外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展和診療中的研究進展△

厲楊，馬愛玲，王麗娜，張黎明，張子騰

1濟寧醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，山東 濟寧 272067

2青海紅十字醫(yī)院胸外科，西寧 810000

濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院3醫(yī)學研究中心，4胸外科，山東 濟寧 272029

肺癌是最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率（11.4%）僅次于乳腺癌（11.7%）；同時，肺癌也是全球范圍內(nèi)病死率（18.0%）最高的腫瘤[1-2]。肺癌按照病理分型可以分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），后者又分為肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和大細胞肺癌（large cell lung carcinoma，LCC）[3]。肺癌的發(fā)病機制目前尚不明確，吸煙是引起肺癌的主要因素。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，木材燃燒產(chǎn)生的氣體、汽車尾氣、大氣污染對肺癌的發(fā)生也有一定的影響[4]。目前，手術(shù)治療聯(lián)合化療、分子靶向治療以及免疫治療在肺癌的治療中取得了一定成效。但由于肺癌進展迅速，多數(shù)患者診斷時已屬晚期，預(yù)后不良。因此，積極探究肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制尤為重要。

外泌體（exosome）是細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）的一種，是質(zhì)膜向內(nèi)出芽形成的細胞內(nèi)核內(nèi)體，后者逐步成熟，不斷在細胞內(nèi)聚集，形成多泡體（multivesicular body，MVB），隨后MVB與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物，或者與質(zhì)膜融合并釋放其中的膜結(jié)合物，后者就是外泌體[5-6]。幾乎所有的人體細胞都可以分泌外泌體，如紅細胞、淋巴細胞、神經(jīng)細胞、上皮細胞和腫瘤細胞等[7-9]。外泌體不止分布在血液中，也分布在腦脊液、淋巴液、滑膜液、羊水、腹腔積液等多種體液中[10]。外泌體的直徑一般為40～150 nm，包含了多種生物活性成分，如細胞代謝物、DNA 片段、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、多聚糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等[11]。外泌體有與細胞膜相似的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，可使其順利地與靶細胞結(jié)合，釋放相關(guān)生物活性成分，發(fā)揮相應(yīng)的生物學功能[12]。近年來的研究證實，外泌體可通過影響肺癌細胞的增殖、侵襲、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成以及耐藥等過程參與肺癌的發(fā)生發(fā)展[13]。此外，外泌體可作為生物標志物、藥物運載體以及腫瘤疫苗在肺癌的診療中發(fā)揮重要作用[14-15]。本文對外泌體參與肺癌發(fā)生發(fā)展的機制及其在肺癌診療中的潛在應(yīng)用進行綜述，以期為肺癌的臨床治療提供新的思路和方向。

1 外泌體與肺癌進展

近年來，大量研究證實外泌體與肺癌的進展有關(guān)。外泌體可以通過介導(dǎo)環(huán)狀RNA 液泡膜蛋白1（circular RNA vacuole membrane protein 1，circVMP1）作用于miRNA-524-5p，進而上調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase 3，METTL3）和SRY 盒轉(zhuǎn)錄因子2（SRY-box transcription factor 2，SOX2）的表達，最終促進NSCLC 的進展[16]。有報道稱，腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAF）來源的外泌體在肺癌的進展中起促進作用。CAF 分泌的外泌體可以通過其攜帶的lncRNA Opa 相互作用蛋白5 反義RNA1（Opa interacting protein 5 antisense RNA 1，OIP5-AS1）調(diào)節(jié)細胞中的miRNA-142-5p，進而抑制外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）對肺癌細胞的殺傷、吞噬作用，從而促進肺癌的進展[17]。相關(guān)文獻報道，鐵死亡是一種由磷脂過氧化驅(qū)動的調(diào)節(jié)細胞死亡的方式，此過程依賴鐵和活性氧（reactive oxygen species，ROS），細胞學上表現(xiàn)為線粒體嵴減少或消失、線粒體膜縮小和線粒體外膜破裂[18-19]。研究表明，鐵死亡與肺癌的進展密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中CAF 和間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）來源的外泌體可以抑制miRNA 或蛋白質(zhì)介導(dǎo)的鐵死亡，進而促進肺癌的進展[20]。

