兒童杜氏肌營養(yǎng)不良的基因診斷與臨床分析

劉洪欣 李珉 王昭聞

杜氏肌營養(yǎng)不良于臨床中又叫假性肥大型肌肉萎縮癥，屬于X 連鎖隱性神經(jīng)肌肉相關(guān)疾病，主要特征為進(jìn)行性的肌肉無力反應(yīng)，在早期發(fā)病期間，患兒一般會出現(xiàn)走路失穩(wěn)、容易跌倒情況，最終能夠累及患兒呼吸肌以及心肌，進(jìn)而導(dǎo)致患兒死亡。杜氏肌營養(yǎng)不良患兒中，男性患兒數(shù)量明顯多于女性患兒[1]。根據(jù)國外統(tǒng)計研究發(fā)現(xiàn)[2]，大約每5 000 個男孩中，有1 個男孩會發(fā)生杜氏肌營養(yǎng)不良癥。從遺傳角度來看，杜氏肌營養(yǎng)不良的主要致病基因在于Xp21，其中共包括79 個外顯子[3]。本研究選擇2019年2月—2022年6月收治的50 例兒童杜氏肌營養(yǎng)不良患兒，通過多重鏈接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA）對患兒作基因診斷，應(yīng)用Sanger 測序法對其診斷結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，分析患兒的臨床表現(xiàn)和該疾病的基因突變類型之間的關(guān)系，從而為患兒的早期診斷提供有力依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇湖北省麻城市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2019年2月—2022年6月收治的50 例兒童杜氏肌營養(yǎng)不良患兒。所有患兒經(jīng)過《杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良的臨床實(shí)踐指南》標(biāo)準(zhǔn)確診[4]。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒出現(xiàn)不明原因的血清肌酸激酶升高。（2）臨床表現(xiàn)主要包括運(yùn)動發(fā)育遲緩、能力較差。（3）存在Gowers 征（+）。（4）患兒小腿部的腓腸肌存在假性肥大反應(yīng)。（5）存在杜氏肌營養(yǎng)不良遺傳史。（6）通過肌電圖可確認(rèn)患兒出現(xiàn)肌源性損傷。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究前使用過激素或免疫抑制藥物。（2）合并免疫性疾病。（3）患有遺傳疾病。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA 的提取

采集患兒以及其父親、母親的外周血3 mL，將其置入EDTA-K2 抗凝管中，提取DNA 后，需要做基因檢測。

1.2.2 基因檢測

檢測步驟包括：（1）DNA 的提取方法：通過苯酚-氯仿法進(jìn)行提取，提取后，使用紫外分光光度計對DNA 的濃度進(jìn)行測定。（2）MLPA 技術(shù)的檢測方法：在通過MLPA擴(kuò)增后，應(yīng)用對應(yīng)試劑盒進(jìn)行檢測，按照說明書上的操作進(jìn)行變性、雜交、連接以及PCR 擴(kuò)增。（3）MLPA 的數(shù)據(jù)分析：將正常人群的DNA 作為參照組，通過對比，確認(rèn)目標(biāo)杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因是否發(fā)生突變反應(yīng)。（4）通過Sanger 測序法驗(yàn)證MLPA 的檢測結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）統(tǒng)計不同年齡段患兒的臨床表現(xiàn)，臨床表現(xiàn)內(nèi)容包括運(yùn)動落后、走路延遲；肌力降低；腓腸肌肥大；Gowers 征陽性；蹣跚步態(tài)、行走困難；肌電圖陽性。（2）統(tǒng)計患兒的血清酶檢測結(jié)果，包括乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase、ALT）、肌酸激酶（creatine kinase， CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）水平。（3）統(tǒng)計患兒的基因檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

