液相色譜串聯(lián)質譜檢測啶菌唑及其降解產物在土壤和水中的殘留

左晗瑜　焦斌　徐軍等

關鍵詞 啶菌嗯唑；降解產物；土壤；水；殘留檢測

中圖分類號：S 481.8 文獻標識碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2022322

啶菌噁唑（pyrisoxazole），化學名稱為3-[5-（4-氯苯基）-2，3-二甲基-3-異噁唑烷基]吡啶，是我國自主創(chuàng)制的新型噁唑啉類殺菌劑[1]，由沈陽化工研究院于1997年自主研發(fā)。其作用機理為抑制病原菌麥角甾醇的生物合成[2]，甾醇14-a脫甲基酶為其作用靶標[3]。啶菌噁唑具有內吸性[4]，兼具保護和治療作用，能夠通過滲透作用進入植物體內并進行傳導，殺菌譜廣。目前啶菌噁唑已在番茄、黃瓜上取得登記。有研究表明啶菌噁唑對番茄、黃瓜灰霉病的防治效果優(yōu)于傳統(tǒng)殺菌劑如多菌靈、菌核凈、嘧霉胺等[5-7]，并且其與傳統(tǒng)殺菌劑無交互抗性[7]，可成為傳統(tǒng)殺菌劑的有效替代品，同時也可以與其他殺菌劑輪用或者混用，以降低選擇壓力，延緩病原菌抗性發(fā)展，應用潛力極大。

目前關于啶菌噁唑的研究多集中于母體化合物，如殺菌活性測試[8]、藥效試驗、殘留檢測和對映體及非對映體層面上的環(huán)境行為差異方面[9]。Jiao等[10]應用降解產物預測模型及高分辨質譜相結合的方法研究了啶菌噁唑在水和土壤中的降解行為和降解產物。啶菌噁唑在水中降解主要發(fā)生羥基化、羥基氧化、氨基脫保護、異噁唑環(huán)開環(huán)、脫氨基反應、脫水反應及雙鍵氧化反應。用標準品證實啶菌噁唑在水中的降解產物含有M-274B、M-270、M-254、M-137、M-121和M-119結構。啶菌噁唑在土壤中降解主要發(fā)生羥基化、甲基化、氨基脫保護、異噁唑環(huán)開環(huán)、羥基氧化、脫水反應及雙鍵還原反應。用標準品證實啶菌噁唑在土壤中的降解產物含有M-290、M-274B、M-257結構。

已有文獻報道了啶菌噁唑母體在土壤、卷心菜、小白菜、草莓[11]、辣椒、黃瓜[12]和番茄[13]等基質的殘留檢測方法。但其降解產物的殘留分析方法尚未見報道。

近年來，土壤、地表水和地下水中頻繁檢出殘留農藥[14-17]，且一些農藥在環(huán)境中會轉化產生活性或毒性更強的降解產物[18]。土壤和水環(huán)境中的農藥和降解產物殘留可以通過食物鏈富集，最終影響人類健康[19]，因此有必要開展土壤和水環(huán)境中農藥及其降解產物的殘留監(jiān)測。本研究建立了HPLC-MS/MS同時測定啶菌噁唑及其8種降解產物在土壤和水中的多殘留檢測方法。該方法簡便、準確、靈敏度高，適用于土壤和水中啶菌噁唑及其降解產物的檢測。

1材料與方法

1.1藥劑與試劑

99.3%啶菌噁唑標準品（CAS： 847749-37-5）購于沈陽化工研究院；降解嚴物M-119 （95.0%）、M-121（99.0%）、M-137 （97.0%）、M-254 （97.9%）、M-257（98.9%）、M-270 （94.7%）、M-274B （99.4%）、M-290（95.0%）由藥明康德公司合成。氯化鈉、無水硫酸鎂、分析純乙腈，國藥集團化學試劑有限公司；色譜純乙腈，德國默克公司；弗羅里硅土（ Florisil），購于天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2儀器與設備

