白及銹病的病原鑒定及其田間防治藥劑篩選

徐明癑　江健偉　劉艮森等

關(guān)鍵詞 白及；銹?。籆oleosporium bletiae；病原鑒定；藥劑防治

中圖分類號(hào)：S 435.672 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2022211

白及Bletilla striata是多年生蘭科白及屬植物，廣泛分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)和緬甸。在我國(guó)，現(xiàn)多分布于湖北、貴州、廣西、四川、云南等地[1]。白及是我國(guó)傳統(tǒng)蘭科藥材之-[2]，其藥用部分主要是富含白及多糖膠的地下假鱗莖。白及多糖膠具有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌之功效，常用于治療消化道黏膜損傷、潰瘍、出血、擦傷和燒傷、皮膚皸裂等[3-5]。由于白及具有較高的藥用、觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)其需求量不斷增大，愈來愈多的野生資源被廣泛掠奪。因其繁殖能力較低，生長(zhǎng)速度緩慢，導(dǎo)致我國(guó)野生白及急劇減少，瀕臨滅絕，現(xiàn)已被《中國(guó)植物紅皮書——稀有瀕危植物》收錄，同時(shí)也被寫入了《瀕危野生動(dòng)植物國(guó)際貿(mào)易公約》保護(hù)種類[6-7]。

近年來，隨著白及需求量增加，價(jià)格迅速上漲，大規(guī)模人工種植的白及越來越多[8]。而由于栽培管理措施、田間小氣候等因素的影響，白及病害種類、分布、發(fā)生面積增加，危害逐年加重。已報(bào)道的病害有：由Fusarium commune、F.asiaticum、F.ipomoe-ae、F.solani和Epicoccum sorghinum侵染引起的白及葉斑病[9-13]；Colletotrichum orchidophilum和C.fruc-ticola引起的炭疽病[14-15]3；Sclerotium rol fsii引起的白絹病[16]；Phytophthora nicotianae引起的疫病[17]；由Dactylonectria torresensis引起的根腐病和F.fujikuroi引起的莖腐病[18-19]；Coleosporiumbletiae引起的白及銹病[20]等。

白及銹病具有傳播性強(qiáng)、不易防治的特點(diǎn)，其在湖北地區(qū)于每年4月中旬開始發(fā)生，一直可以持續(xù)至11月上旬，特別是5月-8月是銹病的大暴發(fā)時(shí)期。然而，自發(fā)現(xiàn)白及銹病以來，其病原體特征尚未被清楚地描述，其有效防治藥劑鮮見報(bào)道，這可能也是導(dǎo)致該病未能很好防治的主要原因。

2018年6月，白及銹病在華中地區(qū)，特別是湖北省的多個(gè)白及種植區(qū)大面積發(fā)生，發(fā)病率超過50%，有的種植區(qū)甚至達(dá)到90%。本研究從2018年6月起在湖北省恩施州來鳳縣白及種植區(qū)進(jìn)行白及銹病調(diào)查，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)其病原進(jìn)行研究，同時(shí)選擇5種藥劑對(duì)該病進(jìn)行田間防治試驗(yàn)。

1材料與方法

1.1樣品采集

2018年—2019年，在湖北省恩施州來鳳縣白及種植區(qū)（29°58′N，109°40′E，海拔558m）調(diào)查白及銹病發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)銹病發(fā)病率普遍高于80%。分別于2018年6月和2019年10月采集帶有明顯病征的白及銹病病株和病葉樣品，放人無菌的牛皮紙袋中保存并編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行顯微觀察。并分別收集其夏孢子和冬孢子堆，放置于干燥的無菌離心管中，4℃保存?zhèn)溆?。為方便描述，將本研究白及銹病病原編號(hào)為BSC1。

1.2致病性測(cè)定

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康2年生白及植株移栽于塑料育苗盆中，每盆4株，使用PE手套摩擦白及葉片上下表面，擦掉蠟質(zhì)層。隨后將收集的夏孢子配制成孢子懸浮液（105個(gè)/mL），每株噴灑10 mL孢子懸浮液，對(duì)照噴灑等量無菌水，每個(gè)處理2盆。所有接種后的植株放置于自然環(huán)境（白天約30℃，夜晚約15℃，相對(duì)濕度80%～100%）中。每天觀察，45 d后拍照記錄發(fā)病情況。根據(jù)病菌的顯微形態(tài)對(duì)發(fā)病葉片上的病原再鑒定，進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.3形態(tài)學(xué)觀察

取具有典型病征的樣本，在連續(xù)變倍體視顯微鏡（南京永新光學(xué)有限公司，NS2-608T，中國(guó)）下對(duì)其冬孢子堆進(jìn)行徒手切片，并用無菌針挑取病原菌的夏孢子和冬孢子，以無菌水作為浮載劑在顯微鏡（Nikon，DS-Ri2，日本）下觀察并測(cè)量其大小。