本研究收集的50 例患兒均確認(rèn)為患有杜氏肌營養(yǎng)不良癥，其中47 例為男性患兒，3 例為女性患兒，患兒的就診年齡1 ～7 歲，平均（4.51±1.16）歲。早期發(fā)病的顯著性均不明顯，12 例患兒因?yàn)榻】禉z查中發(fā)現(xiàn)血清肌酸激酶水平明顯提升而受到重視，28 例患兒的運(yùn)動發(fā)育速度相對較慢，如出現(xiàn)步態(tài)異常、蹲起困難、上下樓的難度高；38 例患兒因?yàn)榇嬖谄渌膊?，通過住院檢查后發(fā)現(xiàn)其血清肌酸激酶水平明顯升高而受到重視。30 例患兒在通過體格檢查時，發(fā)現(xiàn)患兒的雙側(cè)下肢出現(xiàn)腓腸肌存在假性肥大反應(yīng)；8例患兒通過體格檢查后，發(fā)現(xiàn)患兒的肌力存在程度不同的減退，隨著患兒的病情不斷進(jìn)展，患兒的四肢端肌群產(chǎn)生了肌肉萎縮反應(yīng)。見表1。

表1 臨床表現(xiàn)（例）

2.2 血清酶檢測結(jié)果

患兒血清中的LDH、AST、ALT、CK 水平出現(xiàn)程度不同的升高反應(yīng)，其中血清CK 水平發(fā)生明顯升高。本研究中，患兒的CK 水平431 ～20 869 IU/L，與正常的CK 值比較，是其17 ～105 倍。見表2。

表2 血清酶檢測結(jié)果（U/L，n=50）

2.3 基因檢測

患兒通過杜氏肌營養(yǎng)不良基因檢測后發(fā)現(xiàn)，80.0%（40/50）患兒的外顯子發(fā)生缺失突變反應(yīng)，20.0%（10/50）患兒為重復(fù)性突變。所有患兒的MLPA 結(jié)果通過Sanger測序法進(jìn)行驗(yàn)證。女性患兒的監(jiān)測結(jié)果表示，外顯子18 ～37 發(fā)生缺失突變反應(yīng)。所有患兒的MLPA 基因檢測結(jié)果均經(jīng)過Sanger 測序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果為一致。

3 討論

杜氏肌營養(yǎng)不良患兒的早期發(fā)病相對隱匿，主要的發(fā)病人群為3 ～5 歲的小兒人群，早期發(fā)病后，患兒的動作相對笨拙，逐漸出現(xiàn)學(xué)步延遲、上下樓梯困難、蹲起困難、行走困難等情況。通過體格檢查后可以發(fā)現(xiàn)患兒的腓腸肌處于肥大狀態(tài)[4-5]。隨著患兒的病情不斷發(fā)展，等到患兒年齡增長到7 ～12 歲后，其行走能力會徹底喪失，等到了20 歲后，患兒會出現(xiàn)呼吸障礙、心力衰竭等嚴(yán)重性并發(fā)癥，最后導(dǎo)致其發(fā)生死亡[6]。杜氏肌營養(yǎng)不良患兒血清中的LDH、AST、ALT、CK 水平和正常指標(biāo)相比更高，并且其中CK 的升高幅度最高[7]。其原因可能在于：缺乏抗肌萎縮蛋白，肌肉細(xì)胞發(fā)生壞死，大量該類酶從血漿中溢出而引發(fā)的[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，患兒血清中的LDH、AST、ALT、CK 水平出現(xiàn)了程度不同的升高反應(yīng)，其中血清CK 水平發(fā)生了明顯升高。本研究中，患兒的CK 水平為431 ～20 869 IU/L，與正常的CK 值比較，是其17 ～105 倍。

