蒜和蔥上二斑葉螨的發(fā)生為害及其抗藥性監(jiān)測

田甜　張妍　張友軍等

關(guān)鍵詞 二斑葉螨；百合科蔬菜；抗性監(jiān)測；靶標(biāo)基因；突變頻率

中圖分類號：S 436.33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022447

二斑葉螨Tetranychus urticae Koch屬真螨目葉螨科，是世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的重要農(nóng)業(yè)害螨，其取食寄主植物汁液后，在取食處首先造成極小的褪綠斑點(diǎn)，嚴(yán)重時導(dǎo)致葉片發(fā)黃，甚至干枯脫落[1]，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。二斑葉螨防控主要依賴于化學(xué)藥劑，其生活史短、世代重疊、可孤雌生殖、繁殖力強(qiáng)等生物學(xué)特性導(dǎo)致其對化學(xué)藥劑的抗性發(fā)展迅速[2]。在全球?qū)r(nóng)作物造成重大經(jīng)濟(jì)損失的抗性害蟲／害螨中，二斑葉螨排名第五位[3]，在歐洲、澳大利亞、土耳其、加拿大、中國均有二斑葉螨抗藥性的報道[4-9]，這給該螨的綜合治理帶來極大挑戰(zhàn)。

二斑葉螨寄主植物極其廣泛，可為害包括茄科、豆科、葫蘆科、傘形科等在內(nèi)的至少1100種不同作物[10]，由于其個體微小且遷移能力弱等特性，致使其對寄主植物的選擇性較弱而適應(yīng)性較強(qiáng)[11-12]。前期研究表明，寄主植物的次生代謝產(chǎn)物可能會影響取食植物的害蟲／害螨體內(nèi)的解毒酶含量、活性等指標(biāo)[13-14]，也直接影響害蟲／害螨對寄主植物的取食適合性和嗜好性，如長期飼養(yǎng)在夾竹桃上的二斑葉螨，可在番茄上取食，但長期取食番茄的二斑葉螨，卻不能在夾竹桃上存活[15]。蒜和蔥為百合科蔬菜作物，據(jù)報道也屬于二斑葉螨的寄主植物，但與蘋果、花生、女貞、大葉黃楊、馬鈴薯等植物葉片相比，二斑葉螨對蒜葉片的選擇率很低[16]；田間不同比例地間作蒜對于二斑葉螨及其同屬的截形葉螨T.truncatus種群具有明顯抑制作用[17-19]。且在實際生產(chǎn)中，二斑葉螨在蔥、蒜等百合科蔬菜上發(fā)生為害的情況也極為罕見且鮮有報道，說明二斑葉螨雖然可以為害蒜，但蒜并非其很常見的嗜好寄主植物。

2022年春季筆者在北京海淀區(qū)蔬菜溫室內(nèi)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，二斑葉螨在百合科蔬菜蒜和蔥上呈現(xiàn)嚴(yán)重的為害癥狀。為探明二斑葉螨在這兩種百合科蔬菜上的抗藥性狀況，本研究首先調(diào)查了二斑葉螨在蒜和蔥上的種群數(shù)量，監(jiān)測了這2個種群對不同藥劑的抗性，并對其常用化學(xué)藥劑的抗性相關(guān)基因突變頻率進(jìn)行研究，以期為指導(dǎo)二斑葉螨在百合科蔬菜上的化學(xué)防控提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1二斑葉螨種群

二斑葉螨實驗室種群來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所捕食螨研究課題組，于室內(nèi)菜豆無蟲苗上飼養(yǎng)超過10年，期間未使用任何農(nóng)藥，飼養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，相對濕度（60±5）%，光周期L∥D=16 h∥8h。二斑葉螨田間種群于2022年4月采集于北京海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔬菜試驗溫室，采集的雌成螨直接用于本試驗。

