ecor1和Spe1，以實(shí)驗(yàn)室保存的油棕果cDNA為克隆模板，使用諾唯贊的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，其中，退火溫度為57 ℃，延伸時(shí)間為2 min。使用Cycle-Pure Kit試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將目的片段37 ℃、30 min構(gòu)建到pEASYT1 Simple Cloning Kit中間載體上，用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，重組載體酶切鑒定、測(cè)序均驗(yàn)證無(wú)誤后，保藏菌種。

對(duì)EgFATA (XP_010927699.1)的蛋白序列使用ProtParam軟件分析理化性質(zhì)， 使用ProtScale對(duì)EgFATA蛋白序列的疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)；對(duì)FATA使用TMHMM蛋白跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)分析；使用MEGA 7.0對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)檢索出的EgFATA的同源蛋白聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3 EgFATA的VIGS載體構(gòu)建以測(cè)序正確的EgFATA-pEASY-Blunt質(zhì)粒為模板，于NCBI在線選取EgFATA200～500 bp的特異性片段，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)EgFATA特異性片段的引物(F:atgaattcTTGGATGGGTCCTCGAAAGC;R:atgagctcGTGCGGCCCCGATTTATT)，使用Cycle-Pure Kit試劑盒純化PCR產(chǎn)物后，通過(guò)Takara T4 DNA Ligase試劑盒22 ℃、1 h連接目的片段與線性化pTRV2載體，測(cè)序無(wú)誤后使用凍融法轉(zhuǎn)化至EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)中，甘油法保藏菌種。

1.4 VIGS侵染油棕胚狀體于含有Kana+、Lif+的液體培養(yǎng)基（LB）中，28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)pTRV1-EHA105、pTRV2-EHA105、pTRV2-EgFATA-EHA105農(nóng)桿菌菌種，用分光光度計(jì)調(diào)節(jié)菌液OD600=0.5?；旌蟨TRV1-EHA105和pTRV2-EHA-105菌液作為病毒空白對(duì)照，混合pTRV1-EHA105與pTRV2-EgFATA-EHA105作為實(shí)驗(yàn)組，離心收集農(nóng)桿菌菌體后，加入MSO液體培養(yǎng)基懸浮，保持菌液OD600=0.5。使用針扎、浸泡的方式侵染油棕胚狀體，浸泡 5 min 后，將胚狀體放置在滅菌后的濾紙上，吸取多余菌液，之后轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)固體植物培養(yǎng)基（WPM）中(含 20 mg·L-1的AS（乙酰丁香酮）和 100 mg·L-1的半胱氨酸)，19 ℃暗培養(yǎng)2 d。無(wú)菌水清洗胚狀體后將其轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中，在 28 ℃ 溫度下培養(yǎng)。期間淘汰長(zhǎng)勢(shì)不好以及死亡的胚狀體，培養(yǎng)12 d后獲得成功存活下來(lái)的轉(zhuǎn)基因胚狀體，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（qRT-PCR和FAs）分析。

1.5 胚狀體RNA的提取和表達(dá)量分析使用諾唯贊公司的多糖多酚植物RNA提取試劑盒，提取油棕胚狀體RNA，液氮研磨樣品后，不可再次凍融，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。分別計(jì)算野生型、對(duì)照組（病毒組）和實(shí)驗(yàn)組胚狀體RNA濃度，保證RNA加入量相同，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

以油棕保守基因Eg-β-actin為內(nèi)參，根據(jù)EgFATA和Eg-β-actin基因分別設(shè)計(jì)熒光定量引物(qRT-FATA-F：TATCGCCAATCTCCTCCAG；qRTFATA-R：GTTCATCATCACCCACTTGC；qRT-actin-F：TGGAAGCTGCTGGAATCCAT；qRT-actin-R：TCCTCCACTGAGCACAACGTT)使用TaKaRa TD600熒光定量PCR儀和2xQ3 SYBR qPCR Master Mix（22204）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，檢測(cè)EgFATA基因在實(shí)驗(yàn)組和病毒對(duì)照組胚狀體中的表達(dá)量，反應(yīng)體系（20 μL）：上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，2xQ3 SYBR qPCR Master Mix（Universal）10 μL，ddH2O 8 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性 95 ℃；循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線采集95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品設(shè)置 3～4 個(gè)平行，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 VIGS侵染后油棕胚狀體中脂肪酸含量分析