研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞自身分泌的外泌體在肺癌的進展中也具有重要作用。Morrissey 等[21]發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞來源的外泌體能夠通過促進炎性細胞因子分泌、中性粒細胞浸潤和髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）募集以及腫瘤新生血管生成促進腫瘤進展。有研究報道，CD8+T 細胞的腫瘤免疫功能可被NSCLC 分泌的外泌體中的環(huán)狀泛素特異性肽酶7（circular ubiquitin specific peptidase 7，circUSP7）抑制，后者能夠進入CD8+T 細胞中，通過靶向miRNA-934 上調(diào)含Src 同源2 結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP2）的表達，進而促進CD8+T 細胞凋亡，抑制CD8+T 細胞對腫瘤的免疫功能，從而促進肺癌的進展[22]。上述研究表明外泌體可通過遞送相關(guān)生物活性成分促進肺癌的進展。

2 外泌體與EMT

EMT是上皮細胞獲得間充質(zhì)細胞特征的過程[23]，在腫瘤中通過增強腫瘤細胞的移動性、侵襲性和對細胞凋亡程序的抵抗作用，促使腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。此外，EMT 來源的腫瘤細胞獲得相應(yīng)的干細胞特性，并表現(xiàn)出明顯的耐藥性[24]。

MSC 是TME 的組成部分，有助于腫瘤進展。腫瘤內(nèi)的缺氧環(huán)境可以影響腫瘤的實質(zhì)細胞和基質(zhì)細胞[25]。研究表明，缺氧環(huán)境可能重塑MSC，分泌富含miRNA-21-5p 的外泌體，將其遞送到腫瘤細胞和巨噬細胞，介導(dǎo)腫瘤細胞的存活和免疫抑制。缺氧環(huán)境中MSC 分泌的外泌體作用于TME，上調(diào)N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表達，從而促進NSCLC 細胞的EMT[26]。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）分泌的外泌體可被鄰近的肺癌細胞吸收并促進腫瘤細胞侵襲和EMT。同樣，缺氧條件下BMSC 來源的外泌體介導(dǎo)miRNA-193a-3p、miRNA-210-3p 和miRNA-5100 進行肺癌細胞間轉(zhuǎn)移，作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3），進而上調(diào)間充質(zhì)相關(guān)分子的表達，促進肺癌細胞的侵襲、遷移和EMT[25]。

研究表明，TME 中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumorassociated macrophage，TAM）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。TAM 分為M1 和M2 兩個亞型，M1型TAM 可以抑制NSCLC 的新生血管生成，具有抑制腫瘤的作用；而M2 型TAM 可激活NSCLC 細胞的EMT，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[27-28]。研究證明，M2型TAM 分泌的外泌體富含miRNA-155 和miRNA-196a-5p，可將其遞送至腫瘤細胞，進而下調(diào)Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員4（Ras association domain family member 4，RASSF4）的表達，促進NSCLC 細胞的EMT 和遷移[29]。以上研究表明，在肺癌的TME 中，多種細胞來源的外泌體可介導(dǎo)相關(guān)的細胞成分參與腫瘤細胞EMT，促進肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