1.2試驗藥劑

所用藥劑均為商品制劑，其含量、劑型及來源如下。1.8%阿維菌素乳油（EC），河北威遠(yuǎn)生化農(nóng)藥有限公司；43%聯(lián)苯肼酯懸浮劑（SC），麥德爾美（上海）化工有限公司；240 glL蟲螨腈懸浮劑（SC），巴斯夫（中國）有限公司；30%腈吡螨酯懸浮劑（SC），日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)有限公司；15%噠螨靈乳油（EC），浙江永農(nóng)生物科學(xué)有限公司。

1.3二斑葉螨種群數(shù)量調(diào)查

所調(diào)查溫室面積大約330m，溫室內(nèi)蔥Alliumfistulosum L.和蒜A.sativum L.混合栽種，種植時間為2021年10月底，調(diào)查時間為2022年4月上旬，當(dāng)時二者均處于生長中后期，周邊種植有韭菜、油菜等其他蔬菜。對2種寄主植物進(jìn)行隨機(jī)抽樣調(diào)查其植株上二斑葉螨數(shù)量，分別調(diào)查記錄1次。每個寄主調(diào)查10株，重復(fù)4次，共計調(diào)查40株。記錄每株上二斑葉螨的成螨數(shù)量。

1.4二斑葉螨抗藥性測定

采用浸葉法對上述2個二斑葉螨田間種群進(jìn)行抗藥性監(jiān)測[20]。將0.1%的瓊脂加入到直徑3.5 cm的塑料皿底部，冷卻凝固后待用。用蒸餾水將每種測試藥劑稀釋成5～7個濃度。將新鮮干凈的菜豆葉片修剪為直徑2.0 cm的小葉碟，將葉碟浸入待測藥液中10 s后取出，室溫晾干后，將葉碟的葉背向上平整鋪在凝固的瓊脂上，按濃度從低到高的順序重復(fù)上述操作，每處理不少于4次重復(fù)。用零號毛筆挑取活躍的、狀態(tài)一致的雌成螨25～30頭于每個葉碟上，然后蓋上有10個極細(xì)微小孔的培養(yǎng)皿上蓋（采用加熱后的昆蟲針制作），再轉(zhuǎn)移至溫度（26±1）℃、相對濕度（60±5）%、光照周期L∥D=16 h∥8h的人工氣候箱中飼養(yǎng)和觀察。24 h后在體視顯微鏡（SZX-7，奧林巴斯）下檢查記錄測試葉螨的死亡數(shù)及存活數(shù)，用毛筆尖輕輕觸碰螨體，僅有1只足活動或者完全不動者判為死亡[20]。

1.5二斑葉螨DNA提取及抗性基因突變檢測

利用基因組DNA提取試劑盒（KAPA）提取單頭二斑葉螨的基因組DNA，具體操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。在1.5mL離心管中加入30μL提取液（0.5μL1 U／μL的提取酶，3.0μL 1U/μL緩沖液和26.5μL ddHO），用昆蟲針小心挑取一頭雌成螨放入離心管中，使用塑料研磨杵進(jìn)行充分研磨后將其放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)置為：75℃10 min，95℃5 min。提取后的DNA樣本于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

對上述2個種群的二斑葉螨單頭DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測阿維菌素抗性基因谷氨酸氯離子通道（glutamate-gated chloride channel，GluCl）的G314D和G324E位點(diǎn)、噠螨靈抗性相關(guān)的線粒體電子傳遞復(fù)合物Ⅰ的PSST亞基上突變位點(diǎn)H92R位點(diǎn)和聯(lián)苯肼酯抗藥性相關(guān)基因細(xì)胞色素b（cyto-chrome b，Cytb）突變位點(diǎn)G126S的突變頻率。每個種群每個位點(diǎn)至少檢測30個樣本。突變位點(diǎn)的頻率檢測所用特異性引物參考已發(fā)表文獻(xiàn)[21]，詳見表1。PCR擴(kuò)增體系：DNA 2.0μL，上、下游引物各1.25μL（10mmol／L），dNTPs 0.5μL，5×Q5反應(yīng)緩沖液5μL，5×Q5 High GC Enhancer 5μL，Q5高保真聚合酶0.25μL，ddHO 9.75μL。PCR擴(kuò)增在S1000熱循環(huán)儀（Bio-Rad，CA，USA）中進(jìn)行，反應(yīng)程序如下：98℃變性30s；98℃10s，56.5～59.0℃20 s，72℃ 20 s，35個循環(huán)；72℃延伸2 min。獲得PCR產(chǎn)物純化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司使用特異性引物進(jìn)行雙向測序。