實(shí)驗(yàn)用的槍頭、Ep管進(jìn)行121 ℃、20 min高壓滅菌處理，無(wú)水乙醇灼燒研缽與研磨棒，冷卻后于研缽中研磨等量胚狀體，油脂瓶收集樣品后，使用V氯仿∶V甲醇=2∶1的提取液萃取2～3次，收集上清液經(jīng)無(wú)菌水與0.9% NaCl溶液漂洗后，氮吹儀吹干獲得油脂，加入2.5%濃硫酸的甲醇溶液(V/V)，并加入10 μg的C17烷酸標(biāo)準(zhǔn)品，80 ℃水浴2 h進(jìn)行甲酯化，氮吹儀吹干后，加入適量正己烷溶解，漩渦混勻后加入2 mL 0.9% NaCl溶液，靜置、離心后取上層正己烷有機(jī)相用于高效氣相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EgFATA的克隆與生物信息學(xué)分析以油棕果cDNA為模板，PCR方法擴(kuò)增獲得EgFATA基因的CDS區(qū) 1 155 bp，1.2%瓊脂糖凝膠回收后，構(gòu)建EgFATA-pEASY-Blunt載體，并對(duì)單菌落PCR檢測(cè)，條帶大小與預(yù)期一致，測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的參考序列相同。使用ProtParam對(duì)EgFATA進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明：EgFATA的編碼區(qū)由 1 155 個(gè)氨基酸的序列組成，編碼 385 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為91.89 kDa 。通過(guò)NCBI在線網(wǎng)站的BLAST功能，比對(duì)EgFATA（XP_010927699.1）蛋白的相似序列，結(jié)果表明：EgFATA與海藻PdFATA（XP_008794588.1）、椰子CnFATA（AZZ09172.1）、鳳梨AcFATA（XP_020106065.1）、香蕉MaFATA（ XP_009411855.1）、野蕉MbFATA（THU68832.1）有極高的同源性，分別為94.28%、91.13%、92.76%、89.76%、89.42%（圖1-A）；為進(jìn)一步確定油棕EgFATA與其他物種間的親緣關(guān)系，于NCBI在線網(wǎng)站BLAST中繼續(xù)篩選其他物種的FATA基因，使用 MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，EgFATA與海藻PdFATA蛋白相似度最高，親緣關(guān)系最近（圖1-B）。

2.2 EgFATA的VIGS載體構(gòu)建設(shè)計(jì)帶接頭的引物，以EgFATA-pEASY-Blunt質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增方法擴(kuò)增獲得EgFATA基因的特異性片段247 bp，1.2%瓊脂糖凝膠回收后，與經(jīng)Ecor1和Sac1雙酶切的pTRV2線性化載體連接并進(jìn)行酶切鑒定（圖2），測(cè)序結(jié)果表明， EgFATA- pTRV2基因沉默載體構(gòu)建成功，使用凍融法將其轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)中。

圖2 EgFATA- pTRV2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.3 EgFATA基因的沉默（VIGS）分別提取基因沉默實(shí)驗(yàn)組、空白病毒對(duì)照組的胚狀體RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以Eg-β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，與病毒對(duì)照組相比，基因沉默實(shí)驗(yàn)組不同株系的EgFATA表達(dá)量均出現(xiàn)極顯著性下調(diào)，說(shuō)明VIGS體系成功將不同株系中的EgFATA基因的表達(dá)量下調(diào)了85%～90%（圖3）。

圖3 油棕胚狀體中實(shí)驗(yàn)組及病毒對(duì)照組EgFATA基因表達(dá)量的檢測(cè)