常規(guī)的杜氏肌營養(yǎng)不良基因檢測，通過PCR 擴(kuò)增基因組中的單個外顯子，將其作為正常的等位基因，這不但消耗大量時間，且目標(biāo)DNA 的需求量更多，不能夠顯示超過所使用探針的缺失[9]。MLPA 技術(shù)能夠?qū)Χ鄠€基因位點(diǎn)進(jìn)行同時檢測，并且該技術(shù)的檢測成本較低，檢測靈敏度高，屬于國內(nèi)外杜氏肌營養(yǎng)不良患兒的首選基因檢測方法。MLPA 檢測計數(shù)的最明確的優(yōu)點(diǎn)就是可以重復(fù)性突變檢測杜氏肌營養(yǎng)不良的79 個外顯子，其也能夠?qū)ε詳y帶者進(jìn)行檢測，并且能夠?yàn)槠渌彝コ蓡T提供遺傳咨詢，并獲取相對準(zhǔn)確的遺傳信息。所有患兒均采取MLPA 技術(shù)進(jìn)行檢測，80.0%（40/50）患兒的外顯子發(fā)生缺失突變反應(yīng)，20.0%（10/50）患兒為重復(fù)性突變。所有的患兒的MLPA 結(jié)果通過Sanger 測序法進(jìn)行驗(yàn)證[10-11]。女性患兒的監(jiān)測結(jié)果表示，外顯子18 ～37發(fā)生缺失突變反應(yīng)。所有患兒的MLPA 基因檢測結(jié)果均經(jīng)過Sanger 測序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果為一致。但也有其他研究結(jié)果和本研究結(jié)果不同，其原因可能在于其他研究收集患兒的例數(shù)較少，且患兒所處地域各不相同[12]。MLPA 技術(shù)也具有一定局限性，主要在于該技術(shù)無法對點(diǎn)突變、小的缺失/ 重復(fù)性突變進(jìn)行有效識別。如對患兒高度懷疑其患有杜氏肌營養(yǎng)不良，而通過MLPA 技術(shù)檢測結(jié)果為陰性患兒，可以采取基因全序列分析技術(shù)對杜氏肌營養(yǎng)不良基因進(jìn)行檢測，確認(rèn)其是否發(fā)生小片段突變以及點(diǎn)突變[13]。

杜氏肌營養(yǎng)不良的主要發(fā)病人群為男性患兒，女性一般為突變基因的隱形攜帶者，臨床表現(xiàn)并不明顯。本研究收集的50 例患兒均確認(rèn)為患有杜氏肌營養(yǎng)不良癥，其中47 例為男性患兒，3 例為女性患兒，女性患兒的杜氏肌營養(yǎng)不良基因外顯子18 ～37 發(fā)生缺失，首發(fā)癥狀為雙側(cè)腿無力反應(yīng)。臨床中關(guān)于杜氏肌營養(yǎng)不良女性患兒的致病機(jī)制在于X 染色體發(fā)生失活。還有一項(xiàng)越南的研究結(jié)果表明[14]，1 例因?yàn)樾坌约に厥荏w發(fā)生基因突變，從而引發(fā)女性患兒出現(xiàn)男性假兩性畸形反應(yīng)。在存在臨床癥狀的女性肌營養(yǎng)不良攜帶者的研究中可以發(fā)現(xiàn)，X 染色體失活傾斜的程度和其表型的嚴(yán)重程度具有一定聯(lián)系，但X 染色失活是否和患兒的臨床癥狀嚴(yán)重程度具有一定關(guān)系尚未可知。目前臨床中關(guān)于女性杜氏肌營養(yǎng)不良患兒的研究文獻(xiàn)相對較少，且不同女性患兒之間存在的臨床表現(xiàn)具有較大的差異，一旦診斷不良，就會錯過最佳治療時機(jī)，影響了治療效果。

杜氏肌營養(yǎng)不良患兒的臨床表現(xiàn)和患兒的杜氏肌營養(yǎng)不良基因發(fā)生缺失是否存在聯(lián)系，其重點(diǎn)在于基因是否發(fā)生突變，突變后，是否能夠改變翻譯閱讀框架。大多數(shù)的突變導(dǎo)致閱讀框架受到破壞，主要是因?yàn)镈strophin 的蛋白質(zhì)發(fā)生丟失，從而導(dǎo)致患兒出現(xiàn)杜氏肌營養(yǎng)不良相關(guān)表現(xiàn)。若杜氏肌營養(yǎng)不良基因存在于閱讀框中發(fā)生基因突變，能夠形成截短并且存在一定額外功能的肌營養(yǎng)不良蛋白，導(dǎo)致患兒出現(xiàn)貝氏肌營養(yǎng)不良，該營養(yǎng)不良反應(yīng)的臨床癥狀程度相對溫和[15]。本研究中納入的患兒中有4 例患兒存在智力降低情況，患兒的語言發(fā)育慢，其原因在于患兒機(jī)體中的抗肌萎縮蛋白相關(guān)復(fù)合物等亞型遭受破壞而引發(fā)的。其中的Dpl40 以及Dp71 可以在患兒腦部的中樞神經(jīng)元中過高水平的表達(dá)。杜氏肌營養(yǎng)不良外顯子63 后發(fā)生突變的患兒，其神經(jīng)精神障礙發(fā)生率更高，并且患兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的程度、頻率和遠(yuǎn)端營養(yǎng)不良蛋白基因產(chǎn)婦的累積量具有密切聯(lián)系。發(fā)生杜氏肌營養(yǎng)不良的患兒，其發(fā)生注意力缺陷障礙以及孤獨(dú)癥等疾病的概率更高，給患兒的日常生活，甚至生命安全造成了極大的威脅。

