基于BDNF-TrkB/proBDNF-p75NTR信號通路探討電針治療脊髓損傷的分子機制*

葉青,時素華,姚海江,胡煜,曹祖懋,李志剛

北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是指由于交通安全事故、跌落傷、暴力損傷等直接或間接因素導(dǎo)致的[1],在損傷的相應(yīng)節(jié)段出現(xiàn)的各種感覺、運動、括約肌功能等障礙,肌張力異常及病理反射等相應(yīng)改變[2]。世界衛(wèi)生組織2017年發(fā)布的報告顯示,每年大約新增25～50萬脊髓損傷患者,全世界大約有200～300萬人患有脊髓損傷相關(guān)殘疾[3]。脊髓損傷患者具有高致殘率和高死亡率的特點,并且康復(fù)期間并發(fā)癥發(fā)生率高[4-5]。劉俊等[6]對252例創(chuàng)傷性SCI患者的日均住院費用的影響因素進行研究,康復(fù)治療總住院費用最高424萬元,日均費用 287～4 473元。脊髓損傷給家庭和社會都造成了嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)[7],尋找更加有效、安全的治療手段迫在眉睫。

脊髓損傷機制主要分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[8]。其治療策略主要包括增強神經(jīng)保護,減少繼發(fā)性損傷以及通過激活神經(jīng)元再生能力、改善微環(huán)境等促進再生修復(fù)[9]。脊髓損傷后,神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors,NTFs)的缺乏是導(dǎo)致再生失敗的主要原因之一。神經(jīng)營養(yǎng)因子通常是通過軸漿運輸以受體介導(dǎo)的方式進入神經(jīng)末梢,以此來促進胞體有關(guān)蛋白質(zhì)的合成,神經(jīng)細胞的再生、發(fā)育和功能恢復(fù)[10]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3,NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5(neurotrophin-4/5,NT-4/5)是經(jīng)典的神經(jīng)營養(yǎng)因子,研究相對成熟。目前,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是實驗性脊髓損傷中研究最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子。BDNF是1982年Barde等[11]從豬腦中分離出的一種神經(jīng)元存活誘導(dǎo)因子。自被發(fā)現(xiàn)以來,其在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能及其在細胞和分子水平上的作用一直是深入研究的主題,且BDNF作為細胞存活和神經(jīng)突起生長促進劑在治療脊髓損傷中的潛力作用激發(fā)了人們的進一步探索的興趣[12]。前期研究發(fā)現(xiàn),電針治療脊髓損傷可以顯著提高BDNF、原肌球蛋白受體激酶B(tropomyosin-receptor kinase,TrkB)蛋白的表達,下調(diào)p75NTR蛋白的表達,相關(guān)理論探究如下。

1 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的三種亞型

BDNF主要作用于紅核脊髓束和紅核神經(jīng)元,在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中合成[13]。BDNF的3種亞型分別是:BDNF成熟體(Mature Brain-derived Neurotrophic Factor,mBDNF)、BDNF前體(Brain-derived Neurotrophic Factor Precursor,proBDNF) 和 BDNF前肽 (Pro-peptide of Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF pro-peptide)。BDNF經(jīng)歷一個轉(zhuǎn)錄合成、剪切和降解代謝的過程。最開始,通過激活轉(zhuǎn)錄因子啟動轉(zhuǎn)錄[14],這一過程包括神經(jīng)細胞調(diào)節(jié)活動、鈣離子通道等相關(guān)途徑,N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartic Acid NMDA)受體和電壓門控鈣離子通道促進Ca2+內(nèi)流啟動轉(zhuǎn)錄。BDNF基因轉(zhuǎn)錄為mRNA,BDNF mRNA進入胞漿,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的pro-pro-BDNF,然后通過去除信號肽將其轉(zhuǎn)化為pro-BDNF。proBDNF包含C端成熟結(jié)構(gòu)域及N端前結(jié)構(gòu)域,經(jīng)細胞內(nèi)蛋白酶和細胞外蛋白酶外切割N端前結(jié)構(gòu)域,產(chǎn)生mBDNF。此時水解剩下的部分前結(jié)構(gòu)域即為BDNF pro-peptide[15-17]。組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)激活組織纖溶酶原產(chǎn)生的纖溶酶,一些基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases,MMPs)均可細胞外裂解proBDNF產(chǎn)生[18]。這種切割發(fā)生在哪里、所涉及的蛋白酶的性質(zhì)仍然存在爭議[19]。目前,關(guān)于BDNF前肽在脊髓損傷中的相關(guān)生物學(xué)作用研究較少。但值得注意的是,有研究發(fā)現(xiàn),BDNF前肽直接促進海馬長時程抑制,并且BDNF多態(tài)性Val66Met在66個氨基酸處將纈氨酸取代成甲硫氨酸,影響B(tài)DNF前肽的生物活性,BDNF pro-peptide對BDNF的生物作用施加額外的功能改變的可能性[20]。mBDNF和proBDNF在脊髓損傷后發(fā)揮著相對立的作用。