1.4分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

取銹病病原（ BSCl）的夏孢子約200 mg，置于1.5mL無菌離心管中，采用改良CTAB法提取其基因組總DNA[21]。利用核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（in-ternal transcribed spacer，ITS）和核糖體大亞基（large subunit，LSU）基因序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物委托武漢華大基因科技有限公司合成，序列見表1。

PCR反應(yīng)體系（50μL）：DNA模板3μL，2×SuperStar Omni PCR Master Mix（Genestar，中國(guó)）25μL，正、反向引物（10μmol／L）各2μL，ddHO補(bǔ)足至50μL。ITS和LSU基因的PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性45 s，55℃退火45s，72℃延伸30s，共34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送武漢華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。所獲得的序列經(jīng)DNAstar峰圖校正后，利用GenBank數(shù)據(jù)庫的BLASTn工具進(jìn)行同源性比對(duì)，并選擇下載相應(yīng)參考序列。使用在線多序列比對(duì)工具M(jìn)AFFT[24]（http：∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）分別對(duì)ITS和LSU序列進(jìn)行多序列比對(duì)，隨后經(jīng)修剪和拼接ITS和LSU序列，并在MEGA7.0中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行建樹模型評(píng)估選擇，進(jìn)化樹采用自展法（ bootstrap）進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，1000次循環(huán)。

1.5田間防治藥劑篩選

供試藥劑：10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（WG），先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司；15%三唑酮可濕性粉劑（WP），江蘇七洲綠色化工股份有限公司；250 g/L吡唑醚菌酯乳油（EC），巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司；12%萎銹靈可濕性粉劑（WP），陜西恒田生物農(nóng)業(yè)有限公司；80%代森錳鋅可濕性粉劑（WP），美國(guó)陶氏益農(nóng)公司。

試驗(yàn)地點(diǎn)為湖北省來鳳縣白及人工種植基地。試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理：1）10%苯醚甲環(huán)唑WG60g／hm（有效成分用量，下同）；2）15%三唑酮WP180 g／hm；3） 250g/L吡唑醚菌酯EC 180g／hm；4） 12%萎銹靈WP 108 g／hm；5）80%代森錳鋅WP 1200 g／hm；6）清水對(duì)照。每處理重復(fù)3次，共18個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積30 m，隨機(jī)區(qū)組排列。試驗(yàn)于2020年4月25日至5月16日進(jìn)行，共施藥3次，每次間隔7d。施藥時(shí)，按照常規(guī)施藥方式，使用背負(fù)式電動(dòng)噴霧器（3WDB-20L）對(duì)白及葉片正反面和莖部均勻噴霧，空白對(duì)照處理噴施等量清水。試驗(yàn)過程中，共調(diào)查4次，分別為施藥前病情指數(shù)調(diào)查（4月25日）、第1次施藥后7 d（5月2日）、第2次施藥后7 d（5月9日）和第2次施藥后14 d（5月16日）。每小區(qū)采用對(duì)角線五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)10株，每株調(diào)查最上方的3個(gè)葉片，記錄病葉發(fā)病面積，以每張葉片上病斑面積占整個(gè)葉面積的百分率進(jìn)行分級(jí)[25]。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑面積占整片葉面積的5. 1%以下；3級(jí)：病斑面積占整片葉面積的5.1%～25%；5級(jí)：病斑面積占整片葉面積的25.1%～50%;7級(jí)：病斑面積占整片葉面積的50.1%～75%;9級(jí)：病斑面積占整片葉面積的75%以上。

根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)按下式計(jì)算各處理小區(qū)的防治效果，并使用SPSS軟件處理調(diào)查數(shù)據(jù)，采用Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×相應(yīng)級(jí)值）／（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)值）×100；

防治效果=[1－（藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)－藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù)）／（空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù)一空白對(duì)照區(qū)施藥前病情指數(shù)）]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1田間發(fā)病癥狀

白及銹病的病原屬于專性寄生菌，具有較強(qiáng)的傳播能力。在田間，從4月至11月，其夏孢子可以反復(fù)侵染白及植株，發(fā)病率可達(dá)100%。該病發(fā)生初期，葉片正面呈現(xiàn)褪綠小黃斑（1～3mm），隨后葉背面出現(xiàn)散生、圓形、粉狀凸起的橘黃色夏孢子堆，直徑約1～5 mm，周圍有黃色暈圈。夏孢子是田間再侵染的主要來源。當(dāng)病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)葉片上密布幾十至上百個(gè)形狀大小不等的夏孢子孢子堆，導(dǎo)致葉片光合作用受阻，葉片扭曲、枯萎，最后脫落（圖1）。10月中旬以后，氣溫逐漸降低，在夏孢子堆周圍會(huì)出現(xiàn)紅褐色的冬孢子堆，呈圓環(huán)狀（圖2c）。

2.2病原夏孢子的致病性

接種夏孢子20 d后，白及葉片表面出現(xiàn)典型的淡黃色褪綠病斑，背面出現(xiàn)少量黃色夏孢子堆。45 d后，葉片下部（靠近葉鞘部）出現(xiàn)黃化、壞死和大量的孢子堆，癥狀與田間發(fā)病癥狀相似（圖1b～c）。

