外泌體在腫瘤診療中的研究進展

張明文,朱佳斌(綜述),張曉峰(審校)

(南方醫(yī)科大學附屬小欖人民醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東 中山 528415)

外泌體(exosome)是哺乳動物細胞釋放的一種具有脂質(zhì)雙層膜的細胞外囊泡(extracellular vesicles)。近年來,外泌體受到越來越多的關(guān)注和研究,也顯示出巨大的臨床應用價值。外泌體來源于多泡體(multivesicular body,MVBs),在透射電鏡下碟形形態(tài),直徑40～100 nm,密度1.13～1.19 g/mL。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)攜帶“貨物”(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸)的外泌體能夠改變受體細胞的功能。外泌體及其貨物可用作腫瘤診斷/預后的標志物,以及作為抗腫瘤藥物的載體。本研究總結(jié)了外泌體在腫瘤微環(huán)境細胞間通訊中的作用及其在腫瘤診療中的應用。

1 外泌體的生物學特征

1987年,Johnstone等［1］首次發(fā)現(xiàn)成熟的綿羊網(wǎng)織紅細胞可釋放出小囊泡。起初,這個小囊泡被認為是用來去除細胞內(nèi)容物中的“垃圾”。直到1987年,這種囊泡才在超速離心下獲得并命名為外泌體。大多數(shù)細胞在生理或病理條件下都能分泌外泌體,如網(wǎng)織紅細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞、血小板、肥大細胞、腫瘤細胞等［2］。外泌體廣泛分布于血液、尿液、腦脊液、母乳等多種體液中。

外泌體是由某些脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸組成的。外泌體形成是早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體的結(jié)果,在此過程中內(nèi)體將分選的蛋白質(zhì)和核酸以出芽的形式包裹起來,形成腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles),逐漸形成多泡體。隨后,多泡體被分泌到細胞外空間形成外泌體或者與細胞內(nèi)溶酶體融合從而被降解［3］。不同細胞分泌的外泌體主要通過受體-配體相互作用、直接與質(zhì)膜融合、內(nèi)吞作用將信息傳遞給受體細胞。

2 外泌體的檢測

隨著對外泌體的研究越來越多,外泌體已顯示出巨大的潛在應用價值。目前,外泌體的分離方法有超速離心(ultracentrifugation)、聚合物沉淀(polymer precipitation)、基于尺寸的分離(size-Based Isolation)、免疫親和層析(immunoaffinity chromatography)、exoEasy Maxi試劑盒(QIAGEN)、MagCaptureTM外泌體分離試劑盒、PS親和法外泌體提取試劑盒(Wako)和MinuteTM高效外泌體沉淀試劑(Invent)。盡管已經(jīng)開發(fā)了多種方法來分離和純化外泌體,但單一方法具有各種缺點。因此,為了提高外泌體的分離效率,需要結(jié)合多種方法對外泌體進行分離純化,以提高產(chǎn)量和純度。

外泌體的鑒定包括外泌體特異性標記蛋白的檢測和外泌體外部表征的檢測。外泌體中均可檢測到膜蛋白和細胞質(zhì)蛋白。外泌體上的一些膜蛋白參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展,因此被用作外泌體分離和純化的靶點。免疫印跡試驗(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是兩種常用的外泌體蛋白檢測方法。但這些方法存在過程復雜、敏感度低的問題。到目前為止,已經(jīng)開發(fā)了多種新技術(shù)來檢測外泌體蛋白,包括比色檢測(colorimetric detection)、熒光檢測(fluorescence detection)、電化學檢測(electrochemical detection)、表面等離子體共振檢測(surface plasmon resonance detection)、表面增強拉曼散射(surface enhanced Raman scattering)、CRISPR/Cas系統(tǒng)輔助檢測(CRISPR/Cas system-assisted detection)和單外泌體檢測(single exosome detection)［4］。外泌體表征技術(shù)主要包括生物物理技術(shù)和分子技術(shù)。生物物理技術(shù)包括冷凍電子顯微鏡(cryo-electron microscopy)、拉曼光譜(raman spectroscopy)、動態(tài)光散射(dynamic light scattering)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy)和原子力顯微鏡(atomic force microscopy)。此外,特定的外泌體膜標記功能化原子力顯微鏡尖端允許識別和檢測單個外泌體中的蛋白質(zhì)。分子技術(shù)包括流式細胞術(shù)(flow cytometry)和透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy)。動態(tài)光散射技術(shù)(dynamic light scattering)、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(nanoparticle tracking analysis)和可調(diào)電阻脈沖傳感技術(shù)(tunable resistive pulse sensing)能夠?qū)ν饷隗w進行定量分析。這些技術(shù)將從內(nèi)體表征(如膜蛋白、脂筏)和外部表征(形態(tài)和粒徑)檢測外泌體。