3 外泌體與肺癌化療耐藥性

相關(guān)文獻報道，外泌體可以影響化療藥物對肺癌的療效，使肺癌對順鉑（cisplatin，DDP）、奧西替尼（osimertinib）、多西他賽（docetaxel，DTX）等化療藥物產(chǎn)生耐藥性。近年來，DDP 被證實可以通過促進鐵死亡和細胞凋亡影響NSCLC 的進展。相關(guān)研究證明，miRNA-4443 在DDP 耐藥的NSCLC 分泌的外泌體中高表達，通過外泌體的細胞間通信功能，將miRNA-4443 遞送至對DDP 敏感的腫瘤細胞，作用于METTL3/鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）介導(dǎo)的鐵死亡途徑，進而增強NSCLC 細胞對DDP 的耐藥性[30]。有研究顯示，DDP 耐藥的NSCLC 細胞分泌外泌體將circVMP1 傳遞給DDP 敏感的腫瘤細胞，通過miRNA-524-5p/METTL3/SOX2 軸促進NSCLC 細胞增殖、侵襲、遷移及對DDP 的耐藥，并抑制細胞凋亡[13]。還有研究報道，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)DDP 耐藥的NSCLC 細胞分泌外泌體，通過外泌體中的M1/2 型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M1/2，PKM2）促進腫瘤細胞糖酵解并產(chǎn)生還原性的代謝產(chǎn)物，后者可能與DDP 誘導(dǎo)的ROS 發(fā)生化學反應(yīng)，抑制DDP 對腫瘤細胞的作用。此外，低氧可以誘導(dǎo)外泌體PKM2 重組CAF，創(chuàng)造酸性TME，進而增強肺癌細胞的耐藥性[31]。

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以影響奧西替尼在肺癌中的化療作用。外泌體通過遞送野生型表皮生長因子受體（wild type epidermal growth factor receptor，wtEGFR）至表皮生長因子受體突變（epidermal growth factor receptor- mutated，mutEGFR）的NSCLC 細胞，促進其對奧西替尼耐藥。作用機制顯示，外泌體富含wtEGFR 蛋白，通過細胞間轉(zhuǎn)移作用于mutEGFR 的腫瘤細胞，激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3- hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）和促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路進而促進奧西替尼耐藥[32]。

研究表明，DTX 耐藥的LUAD 細胞可以分泌含有小核仁RNA 宿主基因7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）的外泌體，將其傳遞到敏感的LUAD 細胞中，招募人類抗原R（human antigen R，HuR）穩(wěn)定自噬相關(guān)基因5（autophagy related gene 5，ATG5）和自噬相關(guān)基因12（autophagy related gene 12，ATG12）進而促進自噬。此外，外泌體SNHG7通過招募支架蛋白4A（cullin 4A，CUL4A）誘導(dǎo)磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的泛素化，激活PI3K/AKT 信號通路，促進巨噬細胞M2 極化?？傊?，外泌體SNHG7 通過促進自噬和巨噬細胞M2 極化，增強LUAD 對DTX的耐藥性[33]。以上研究表明，外泌體可以通過遞送相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)促進肺癌細胞對化療藥物的耐藥，促進肺癌進展。

4 外泌體在肺癌診療中的潛在應(yīng)用

隨著研究的不斷進展，外泌體在肺癌中的作用越來越多地被報道，它不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用，在肺癌的診療中也有相當重要的作用。外泌體有望成為肺癌的潛在生物標志物，還可通過其細胞間通信功能以及物質(zhì)靶向遞送能力來制備藥物運載體及腫瘤疫苗，進一步治療肺癌。

外泌體廣泛分布于體液中，可從血液、尿液和唾液等體液中檢測出，這為外泌體作為肺癌的潛在生物標志物提供可能。外泌體的檢測方法有多種，如納米粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）、動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）等常規(guī)檢測技術(shù)以及表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）檢測、比色檢測、熒光成像、磁檢測和電化學檢測等基于微流控技術(shù)的檢測方法[34]。檢測血液中的外泌體是常規(guī)的檢測手段。血液檢測相比組織活檢等具有創(chuàng)傷小、易獲取和經(jīng)濟效益高等優(yōu)點。外泌體具有磷脂雙分子層，可在血液中穩(wěn)定存在，保護RNA、蛋白質(zhì)等內(nèi)容物免受各類酶的降解。外泌體相比循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）和循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）等腫瘤生物標志物具有在血液中穩(wěn)定存在和由活細胞分泌的優(yōu)勢，在血液檢測中有較高的檢出率，有更高的靈敏度和準確度[35]。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線是反映靈敏度和特異度之間關(guān)系的曲線，ROC 曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）可反映實驗預(yù)測的準確度，兩者均是反映診斷實驗真實性的重要指標。多項研究表明，在肺癌患者的血液中可檢測到外泌體中l(wèi)ncRNA、circRNA 等出現(xiàn)相應(yīng)的變化，lncRNA 遠端無同源盒6 反義RNA1（distal-less homeobox 6 antisense RNA 1，DLX6-AS1）和circRNA-002178 的表達增加；lncRNA 生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arrest-specific transcript 5，GAS5）的表達降低。lncRNA DLX6- AS1、lncRNA GAS5 和circRNA-002178 診斷肺癌的AUC 分別為0.806、0.857 和0.996；靈敏度分別為77.5%、85.9%和99.6%；特異度分別為85.9%、70.0%和100%。綜合以上數(shù)據(jù)表明，外泌體lncRNA DLX6-AS1、lncRNA GAS5 和circRNA-002178 對肺癌的診斷具有重要意義，有望成為診斷肺癌的潛在生物標志物[36-38]。