2.3病原夏孢子和冬孢子的形態(tài)

白及銹病病原的夏孢子呈卵圓形或長(zhǎng)橢圓形，單細(xì)胞，表面有疣狀突起，（32.1±4.72）μm×（20.6±2.5）μm（n=30）（圖2a～b）。冬孢子堆生于葉背表皮，呈墊狀，橘黃色（圖2c）。冬孢子棍棒狀，由2～4個(gè)細(xì)胞組成（1～3橫隔膜），大小為（108. 48±10.84）μm×（17. 97±2.56）μm（n=30）（圖2d～e）。

2.4分子生物學(xué)鑒定

將獲得的白及銹病病原的ITS（636 bp）和LSU（650 bp）基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)分別為MN108161和MN10 8162。利用ITS和LSU聯(lián)合基因序列，以K2模型構(gòu)建neighbor-join-ing（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)化樹結(jié)果表明，白及銹病病原與4個(gè)鞘銹屬真菌Coleosporium euodiae HMBF-11、C.campanulae HMBF-41501、C.pedic-ularidis HMBF-74454、C.bletiae N87聚為一簇，其bootstrap支持率為99%。其中該銹病病原（BSCl）與C.bletiae N87聚為一個(gè)亞支，其bootstrap支持率為91%，表明白及銹病的病原為鞘銹菌屬真菌Coleosporium bletiae（圖3）。

2.5田間防治藥劑的篩選結(jié)果

5種藥劑對(duì)白及銹病的防治效果有較大的差異（表2）。250g/L吡唑醚菌酯EC與12%萎銹靈WP對(duì)白及銹病的防控效果最好，第1次施藥后7d防效均在78%以上，其中250g/L吡唑醚菌酯EC在第2次施藥后的第14天防效可達(dá)90%。80%代森錳鋅WP和15%三唑酮WP在本試驗(yàn)中防效中等，二者無顯著差異，在第2次施藥后的第14天防效均可達(dá)到71%以上。10%苯醚甲環(huán)唑WG的防治效果最差，在整個(gè)施藥調(diào)查周期中，其防效僅在44%～57%之間。

3結(jié)論與討論

Coleosporium bletiae引起白及葉部銹病最早于1898年由日本學(xué)者Dietel報(bào)道[26]。根據(jù)其描述，C.bletiae夏孢子為橢球形，帶疣，冬孢子棒狀，由4個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，本研究結(jié)果與其描述相符，不同的是冬孢子大小為（108.48±10.84）μm×（17.97±2.56）μm，小于Dietel報(bào)道的150μm×25μm。據(jù)報(bào)道，我國(guó)臺(tái)灣、西藏和貴州等地的一些野生白及分布地有白及銹病發(fā)生[20，27-28]，但是僅對(duì)病害發(fā)生區(qū)域進(jìn)行了記錄，沒有病原的具體信息。本研究首次報(bào)道了湖北省恩施地區(qū)白及銹病的發(fā)生特點(diǎn)，并對(duì)病原形態(tài)及分子特征進(jìn)行了描述。

銹菌的生活史可以分為3種類型，包括長(zhǎng)循環(huán)型（macrocyclic）、缺夏孢子型（demicyclic）和短循環(huán)型（microcyclic） [29]。全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的鞘銹菌屬Coleosporium真菌約有100種[30]，大多數(shù)種的生活史是具有轉(zhuǎn)主寄主的長(zhǎng)循環(huán)型，可以產(chǎn)生5種不同類型的孢子，包括性孢子（pycniospores）、銹孢子（aeciospores）、夏孢子（urediospores）、冬孢子（telio-spores）和擔(dān)孢子（basidiospores）[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)Coleosporium bletiae的夏孢子和冬孢子都是在其寄主（白及）上產(chǎn)生，而其轉(zhuǎn)主寄主尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

白及銹病病原的傳染性極強(qiáng)，容易導(dǎo)致該病害嚴(yán)重發(fā)生，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，高效防治藥劑的篩選是防治關(guān)鍵。關(guān)于白及銹病的田間防治，僅見楊帆等[33]報(bào)道了25%吡唑醚菌酯SC的防效最好，達(dá)到了91.23%，15%三唑酮WP次之，其防效為84.12%。本研究也獲得了類似的結(jié)果，250g/L吡唑醚菌酯EC對(duì)白及銹病的防治效果最好，在第2次施藥后14 d的防效為90.01%，另外，12%萎銹靈WP對(duì)白及銹病也具有較好的防治效果，其防效與250g/L吡唑醚菌酯EC相當(dāng)。本研究中15%三唑酮WP第2次施藥后14d的防效僅為71.89%，這可能是由于三唑酮長(zhǎng)期作為湖北地區(qū)白及銹病的主要防治藥劑導(dǎo)致病原出現(xiàn)了一定的抗藥性。因此生產(chǎn)上推薦12%萎銹靈WP和250g/L吡唑醚菌酯EC作為白及銹病的防治藥劑。