3 外泌體在腫瘤診療中的應用

3.1在腫瘤診斷中的應用 外泌體可以很容易地從血液、尿液、唾液和腦脊液等大多數(shù)體液中獲得,可以作為液體活檢的工具。外泌體被脂質(zhì)雙層膜包裹的結(jié)構(gòu)使其所攜帶的“貨物”在運輸過程中很難被降解,所以,外泌體高度保留了原始的細胞生物學信息。因此,作為液體活檢的工具,外泌體比循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA)和循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells)更具優(yōu)勢。外泌體所含的生物活性分子可以反映腫瘤細胞的病理狀態(tài)。在一項針對28名健康體檢人員、60例慢性肝病患者和90例肝細胞癌患者的外泌體microRNA特征的臨床研究中,Cho等［3］發(fā)現(xiàn),與正常肝細胞相比,在肝細胞癌患者的外泌體中發(fā)現(xiàn)了49個顯著過表達的microRNA。其中,血清exo-miR-10b-5p有成為早期診斷肝細胞癌的一種潛在的生物標志物,其曲線下面積為0.934(敏感度為90.7%;特異度為75.0%;截止值為1.8倍)。另一項研究發(fā)現(xiàn),與健康人員相比,結(jié)直腸癌患者的外泌體miR-139-3p表達水平顯著下調(diào)［5］。而與結(jié)直腸癌患者相比,轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中外泌體miR-139-3p表達水平更低［5］。這表明結(jié)直腸癌患者血漿中外泌體miR-139-3p表達水平降低可作為結(jié)直腸癌早期診斷和轉(zhuǎn)移監(jiān)測的生物標志物。最近,Lv等［6］發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,乳腺癌患者血清中外泌體miR-17-5p的表達水平降低。外泌體miR-17-5p是一種優(yōu)于常規(guī)血清生物標志物CEA、CA125和CA153高度敏感和特異的乳腺癌生物標志物。越來越多的研究表明,環(huán)狀RNA(circRNA)在腫瘤發(fā)生中起著重要作用。例如,Wu等［7］發(fā)現(xiàn)circ_0006156在甲狀腺乳頭狀癌患者的血清外泌體中上調(diào)。重要的是,circ_0006156通過miR-1178/TLR4通路促進甲狀腺乳頭狀癌進展。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度超過200個核苷酸且缺乏編碼潛力的調(diào)節(jié)性非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、癌癥進展和細胞分化等眾多生物學過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Piao等［8］發(fā)現(xiàn),胃癌患者的組織和血漿外泌體中l(wèi)ncRNACEBPA-AS1的水平顯著增加。此外,胃癌細胞分泌的外泌體lncRNA CEBPA-AS1可以促進細胞增殖,抑制細胞凋亡,從而誘導胃癌細胞的惡性進展。另一項研究還表明,胃癌患者的外泌體lncRNA MIAT分泌水平顯著高于胃腺瘤患者和健康對照組［9］。蛋白質(zhì)是外泌體的重要載體,在腫瘤診斷中發(fā)揮著重要作用。乳酸脫氫酶C4(lactate dehydrogenase C4,LDH-C4)是一種由LDHC mRNA編碼參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展的蛋白。Cui等［10］發(fā)現(xiàn)治療組肝細胞癌患者血清和外泌體LDH-C4水平高于初診組,但低于復發(fā)組。因此,血清和外泌體LDH-C4可作為早期診斷的生物標志物。這些發(fā)現(xiàn)表明外泌體在腫瘤診斷中具有巨大的應用潛力。