近年來，外泌體在藥物運載體和腫瘤疫苗的制備中取得了一定的突破。DTX 在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用，但是因水溶性低和對腫瘤的選擇性差在臨床治療腫瘤中受到了一定的限制。Wang 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，通過外泌體遞送DTX 對肺癌的治療效果明顯優(yōu)于直接應(yīng)用DTX，前者利用外泌體靶向遞送和易與細胞膜結(jié)合的特點將藥物更高效地遞送至腫瘤細胞，擾亂細胞周期，引起細胞代謝紊亂，促進細胞凋亡，實現(xiàn)抑制腫瘤生長的藥理作用。研究表明，外源性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）可以使用靶向外泌體作為運載體，并遞送到相關(guān)的靶細胞中發(fā)揮作用。外泌體可以作為siRNA 的高效運載體，使用外泌體運輸、遞送siRNA 可能是一種有效的治療肺癌的方法[40]。有研究顯示，TME 中含量最多的基質(zhì)細胞是CAF，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫抑制和耐藥性等方面具有重要作用。可以制備一種外泌體樣的腫瘤疫苗，同時靶向作用于腫瘤的實質(zhì)細胞和基質(zhì)細胞，即成纖維細胞活化蛋白基因工程腫瘤細胞源性外泌體樣囊泡疫苗（fibroblast activation protein gene-engineered tumor cell-derived exosome-like vesicle vaccine，eNVs-FAP）。在肺癌荷瘤鼠中進行的探究發(fā)現(xiàn)，eNVs-FAP 可促進樹突狀細胞（dendritic cell，DC）成熟，增加效應(yīng)T 細胞向腫瘤細胞和FAP 過表達的CAF 浸潤，降低TME 中免疫抑制細胞的比例，進而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[41]。以上研究表明，外泌體可以通過遞送細胞成分和細胞間通信功能抑制肺癌的進展，從而達到治療肺癌的目的。外泌體還可以作為藥物運載體和腫瘤疫苗為肺癌的治療提供新的方向。

5 小結(jié)與展望

目前，外泌體已不僅作為細胞代謝廢物的“垃圾袋”而存在，還被證實含有核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物活性成分，通過遞送蛋白質(zhì)等相關(guān)物質(zhì)實現(xiàn)細胞間通信的生物學功能[42-43]。CAF、肺癌細胞等分泌的外泌體可影響TME，促進腫瘤細胞的增殖、EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且促進肺癌對化療藥物耐藥。但是，目前的外泌體制備和提純方法還不成熟，存在較多問題，為研究帶來了不便；關(guān)于外泌體在肺癌等疾病中作用機制的研究相對表淺，還需進一步探究?；谀壳皣鴥?nèi)外的研究現(xiàn)狀，在未來一段時間，需繼續(xù)探究外泌體在肺癌中的生物學功能，進一步闡述其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，挖掘外泌體作為治療靶點在肺癌診療中的作用，及其作為藥物運載體、腫瘤疫苗和生物標志物在臨床中應(yīng)用的可能性，為肺癌的精準治療和個體化治療提供新的策略和方向。