對于杜氏肌營養(yǎng)不良患兒來說，第一，及時到醫(yī)院進(jìn)行檢查，并及時經(jīng)過治療，杜氏肌營養(yǎng)不良屬于隱性遺傳性疾病。因此，日常生活中，家長并沒有察覺到患兒是否患病，需到醫(yī)院進(jìn)行及時檢查，若有患病的趨勢，就需要及時采取有效方法進(jìn)行治療；第二，適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練，杜氏肌營養(yǎng)不良患兒會產(chǎn)生肌肉萎縮反應(yīng)，故適當(dāng)?shù)刈鲞\(yùn)動訓(xùn)練，可避免肌肉萎縮速度過快，若長期堅持，可增加肌肉的生長速度；第三，飲食需要忌口，此類患兒需要忌口的食物種類較多，如油膩性、生冷性、辛辣性以及刺激性的食物，以上食物對于患兒疾病的康復(fù)相對不利；第四，日常飲食需要保持清淡，同時還要攝入充足的營養(yǎng)，每天多食用蔬菜、水果、蛋類、魚類、豬肉，保證蛋白質(zhì)的攝入；第五，經(jīng)常輔導(dǎo)患兒，杜氏肌營養(yǎng)不良患兒會產(chǎn)生智力減退情況，因此，患兒的家屬需要輔導(dǎo)患兒，對患兒的術(shù)后康復(fù)相對有利；第六，保證愉快心情，大多數(shù)疾病的產(chǎn)生和負(fù)面情緒具有密切聯(lián)系，患兒長期處于過度緊張以及壓抑的狀態(tài)下，會產(chǎn)生較多其他疾病，因此，患兒盡可能保證每天心情愉悅。

目前，臨床中關(guān)于杜氏肌營養(yǎng)不良的治療，尚缺乏特效藥物以及特效療法，臨床中普遍采用糖皮質(zhì)激素類藥物對患兒進(jìn)行治療，可使其病情得到有效改善，同時和多種學(xué)科相結(jié)合，制訂綜合性護(hù)理干預(yù)。目前，杜氏肌營養(yǎng)不良臨床治療的重點(diǎn)在于從基因角度進(jìn)行治療，國外已經(jīng)逐漸采用兩種基因類藥物（ataluren、eteplirsen）治療患者，另外，還有多種藥物正在投入臨床試驗(yàn)中。大部分杜氏肌營養(yǎng)不良患兒在發(fā)病早期，其血清中的肌酸激酶水平會發(fā)生升高，故在臨床工作中，首診醫(yī)生應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注血清肌酸激酶水平明顯升高卻無其他原因可以解釋的患兒，并通過應(yīng)用MLPA 技術(shù)對患兒做對應(yīng)的基因檢測，及時做好診斷干預(yù)，使患兒的生存時間以及生存質(zhì)量顯著提升，并且可以對患兒家屬作遺傳咨詢，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，提升生育質(zhì)量，且本文研究結(jié)果為《杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良的臨床實(shí)踐指南》后期標(biāo)準(zhǔn)制定提供了借鑒內(nèi)容。

綜上所述，兒童杜氏肌營養(yǎng)不良通過基因診斷，其診斷價值高，可反映臨床分析情況，為臨床干預(yù)提供指導(dǎo)。