3.2在腫瘤治療中的應用 目前有大量研究表明介導外泌體生物合成的機制失調(diào)是引起腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因。因此,靶向外泌體生物合成是一種很有前途的腫瘤治療策略。中性磷酸脂酶2(neutral sphingomyelinase-2,nSMase2)是將鞘磷脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺的關(guān)鍵酶,已被證實參與外泌體的合成。最近有研究表明,非競爭性nSMase2抑制劑GW4869通過抑制腫瘤細胞合成、分泌外泌體改善曲妥珠單抗對腫瘤細胞的腫瘤效果［11］。磷脂酶D2(phospholipase D2,PLD2)是Syndecan-Syntenin-Alix外泌體合成途徑的調(diào)節(jié)因子。Borel等［12］指出非特異性PLD2抑制劑Halopemide可通過抑制前列腺癌外泌體的分泌抑制前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。膽固醇是腫瘤中外泌體分泌所必需的。Kulshreshtha等［13］研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可通過降低膽固醇減少幾種巨噬細胞和上皮細胞的外泌體分泌。目前關(guān)于他汀類藥物通過調(diào)節(jié)外泌體分泌來發(fā)揮其抗癌特性的機制并未完全闡明。在另一項研究中,Lv等［14］使用黃連堿抑制腫瘤相關(guān)成纖維細胞分泌外泌體circCCT3,從而在體內(nèi)和體外阻斷肝細胞癌的進展。腫瘤外泌體生成與Ras/Raf/ERK信號通路密切相關(guān)。有報道指出,ERK抑制劑SCH772984通過阻斷外泌體的分泌促進CD8+T細胞向腫瘤遷移,從而增強腫瘤免疫治療的療效［15］。研究已經(jīng)證實攜帶腫瘤細胞來源的程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的細胞外泌體與產(chǎn)生程序性死亡1(programmed death 1,PD-1)的T細胞通過相互作用可顯著降低患者對免疫檢查點阻斷藥物的反應。Lee等［16］發(fā)現(xiàn)macitentan通過抑制腫瘤細胞來源的外泌體PD-L1分泌,減少PD-1與外泌體PD-L1的結(jié)合,協(xié)同抗PD-L1抗體的作用,最終增強CD8+T細胞介導的腫瘤殺傷作用。目前也有研究試圖通過抑制腫瘤相關(guān)外泌體的攝取以達到治療腫瘤的目的。Zheng等［17］發(fā)現(xiàn)用內(nèi)吞作用抑制劑治療可以抑制骨髓基質(zhì)細胞對多發(fā)性骨髓瘤細胞外泌體的攝取,從而抑制骨髓基質(zhì)細胞中多種促增殖途徑的變化?？偟膩碚f,這些研究表明抑制外泌體合成、分泌和攝取可以中斷腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的通訊,這將為腫瘤治療提供潛在的輔助策略。

在臨床上,通過納米技術(shù)將藥物準確遞送至腫瘤細胞是提高腫瘤治療效果的最有希望的手段。與脂質(zhì)體納米材料、金屬納米材料和聚合物納米材料相比,外泌體作為載體具有良好的生物利用度、低非靶向細胞毒性和免疫原性等優(yōu)點。越來越多的研究證明,外泌體可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)移藥物(如治療性化療藥物、miRNA、蛋白質(zhì)等)并被受體細胞吸收。例如,Zhang等［18］開發(fā)了一種用超順磁性氧化鐵納米顆粒修飾過的載有多柔比星的中性粒細胞外泌體,該外泌體在外部磁場下選擇性地聚集在腫瘤部位,有效地抑制了腫瘤生長,并大大延長了小鼠的存活率。氧化石墨烯被殼寡糖和γ-聚谷氨酸共價修飾后形成GO-CO-γ-PGA載體。該載體具有良好的藥物傳遞性能,但不具備主動靶向能力。Chen等［19］利用乳腺癌腫瘤細胞外泌體具有良好的靶向性的特點,將外泌體、GO-CO-γ-PGA、米托蒽醌合成一種全新的仿生納米智能給藥載體(EXO-GO-CO-γ-PGA-MIT),該載體顯示出了良好的抗腫瘤能力。這些研究表明,腫瘤外泌體仿生納米顆粒是一種很有前途的腫瘤治療藥物遞送系統(tǒng),在腫瘤治療中具有潛在應用價值。在另一項研究中,Lin等［20］合成了一種新型靶向PD-L1外泌體,用于通過基因治療肺癌的目的。結(jié)果表明,構(gòu)建的裝載siRNA的靶向外泌體納米囊泡具有低毒性、高裝載率的特點,可用于靶向腫瘤細胞基因治療。MiR-124在治療神經(jīng)母細胞瘤中具有極大的潛力,但其對靶向腫瘤細胞的有效遞送仍然存在巨大挑戰(zhàn)。最近,Sharif等［21］通過人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞遞送的外泌體成功將外源性MiR-124遞送至神經(jīng)母細胞瘤細胞,導致神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖減少并誘導其分化。這表明通過外泌體將外源性miRNA有效遞送至靶向腫瘤細胞有望成為治療腫瘤的新方法。腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor alpha,TNF-α)能夠誘導腫瘤發(fā)生出血性壞死。然而,全身性應用TNF-α會導致嚴重的不良反應。最近,Zhuang等［22］通過轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin-transferrin receptor,Tf-TfR)相互作用將轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的SPIONs(transferrin-modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles,Tf-SPIONs)結(jié)合到TNF-α-外泌體上,產(chǎn)生良好的水分散性TNF-α-外泌體-SPIONs。在小鼠黑色素瘤皮下癌模型中,TNF-α-外泌體-SPIONs可以增強靶向腫瘤的能力,抑制腫瘤生長,同時降低毒性。因此,TNF-α-外泌體-SPIONs在膜靶向治療中顯示出巨大的潛力。