1.6數(shù)據(jù)分析

采用Polo Plus 2.0軟件對二斑葉螨抗性測定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到斜率±標(biāo)準(zhǔn)誤、致死中濃度LC、95%置信區(qū)間、卡方值及自由度。敏感種群的LC來自本實驗室最近發(fā)表的數(shù)據(jù)[9]。抗性倍數(shù)一田間種群的LC值／室內(nèi)敏感種群的LC值?？剐运降脑u價參照以往文獻(xiàn)中描述的分級標(biāo)準(zhǔn)[9]：敏感（RF≤3）、低水平抗性（31000）?？剐缘任换虻念l率按以下公式計算：點(diǎn)突變的基因突變頻率=[抗性純合子個體數(shù)／檢測總數(shù)十抗性雜合子個體數(shù)／（檢測總數(shù)×2）]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1蒜和蔥上二斑葉螨種群數(shù)量

混栽的2種百合科蔬菜蒜和蔥受二斑葉螨為害癥狀明顯（圖1b和圖1c），調(diào)查時蒜葉片數(shù)量為7.40片／株，蔥葉管數(shù)量平均為8.40片／株，對2種寄主植物上二斑葉螨發(fā)生數(shù)量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蒜上種群數(shù)量為99.35頭／株，蔥上為253.00頭／株，蔥上二斑葉螨單株平均數(shù)量是蒜單株數(shù)量的2.55倍，差異顯著（圖1a）。

2.2二斑葉螨2個種群對化學(xué)藥劑的抗性

監(jiān)測了蒜和蔥上2個二斑葉螨種群對不同藥劑的抗性，結(jié)果見表2。蒜二斑葉螨和蔥二斑葉螨種群對所測試藥劑的抗性存在不同程度的差異。二斑葉螨蒜種群和蔥種群對阿維菌素均呈現(xiàn)極高水平抗性（抗性倍數(shù)RF分別為10686.3倍和10259.6倍）；對聯(lián)苯肼酯抗性分別為72.3倍和35.7倍，均呈現(xiàn)中等水平抗性；對腈吡螨酯分別呈現(xiàn)高水平抗性（RF=207.1倍）和中等水平抗性（RF=52.2倍）；對蟲螨腈均為高水平抗性（RF分別為170.0倍和185.8倍）。2個種群對噠螨靈的抗性測定中，噠螨靈濃度高達(dá)5000 mg/L時，測試種群死亡率仍低于50%，說明對噠螨靈抗性倍數(shù)至少為中等抗性水平以上。

從致死中濃度LC來看，阿維菌素、聯(lián)苯肼酯和腈吡螨酯這3種藥劑對二斑葉螨蒜種群的LC值均高于蔥種群，其中阿維菌素和聯(lián)苯肼酯對2個種群的毒力活性差異不顯著，而腈吡螨酯對2個種群的毒力活性差異顯著。噠螨靈對測試二斑葉螨種群的毒力活性極低（表2）。

2.3二斑葉螨2個種群的抗性基因突變檢測

針對使用歷史較長的2種藥劑阿維菌素、噠螨靈和新型藥劑聯(lián)苯肼酯，檢測其抗性相關(guān)基因的突變頻率。2個二斑葉螨田間種群中與阿維菌素抗性相關(guān)的GluCl1上的G314D位點(diǎn)和GluC13上的G326E位點(diǎn)的突變頻率均為100%，與噠螨靈抗藥性相關(guān)的PSST亞基上的突變位點(diǎn)H92R在2個測試種群中的突變頻率也均為100%，表明這2個種群中上述靶標(biāo)基因均為純合抗性。對于可能參與聯(lián)苯肼酯抗藥性相關(guān)基因Cytb上的G126S位點(diǎn)來說，二斑葉螨蒜種群上該位點(diǎn)突變頻率為9.09%，蔥種群則為24.14%，主要以雜合子形式存在（表3）。