2 BDNF-TrkB/proBDNF-p75NTR在脊髓損傷中不同的生物學(xué)效應(yīng)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,BDNF與proBDNF分別作用于不同的受體,在脊髓損傷中發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)[9]和其他神經(jīng)營養(yǎng)因子一樣,BDNF通過結(jié)合相應(yīng)受體來激活細胞內(nèi)多種下游信號通路在脊髓損傷中發(fā)揮作用。每種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白都有其特異性的高親和力原肌球蛋白受體激酶(tropomyosin receptor kinase,Trk)受體,也能與有較低親和力p75NTR受體結(jié)合、發(fā)揮特定的神經(jīng)保護等生物效應(yīng)[21-22]。酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor,TrkB)是BDNF的特異性受體,BDNF與TrkB特異性結(jié)合并具有高親和力,結(jié)合相互作用主要發(fā)生在TrkB受體的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig1和Ig2)[23-24]。BDNF誘導(dǎo)的TrkB信號可能通過四種主要的細胞內(nèi)途徑影響突觸可塑性、軸突生長、存活和細胞內(nèi)陽離子平衡[25-27]。(1)經(jīng)磷脂酰-3激酶(P1-3K)/Akt通路促進神經(jīng)元樹突分枝和樹突棘生成,影響突觸生長和結(jié)構(gòu)形成;(2)受體誘導(dǎo)小分子GTP酶Ras的激活,經(jīng)過一系列復(fù)雜的磷酸化過程,最終激活許多細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)途徑并對環(huán)腺苷3′,5′-單磷酸(adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate,cAMP)含量進行調(diào)節(jié),促進軸突生長;(3)經(jīng)磷脂酶C-γ(phospholipase C-γ,PLC-γ)/肌醇3-磷酸(Inositol triphosphate,IP-3)通路參與Ca2+的調(diào)控,促進Ca2+從細胞內(nèi)儲存釋放,促進突觸可塑性等[28];(4)通過N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體的磷酸化,TrkB信號可能導(dǎo)致鈣和鈉內(nèi)流的增加[29]。同樣,TrkB-PLC途徑的激活也可能導(dǎo)致鈣依賴的通道開放,從而進一步提高細胞內(nèi)鈣濃度以及鈉濃度,進而提高膜電位。BDNF最快的興奮性效應(yīng)已被證明與Nav1.9有關(guān),導(dǎo)致鈉內(nèi)流迅速,其時間尺度上類似于谷氨酸的作用,其效力遠遠超過神經(jīng)遞質(zhì)的效力[30]。除了BDNF的快速興奮作用,TrkB具有對受體氯離子通道的抑制能力,可通過下調(diào)氯化鉀共轉(zhuǎn)運蛋白KCC2,可以將細胞表面KCC2的損失顯著降低[31-32]。當(dāng)然,這些途徑不是完全分離的,并且在功能上可能重疊和互補[12]。

在沒有TrkB的情況下,BDNF與p75NTR結(jié)合的成熟神經(jīng)營養(yǎng)蛋白可以激活Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK),通過p53的激活觸發(fā)細胞死亡[33-34]。有研究顯示,在p75NTR介導(dǎo)的皮質(zhì)少突膠質(zhì)細胞死亡過程中,JNK激活以神經(jīng)生長因子依賴的方式起作用[35]。在交感神經(jīng)元中,p75NTR可以通過與BDNF結(jié)合,通過一種JNK非依賴性機制觸發(fā)促凋亡級聯(lián)反應(yīng)[36]。proBDNF可能有著和BDNF相反的生物學(xué)功能,與p75NTR高親和力結(jié)合,脊髓損傷后,proBDNF及其受體sortilin和p75NTR在脊髓中表達升高[37]。sortiLin受體結(jié)合proBDNF的N末端前結(jié)構(gòu)域[38],形成proBDNF/p75NRT/sortilin復(fù)合物觸發(fā)JNK相關(guān)通路、激活啟動caspase依賴的細胞凋亡誘導(dǎo)神經(jīng)元程序性死亡,破壞神經(jīng)可塑性,誘發(fā)神經(jīng)元凋亡,這種分子的上調(diào)可能發(fā)生在受傷狀態(tài)[39]。同時,proBDNF還可以激活RhoA依賴性信號通路,Rho是控制肌動蛋白聚合的關(guān)鍵分子,充當(dāng)神經(jīng)元生長的開關(guān),抑制軸突生長[12]。