外泌體對免疫系統(tǒng)具有免疫抑制和免疫刺激作用,因此外泌體作為載體可以啟動抗腫瘤免疫反應,對腫瘤進展具有顯著的抑制作用。在一項研究中,Nie等［23］合成了響應性外泌體納米生物偶聯(lián)物用于腫瘤治療,其通過pH敏感的接頭將源自M1巨噬細胞的疊氮化物修飾的外泌體與CD47和SIRPα(aCD47和aSIRPα)的二苯并環(huán)辛炔修飾抗體偶聯(lián)。同時,納米生物偶聯(lián)物可以在全身給藥后有效地將巨噬細胞從促腫瘤M2重編程為抗腫瘤M1。腫瘤疫苗是一種很有前途的癌癥免疫療法,其中納米疫苗已成為一種新穎且有前景的抗癌策略。最近,Liu等［24］在小鼠皮下肺癌模型中開發(fā)了一種腫瘤疫苗,該疫苗將黑磷量子點與外泌體封裝在一起。結(jié)果表明,疫苗接種聯(lián)合光熱療法對肺癌有顯著的治療效果,并促進T淋巴細胞向腫瘤組織的浸潤［24］。

3.3在腫瘤預后中的應用 最近的研究表明,各種類型的腫瘤所分泌的血清外泌體與腫瘤進展、腫瘤惡性程度和預后有關(guān)。Lan等［25］的一項研究發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,膠質(zhì)瘤患者的外泌體miR-210的表達水平升高,并且與總生存期獨立相關(guān)。因此外泌體miR-210的血清水平可作為診斷、預后和缺氧生物標志物來反映膠質(zhì)瘤狀態(tài)和缺氧特征。此外,血清外泌體miR-210水平與腫瘤復發(fā)相關(guān),并隨著病理分級的升高而增加［25］。越來越多的證據(jù)表明,外泌體環(huán)狀RNA在評估各種腫瘤預后方面發(fā)揮著重要作用。例如,Zhang等［26］發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA circTMEM45A水平在肝細胞癌中顯著上調(diào),與肝細胞癌患者的臨床病理特征和預后不良呈正相關(guān)。此外,環(huán)狀RNA circTMEM45A在肝細胞癌患者的血清外泌體中上調(diào)。另一項研究表明,外泌體環(huán)狀RNA circAKT3的上調(diào)與肝細胞癌復發(fā)和病死率升高的風險相關(guān)［27］。此外,術(shù)后對具有高外泌體環(huán)狀RNA circAKT3的肝細胞癌患者進行隨訪可能有助于降低復發(fā)風險并改善預后［27］。越來越多的證據(jù)表明,lncRNAs也具有作為診斷和預后生物標志物的潛力。Li等［28］發(fā)現(xiàn)linc00852在骨肉瘤組織中顯著高表達。外泌體linc00852受AXL表達調(diào)控,也與AXL mRNA表達明顯相關(guān),被認為是一種新的腫瘤生物標志物和骨肉瘤的特殊治療靶點［28］。在另一項研究中,Chen等發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞分泌外泌體長非編碼RNA(lncRNA),稱為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物2(lymph node metastasis-associated transcript 2,LNMAT2),在體外刺激人淋巴管內(nèi)皮細胞遷移,并在體內(nèi)增強腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［29］。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶在谷胱甘肽代謝中起關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明,血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶升高與多種腫瘤的存活率呈負相關(guān)。最近,Horie等［30］發(fā)現(xiàn)在晚期腎細胞癌中,血清外泌體γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶表達升高。這可能是臨床上判斷腎細胞癌預后生物標志物。這些研究表明,外泌體有望成為腫瘤預后的生物標志物。