2.4 沉默胚狀體中油脂含量變化分別提取實(shí)驗(yàn)組、空白病毒對(duì)照組和野生型的胚狀體總油脂，經(jīng)甲酯化處理后、進(jìn)行高效氣相色譜分析。結(jié)果表明，與野生型和空載病毒對(duì)照相比，沉默EgFATA基因的油棕胚狀體脂肪酸含量發(fā)生變化，C18：0和C18：1極顯著性下降，與C18：0相比，C18：1下調(diào)的程度極顯著；除此之外，C18：2顯著性下降，其他種類的脂肪酸未呈現(xiàn)顯著性變化（圖4）。該結(jié)果說(shuō)明，下調(diào)EgFATA基因的表達(dá)，抑制了油棕胚狀體中十八烷基脂肪酸的合成代謝，從而使C18：0、C18：1、C18:2的含量下降，即油棕胚狀體中EgFATA的催化底物為C18：0-ACP、C18：1-ACP、C18:2-ACP，其中對(duì)C18：1-ACP的偏好性更強(qiáng)。

圖4 EgFATA基因沉默胚狀體中脂肪酸相對(duì)含量的變化

3 討 論

研究結(jié)果表明，EgFATA氨基酸序列與海藻、椰子、鳳梨、香蕉、野蕉同源性極高，在89%以上，說(shuō)明FATA蛋白在不同物種中具有高度的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，EgFATA與PdFATA親緣關(guān)系最近，二者在功能上可能存在相似性。對(duì)沉默EgFATA油棕胚狀體進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)、油脂的提取與脂肪酸分析，與野生型和空載病毒對(duì)照組胚狀體比較發(fā)現(xiàn)，沉默油棕胚狀體中脂肪酸的種類未發(fā)生改變，但含量發(fā)生了顯著性變化，如C18：0、C18：1和C18：2均顯著性降低，說(shuō)明EgFATA表達(dá)量的下調(diào)影響了十八碳鏈脂肪酸（C18：X）的積累。

EgFATA是影響油脂積累的重要基因，Kaczmarzyk[16]和Tan等[17]認(rèn)為，多數(shù)植物FATA基因功能上具有相似性，即對(duì)C18：X-ACP具有催化活性，且對(duì)C18:1-ACP的偏好性更高，這與筆者的研究對(duì)象EgFATA功能相似，下調(diào)油棕胚狀體中EgFATA基因的表達(dá)量后，C18：0和C18：1分別下降75%、90%，C18：1下調(diào)程度更大，與先前報(bào)道相符。然而，文獻(xiàn)報(bào)道顯示有些植物中的FATA基因?qū)18:0-ACP催化活性更強(qiáng)，如油菜中過(guò)表達(dá)山竹GmFATA基因會(huì)使轉(zhuǎn)基因油菜中C18：0的含量顯著提升約20%[18]。除此之外，其他物種中FATA基因還存在不同的對(duì)應(yīng)關(guān)系，Moreno-Pérez等發(fā)現(xiàn)沉默擬南芥AtFATA基因后，其種子的亞麻酸（C18:3）和芥酸（C22:1）含量顯著性增加[19]。

常見(jiàn)的油料作物如油菜、花生、大豆、芝麻等，基因的功能研究均存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率低、操作難度大、研究成本高的問(wèn)題，因此以往的研究多在擬南芥、大腸桿菌、酵母菌[20]等模式物種中開(kāi)展，本研究選擇油棕胚狀體作為實(shí)驗(yàn)材料，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，并且保留物種特性，功能研究更為便捷。與以往研究報(bào)道不同的是，本次發(fā)現(xiàn)EgFATA表達(dá)量的下調(diào)對(duì)C18：2的積累也產(chǎn)生了影響。在分析沉默EgFATA的轉(zhuǎn)基因胚狀體中脂肪酸的含量發(fā)現(xiàn)，C18：2約被下調(diào) 51%，脂肪酸去飽和酶（△12 Fatty acid desaturase,FAD2）是合成C18：2的重要基因，催化C18：1向C18：2的轉(zhuǎn)變[21]。本實(shí)驗(yàn)中C18：2的下調(diào)一方面可能是由于合成底物C18：1的減少，影響了C18：2的積累；另一方面EgFATA可能對(duì)C18：2-ACP也具有催化活性，因此C18:2的積累可能受到EgFATA與EgFAD2的共同調(diào)控。

油棕EgFATA功能的研究探索了EgFATA基因的生物學(xué)功能，解析了EgFATA基因在油棕中與脂肪酸積累的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并為進(jìn)一步研究EgFATA調(diào)控油脂代謝的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。