高效液相色譜串聯(lián)質譜儀HPLC／MS/MS（G6470A），美國Agilent公司；高通量組織研磨儀（CK-2000型），托摩根生物科技公司；電子天平（DT500A，精度±0.1g），江蘇常熟常青儀器儀表廠，電子天平（BT25S，精度±0.00001g），德國Sar-torious公司；渦旋混合儀（Vortex-genie 2/2T），美國SI儀器公司；多管渦旋混勻儀（MS200），杭州瑞誠儀器有限公司；臺式高速離心機（ Heraeus Mega-fuge 8），美國Thermo公司；超純水制備系統(tǒng)cio-7003），美國Millipore公司。

1.3試驗方法

1.3.1土壤和水樣品采集

土壤樣品采集：黑土、紅土、水稻土、潮土和褐土，分別采集自黑龍江省大興安嶺地區(qū)呼瑪縣、湖南省長沙縣黃花鎮(zhèn)魚塘村、浙江省紹興市諸暨市店口鎮(zhèn)、河北省固安縣東位村和山西省運城市平陸縣西延村。各種土壤的理化性質見表1。采集地點均未使用過啶菌噁唑。除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，過2 mm篩，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

水樣品采集：選擇總有機碳含量（total organic carbon content，TOC）不同的地表水，分別為北京市海淀區(qū)辛店河（總有機碳含量為21.4 mg/L）和北京市朝陽區(qū)奧林匹克森林公園（總有機碳含量為4.0mg/L）。采集的水樣在目標化合物出峰處無干擾，作為空白水樣品。

1.3.2前處理方法

土壤樣品：稱取5.0 g土壤（精度±0.01 g）于50 mL離心管，加入5 mL超純水浸潤樣品，渦旋1 min，再加入10 mL乙腈，振蕩提取10 min。加入2 g NaCl和2g MgSO，振蕩提取5min，4000r／min離心5 min。取上清加入凈化小管中（含50 mgFlorisil，150 mg MgSO），渦旋1min，5000r／min離心5 min。用一次性無菌注射器吸取上清液，過0.22μm有機系濾膜，取100μL濾液與900μL超純水混合，待進樣。

水樣品：對于降解產物M-119、M-121、M-137的檢測，移取10.0mL（精度±0.01 mL）水樣，渦旋1min，4000 r／min離心5 min，使用一次性無菌注射器吸取上清液，過0.22μm水系濾膜，待進樣。

對于啶菌噁唑及降解產物M-254、M-270、M-274B的檢測，移取10.0 mL（精度±0.01 mL）水樣，渦旋1min后加入10 mL乙腈，振蕩提取5 min，加入4g NaCl，振蕩1min，4000r／min離心5min，過0.22μm有機系濾膜。取上清1mL置于2mL離心管氮吹至干，用初始流動相，即100μL色譜純乙腈及900μL超純水復溶，待進樣。

1.3.3色譜和質譜檢測條件

色譜條件：色譜柱采用Poroshell 120 EC-Ci8（2.1 mm×50 mm，1.9μm）；色譜柱溫度為40℃；進樣量5μL;流動相為0.2%甲酸水（A）和乙腈（B）；流速0. 300

mL/min；洗脫梯度為：0→0.5 min，90% A; 0.5→2.0 min， 90%A→10% A; 2.0→3.0min， 1026A;3.0→3.1 min， 10% A→90% A;3.1→5.0 min，90%A。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式；鞘氣溫度350℃；鞘氣流速11 L/min；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速8 L／min;霧化氣壓力45 psi；噴嘴電壓500V；啶菌噁唑及其降解產物的質譜參數(shù)如表2所示。