3.4在臨床應用的挑戰(zhàn) 一些臨床試驗提示外泌體在治療各種人類疾病具有良好的療效。Ye等［31］將間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體用于敏感皮膚的治療,經(jīng)治療后患者包括粗糙、鱗屑、紅斑在內(nèi)的客觀癥狀和包括緊張、灼熱或瘙癢在內(nèi)的主觀癥狀得到明顯緩解。該試驗提示充質(zhì)干細胞衍生的外泌體可改善敏感皮膚患者的臨床癥狀和皮疹,有望作為一種無充質(zhì)干細胞的治療敏感皮膚相關(guān)疾病的新方法。在另一項研究中,Nazari等［32］將臍帶中提取的間充質(zhì)干細胞外泌體用于難治性瘺管患者的治療,經(jīng)治療后患者,患者肛瘺得到改善,同時所有患者均未出現(xiàn)全身或局部不良反應。因此,外泌體在治療各種人類疾病中具有重要價值。但是成功開發(fā)外泌體療法目前也面臨一些巨大障礙,這些障礙急需得到解決［33］。由于外泌體是細胞分泌的產(chǎn)物,細胞選擇是在不改變外泌體組成和功能的情況下產(chǎn)生外泌體的關(guān)鍵第一步。因此,需要開發(fā)產(chǎn)量高、變異性小的細胞系。與此同時,目前也需開發(fā)成熟的生物反應器,使其在最佳無血清培養(yǎng)條件下能夠制造臨床級外泌體。其次,目前急需建立一個強大的外泌體純化工藝以便獲得高產(chǎn)量和高純度的治療外泌體。在外泌體治療藥物生產(chǎn)過程中,雜質(zhì)如宿主細胞蛋白、DNA、細胞碎片、凋亡小體和微囊泡應被盡可能徹底地控制和去除。目前外泌體分析技術(shù)的局限性是大規(guī)模外泌體制造的最大障礙之一。因此,急需建立一套外泌體治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制、分析方法。盡管如此,一些外泌體治療產(chǎn)品通過克服這些制造技術(shù)難題已進入臨床試驗階段。

4 結(jié) 語

總之,目前對腫瘤外泌體的研究尚處于起步階段,外泌體在腫瘤中的病理生理作用及其機制仍有待進一步探索。外泌體含有多種蛋白質(zhì)和核酸,其半衰期長。因此,外泌體有望成為腫瘤診斷的生物標志物,有望提高腫瘤的早期診斷率和腫瘤患者預后的評估。外泌體可以穿過細胞膜,不易引起免疫反應。作為藥物載體,外泌體具有獨特的優(yōu)勢,為基因、抗腫瘤藥物等藥物的轉(zhuǎn)運開辟了一條新途徑。目前,在外泌體工程技術(shù)和外泌體藥物遞送系統(tǒng)設(shè)計方面取得了一些進展。然而,如何實現(xiàn)高效載藥、提高靶向性以及外泌體在腫瘤微環(huán)境中的作用機制仍需深入研究。同時需要注意的是,外泌體給藥系統(tǒng)的臨床轉(zhuǎn)化研究與非臨床研究存在一定的差異。隨著醫(yī)學技術(shù)、外泌體提取和檢測技術(shù)的不斷進步,以及對外泌體生物學功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機制和作用的深入研究,外泌體將為早期腫瘤篩查、精準診斷、個體化治療以及未來抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的思路和策略。