3結(jié)論與討論

二斑葉螨寄主范圍極廣，百合科作物雖然也列為其寄主，但田間發(fā)生為害的報道極少，僅在珠芽百合Lilium bulbierum和筋骨草Tulipa turkestani-ca上有過相關(guān)報道[22]，而取食蒜和蔥等百合科蔬菜作物并造成嚴(yán)重為害的情況在以往未見報道。之前研究發(fā)現(xiàn)，二斑葉螨對眾多寄主植物及品種也存在明顯的選擇性[23]，本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的蒜、蔥受到二斑葉螨嚴(yán)重為害，單株葉螨數(shù)量可高達(dá)99.35～253.00頭，這在實際生產(chǎn)中并不常見，推測蒜和蔥不同品種可能與二斑葉螨的發(fā)生相關(guān)，這值得進(jìn)一步關(guān)注；同時也需要指出，本文并未采用蒜和蔥單位葉面積上的葉螨種群數(shù)量來進(jìn)行更精準(zhǔn)的對比，且本研究調(diào)查時蔥的葉管數(shù)量也略多于蒜葉片數(shù)量，但這并非是導(dǎo)致蔥上二斑葉螨種群數(shù)量高于蒜上種群數(shù)量的主要原因，而寄主植物種類／品種對于葉螨取食的適合性可能是造成這種差異的最關(guān)鍵因子。二斑葉螨作為全球范圍內(nèi)為害嚴(yán)重的多食性害蟲，其快速適應(yīng)寄主的能力且伴隨的低適合度代價引起了廣泛關(guān)注[24]，對其取食選擇機(jī)制尚不清楚，還需要更多研究。

本研究中，來自北京海淀區(qū)溫室內(nèi)種植的蒜和蔥上的二斑葉螨種群對阿維菌素呈現(xiàn)極高水平的抗性，抗性倍數(shù)超過10000倍，這與以往研究中二斑葉螨的高抗性監(jiān)測結(jié)果是一致的[9，20-21]。阿維菌素是一種廣譜性殺蟲殺螨劑，在我國使用廣泛，查閱中國農(nóng)藥信息網(wǎng)，阿維菌素已登記1499條，遠(yuǎn)高于其他殺螨劑，如噠螨靈（328條）、蟲螨腈（202條）、腈吡螨酯（2條）、聯(lián)苯肼酯（59條）等。其中，阿維菌素防控二斑葉螨效果下降的案例常見[25]，田間長期的選擇壓導(dǎo)致二斑葉螨對阿維菌素的抗藥性持續(xù)穩(wěn)定，這也可能與較高的抗性靶標(biāo)基因突變頻率有關(guān)。二斑葉螨GluCl1上的G314D位點(diǎn)和GluCl3上的G326E被報道與阿維菌素抗性有關(guān)[26-27]，本研究中發(fā)現(xiàn)，二斑葉螨蒜和蔥2個種群中與阿維菌素抗藥性相關(guān)的G314D和G326E位點(diǎn)的突變頻率均達(dá)到100%，為純合抗性種群，說明靶標(biāo)抗性可能是該種群對阿維菌素的主要抗性機(jī)制，化學(xué)防控更加困難。我們也注意到，測試的2個種群中抗性突變頻率高于北京同一區(qū)域內(nèi)油菜、辣椒等其他蔬菜作物上的二斑葉螨的突變頻率[9]，這也從一個側(cè)面解釋了二斑葉螨種群對阿維菌素抗性居高不下的原因。以往研究表明，截形葉螨對阿維菌素敏感度高[28]，而阿維菌素對截形葉螨的田間防效也表現(xiàn)優(yōu)[29]，但該藥劑對二斑葉螨完全無效，因此，加強(qiáng)葉螨防控中依據(jù)其種類進(jìn)行針對性科學(xué)選藥的宣傳普及極為重要。