1.3.4標準溶液的配制及標準曲線的制作

用萬分之一天平分別稱取啶菌噁唑及其降解產物標準品10 mg，置于10 mL容量瓶中，并用色譜純乙腈定容至10 mL，得到1000 mg/L啶菌噁唑及其各降解產物標準品母液。分別取啶菌噁唑、M-290、M-274B、M-257標準品母液各1mL于10mL容量瓶，用色譜純乙腈稀釋至100 mg/L，得到啶菌噁唑及其在土壤中降解產物的混合標準溶液。按相同的方法制備啶菌噁唑及其在水中降解產物（M-274B、M-270、M-254、M-137、M-121和M-119）的混合標準溶液。各溶液均用錫箔紙包裹，于-18℃避光保存。啶菌噁唑及其土壤降解產物的混合標準溶液用乙腈、空白基質提取液逐級稀釋，得到0.05、0.1、0.5、1、5、10μg/L的溶劑標準溶液及基質標準溶液；啶菌噁唑及其水中降解產物的混合標準溶液用乙腈、空白基質提取液逐級稀釋，得到0.1、0.5、1、5、10、50μg/L的溶劑標準溶液及基質標準溶液。按照1.3.3節(jié)的條件測定。以峰面積為縱坐標，以質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.5添加回收試驗

在空白土壤樣品中添加適量標準品儲備液，使得土壤的3個添加水平分別為1、10、100μg/kg，每種基質每個水平設置5個重復；在空白水樣品中添加適量標準品儲備液，使得水的3個添加水平分別為0.1、1、10μg/L，每種基質每個水平設置5個重復。按1.3.2節(jié)的方法處理，1.3.3節(jié)的條件測定，計算平均回收率及相對標準偏差（ RSD）。

2結果與分析

2.1檢測條件的優(yōu)化

本研究選用Poroshell 120 EC-C色譜柱分離目標化合物。在優(yōu)化液相色譜流動相條件時，分別采用了乙腈-超純水、乙腈-0.2%甲酸水作為流動相，并采用梯度洗脫法對標準溶液進行進樣分析。結果發(fā)現(xiàn)加入微量甲酸后不僅峰型更好，而且提高了目標化合物的響應。因此，最終選擇以乙腈一0.2%甲酸水溶液作為流動相。采用手動優(yōu)化建立每個目標化合物的質譜條件，首先利用全掃描模式（MS2 SCAN）尋找目標化合物的母離子，然后利用選擇離子監(jiān)測模式（MS2 SIM）優(yōu)化錐孔電壓，使化合物母離子響應最高，最后在子離子掃描模式（product ion scan）下，使用已優(yōu)化好的錐孔電壓，選擇兩個穩(wěn)定存在且響應較高的子離子，優(yōu)化各自的碰撞能量，使兩個子離子響應最高。優(yōu)化的質譜參數(shù)見表2。

2.2提取條件的優(yōu)化

農藥殘留分析中常用的有機溶劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等，乙腈可以溶解并提取各種極性與非極性的農藥，提取效率高，被作為QuEChERS前處理方法廣泛應用[20-21]，因此本試驗選擇乙腈作為萃取劑。

一般而言，由于大部分農藥偏酸性，乙腈溶液中加入酸可以提高分析物的添加回收率[22-23]。有研究表明[24]，黑土、潮土和水稻土有機質含量較高，加入甲酸能增加部分有機質的溶解度，這些有機質又作為共流出物影響目標化合物的響應。因此，選擇純乙腈作為土壤樣品的提取溶劑。

在對水樣品進行提取分析時發(fā)現(xiàn)，水系濾膜會對啶菌噁唑及其降解產物M-254、M-270、M-274B產生吸附，過膜后，回收率為13%～45%，不滿足殘留分析的要求，不宜采用直接過0.22μm水系濾膜的方式，故針對這幾種化合物采取乙腈提取的方法，而降解產物M-119、M-121、M-137不會被水系濾膜吸附，但采用乙腈提取其回收率不足50%，不滿足殘留分析的要求，故針對這3種化合物采取直接過0.22μm水系濾膜的方法。即水樣品采取直接過0.22μm水系濾膜和乙腈提取兩種提取方法。