綜上,p75NTR在BDNF在脊髓損傷的發(fā)展中有其雙面性,BDNF與TrkB的結(jié)合在許多方面受到p75NTR的影響。p75NTR可以通過影響受體來促進配體與Trk受體的結(jié)合,這可以增加TrkB的親和力并減少其他蛋白的結(jié)合[40-42]。p75NTR還可以促進BDNF的內(nèi)吞作用和向膜室的逆向轉(zhuǎn)運,在膜室中他們可以與TrkB受體相互作用,并可以減少Trk泛素化,這可以延遲受體的內(nèi)化和降解,從而允許更長的信號傳遞期[43-44]。此外,p75NTR可以激活A(yù)kt等促生存途徑,與Trk介導(dǎo)的神經(jīng)營養(yǎng)因子效應(yīng)協(xié)同作用[45]。但總的來說,p75NTR受體的激活更多的是對抗細胞存活和生長的方式運行,觸發(fā)幾個潛在的促凋亡級聯(lián)。p75NTR信號通路在細胞存活、細胞周期調(diào)節(jié)和突起外生長中起著重要作用。脊髓損傷后,p75NTR的表達增高,敲除p75NTR基因或阻斷p75NTR信號通路均可以促進細胞的存活、延緩病情的發(fā)生。在大多數(shù)情況下,p75NTR作為配體刺激的凋亡受體發(fā)揮作用誘導(dǎo)JNK-p53-Bax凋亡途徑:這一通路包括c-Jun的磷酸化、p53的激活、Bax線粒體易位、細胞色素C的釋放以及Caspase-3,6,9的激活等。在p75NTR介導(dǎo)的信號通路中,神經(jīng)酰胺作為脂質(zhì)第二信使分子[46-47],神經(jīng)酰胺的釋放能激活抑制神經(jīng)細胞生長、促進神經(jīng)元凋亡的JNK通路[21]。此外,p75NTR還可以調(diào)節(jié)其他細胞死亡的蛋白質(zhì)(如NRIF)的活性、NF-κB通路等[48]。因此,不同的生物學(xué)效應(yīng)可能由成熟BDNF或proBDNF的相對豐度,以及TrkB和p75NTR受體可用性的相互作用決定[34,49]。