本研究所測試的2個二斑葉螨種群對傳統(tǒng)殺螨劑噠螨靈的LC值大于5000 mg/L，這與近期剛報道的我國其他地區(qū)二斑葉螨種群對噠螨靈的抗性結(jié)果相似[21]；同時，噠螨靈抗藥性相關(guān)位點(diǎn)H92R突變頻率在本研究及以往檢測中均達(dá)到100%，亦為純合抗性種群，綜合本研究結(jié)果以及近年來對于我國各地區(qū)的二斑葉螨抗藥性監(jiān)測結(jié)果，噠螨靈單劑在田間使用時對二斑葉螨的防效也將遠(yuǎn)低于預(yù)期效果，需要謹(jǐn)慎選用。然而，該藥劑與其他藥劑的復(fù)配劑是否可以起到協(xié)同增效作用尚不清楚，需要進(jìn)一步研究，以期延長殺螨劑的使用壽命。

本研究中所測試的蒜和蔥2個二斑葉螨種群對除腈吡螨酯外的4種測試藥劑的敏感性差異不大，這可能與同一種植區(qū)域內(nèi)統(tǒng)一施藥管理及葉螨在2種寄主植物間存在不同程度的遷移有關(guān)。蒜和蔥上二斑葉螨對聯(lián)苯肼酯、蟲螨腈和腈吡螨酯這3種新型藥劑的抗藥性為中等到高水平抗性，明顯比前期本實驗室測定的海淀二斑葉螨油菜種群抗性程度高（北京海淀種群2020年對這3種藥劑均呈低抗性水平）[9]，說明二斑葉螨對新型殺螨劑的抗性還在進(jìn)一步發(fā)展，其化學(xué)防控中亟須關(guān)注輪換施藥及采用增效藥劑組合進(jìn)行防控。同時，在本研究的測試結(jié)果中，同一區(qū)域內(nèi)，百合科作物蒜和蔥2個二斑葉螨種群對腈吡螨酯的藥劑敏感度差異顯著，是否存在因寄主植物不同而影響了二斑葉螨的藥劑敏感度尚不確定，其內(nèi)在機(jī)制值得關(guān)注。

之前研究報道二斑葉螨Cytb基因上的G12 6S位點(diǎn)突變與其對聯(lián)苯肼酯產(chǎn)生抗藥性有關(guān)[10，30-31]，本研究中二斑葉螨蒜種群中G126S位點(diǎn)突變頻率為9.09%，明顯低于二斑葉螨蔥種群的突變頻率24.14%，而蒜種群對聯(lián)苯肼酯的抗性水平卻高于蔥種群對聯(lián)苯肼酯的抗性，這與以往研究結(jié)果類似[9]，單獨(dú)G126S突變不會影響二斑葉螨對聯(lián)苯肼酯的抗藥性，與I126T或S141F共同作用時才可能會影響其對聯(lián)苯肼酯的抗藥性[32]，而本研究的2個種群中并未發(fā)現(xiàn)其他突變位點(diǎn)。基于以往研究，二斑葉螨對聯(lián)苯肼酯也進(jìn)化出了較為復(fù)雜的抗性機(jī)制，因此田間選用聯(lián)苯肼酯防治二斑葉螨時，也需要更加科學(xué)地輪換施藥。近期研究結(jié)果表明，田間二斑葉螨對聯(lián)苯肼酯、腈吡螨酯等的抗性為低抗到中抗水平[9，21]，但本研究中測試種群的抗藥性明顯上升；雖然聯(lián)苯肼酯、腈吡螨酯制劑仍對多地的二斑葉螨種群防效優(yōu)良[33-34]，然而，在二斑葉螨的防控中，要特別關(guān)注科學(xué)輪換用藥及綜合防治，延緩二斑葉螨對這些高效藥劑的抗性發(fā)展速度。