3 電針治療脊髓損傷

脊髓損傷屬于中醫(yī)學(xué)“體墮”“痿痹”等范疇。電針治療脊髓損傷時,一般選取督脈電針或者夾脊電針,可以起到加強督脈經(jīng)氣感應(yīng),促進氣血運行,改善微環(huán)境的作用。針刺治療脊髓損傷的機理以神經(jīng)-體液為主要方向。其中,不可忽略的就是神經(jīng)遞質(zhì),其是由神經(jīng)末梢釋放,通過突觸間隙傳遞到下一個神經(jīng)元,再通過神經(jīng)-效應(yīng)器接點的間隙,作用于肌肉或腺體等效應(yīng)細胞。電針治療脊髓損傷一般采取疏密波的形式,以興奮效應(yīng)為主,具有促進代謝、調(diào)節(jié)氣血運行、消除炎癥水腫等作用。電針治療脊髓損傷的機制有以下幾種:(1)電針可以通過提高BDNF促進神經(jīng)元的存活。近幾十年來,BDNF在促進神經(jīng)元存活方面的潛力得到了廣泛的研究。脊髓損傷后,神經(jīng)元中促凋亡因子通常會上調(diào),TrkB信號可以通過磷脂酰-3激酶(P1-3K)/Akt通路抑制上調(diào)[50-51]。Hammond等[52]研究發(fā)現(xiàn),BDNF可促進體內(nèi)被軸突切除的成年大鼠皮質(zhì)脊髓神經(jīng)元的長期存活,該研究在軸突切開后第一周內(nèi)通過腦室注入BDNF 14 d,隨后28 d不進行治療,發(fā)現(xiàn)BDNF能夠促進CSN存活至少42 d。(2)電針可以通過提高BDNF促進受損纖維的再生。BDNF的神經(jīng)營養(yǎng)作用不只是促進神經(jīng)元的存活,還可以通過刺激GAP43和T-alpha-1-tubulin等再生相關(guān)基因的表達[53]、通過ERK增加第二信使cAMP的表達水平等途徑使軸突克服髓鞘抑制[54],促進受損纖維的再生。Blits等[55]將腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)BDNF基因AAV-BDNF轉(zhuǎn)染施萬細胞后移至脊髓損傷處,注射后16周,通過觀察接受編碼綠色熒光蛋白或鹽水的AAV載體,與對照組比較,注射AAV-BDNF的大鼠損傷部位軸突再生,后肢運動功能明顯改善。(3)電針可以通過提高BDNF促進神經(jīng)可塑性。BDNF可以幫助脊髓損傷后在不同生理水平上重新連接神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò),促進神經(jīng)的可塑性。研究已經(jīng)證明了軸突發(fā)芽和運動功能改善之間存在直接聯(lián)系,因此增強這些自發(fā)的重組也是當(dāng)前治療脊髓損傷的有效策略[56]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),BDNF可引導(dǎo)植入神經(jīng)元干細胞軸突向假定的靶標(biāo)生長,其將表達BDNF延髓的慢病毒載體注射到受傷區(qū)域會產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)蛋白梯度,并促進軸突的定向生長達 9 mm,與注射GFP慢病毒的對照動物相比,注射BDNF慢病毒(2.5 mm和5.0 mm)的動物顯示出明顯更多的軸突和更長的軸突,并且5.0 mm-BDNF組顯示出在延髓方向上延伸的偏好[57]。(4)電針可以通過提高BDNF促進髓鞘形成BDNF基因修飾的成纖維細胞,明顯增加少突膠質(zhì)細胞和施萬細胞的增殖,通過上調(diào)MBP的表達,抑制少突膠質(zhì)細胞的死亡來促進髓鞘的再生[58-59]。有學(xué)者觀察BDNF對脊髓損傷后少突膠質(zhì)細胞存活和功能恢復(fù)的影響,脊髓損傷大鼠24 h內(nèi)MBP表達在損傷后大大降低,但BDNF給藥2周后可促進MBP表達的恢復(fù),而MBP上調(diào)的促進可能與持久的恢復(fù)作用有關(guān)[60]。(5)電針可以通過提高BDNF水平在炎癥和繼發(fā)性損害中發(fā)揮作用。繼發(fā)性損傷是脊髓損傷后的重要病理過程,由許多過程組成,包括炎癥和活性氧的產(chǎn)生和釋放。Wong等[61]研究發(fā)現(xiàn),ProBDNF和成熟的BDNF在體外從巨噬細胞釋放。體內(nèi)巨噬細胞(ED1+)和體外分離巨噬細胞(CD11b+)表達中等水平的proBDNF,sortilin和p75NTR。ProBDNF抑制了體外分離的巨噬細胞的遷移,而針對proBDNF的抗體則增強了遷移。對BDNF的前結(jié)構(gòu)域施用抗血清來抑制proBDNF,可增加巨噬細胞的浸潤并增加受傷的脊髓中神經(jīng)元的數(shù)量。針對proBDNF的抗體治療可改善脊髓損傷后的功能恢復(fù)。這表明,proBDNF是巨噬細胞遷移和浸潤的抑制因子,說明內(nèi)源性proBDNF可能抑制脊髓損傷后ED1+炎癥細胞的浸潤。

4 小結(jié)

綜上所述,電針治療脊髓損傷具有簡、便、驗、廉的優(yōu)勢,既可以與其他藥物、康復(fù)療法及手術(shù)治療配合使用,也因為其無不良反應(yīng)的特點,在脊髓損傷后,可作為長期治療的手段。電針治療脊髓損傷,可使BDNF與TrkB高親和力結(jié)合,促進脊髓損傷的修復(fù)。ProBDNF與p75NTR高親和力結(jié)合,介導(dǎo)細胞凋亡機制。電針治療脊髓損傷的機制十分復(fù)雜,是當(dāng)前急需解決的問題。在前期研究的基礎(chǔ)上,筆者認為,電針可以通過激活BDNF-TrkB信號通路,抑制proBDNF-p75NTR信號通路來實現(xiàn)對神經(jīng)的再生修復(fù)。本理論的提出將為電針治療脊髓損傷再生修復(fù)機制提供新思路,為臨床電針治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。