2.3凈化條件的優(yōu)化

N-丙基乙二胺（PSA）能有效去除基質中的脂肪酸、酚類、碳水化合物等酸性干擾物質以及部分極性色素；C凈化劑屬于反相吸附劑，可以除去脂類、花青素、蠟類等非極性干擾物質；Florisil主要去除一些極性干擾物及油脂；石墨化炭黑（GCB）主要用來去除色素[24-25]。由于黑土、水稻土、潮土含有大量有機質，故選擇了50 mg Florisil、50 mg C和50 mg PSA3種凈化方式進行凈化。水樣品中有機質、色素等干擾物質較少，故無需用凈化劑對樣品凈化。

凈化方式對回收率的影響見圖1。從圖1中可以看出，3種凈化方式凈化后，除使用50 mg C時，M-290回收率不到70%外，其他凈化方式下啶菌噁唑及其降解產物M-257、M-274B和M-290的回收率均在70%～120%之間；但當使用50 mg Florisil時，啶菌噁唑及其降解產物回收率均較好。因此50 mg Florisil被選為本研究中土壤樣品的凈化劑。

2.4分析方法的線性方程、定量限及基質效應

啶菌噁唑及其降解產物的標準曲線的線性方程、定量限見表3，表4。以最低添加水平確定方法的定量限（LOQ）。啶菌噁唑及其降解產物在土壤中定量限為1.0μg/kg，其標準曲線在0.05～10μg/L范圍內線性關系良好，決定系數(shù)（R）大于0.99。啶菌噁唑及其降解產物在水中的定量限均為0.1μg/L，其標準曲線在0.1～50μg/L范圍內儀器響應與進樣質量濃度的線性關系良好，決定系數(shù)（R2）大于0.99。

殘留農藥的定量分析會受基質效應的影響，不同基質對目標化合物的電離產生不同的影響，會降低或增強目標化合物響應[26]。通過基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值（k），可以判斷基質效應的大小[27]。當k<0.9為基質減弱效應；k>L1時為基質增強效應；而當k為0.9～L1時為基質效應不明顯。在本試驗中，除黑土對M-257，水稻土對M-274B，黑土、水稻土、潮土對M-290表現(xiàn)出基質減弱效應外，其他基質對啶菌噁唑及其在土壤中的降解產物的基質效應不明顯，可能是樣品經(jīng)過稀釋減弱了基質效應。另外，河水和湖水中啶菌噁唑及其降解產物的k值均小于0.9，表現(xiàn)為基質減弱效應。河水對降解產物的基質減弱效應強于湖水，推斷河水中總有機碳含量較高抑制了降解產物的離子化效率，導致基質效應減弱。為了彌補基質效應對結果定量分析的影響，保證方法的準確性和通用性，采用基質標準曲線對實際樣品進行定量。

2.5分析方法的特異性、準確度和精確度

啶菌噁唑及其降解產物均在3min內出峰，出峰時間如表2所示。從空白色譜圖中可以看出，農藥及其各降解產物的相應出峰時間內目標化合物沒有干擾（圖2）。

方法準確度由添加回收率來評估，精確度由不同重復之間回收率的相對標準偏差（ RSD）來評估。啶菌噁唑及其降解產物在5種土壤中的平均回收率為71%～111%，相對標準偏差為0.9%～10.9%（表5），在高有機碳含量和低有機碳含量的水中的平均回收率為80%～111%，相對標準偏差為0.1%～7.5%（表6），均滿足《農藥登記土壤和水中化學農藥分析方法建立和驗證指南》（NY/T 3151-2017）[28]殘留分析的要求。

2.6實際樣品檢測

采集了海淀區(qū)南長河、玉淵潭公園、圓明園和西城區(qū)北海公園4地的地表水，并應用上述方法對此4地的地表水進行檢測。結果顯示這4地的地表水樣品中啶菌噁唑及其降解產物殘留值均低于定量限（0.1μg/L）。

3結論

本研究建立的啶菌噁唑及其降解產物在土壤和水中的殘留分析方法具有良好的特異性，樣品前處理操作簡單，方法的線性范圍、平均添加回收率及其相對標準偏差等性能指標均滿足農藥殘留分析要求，啶菌噁唑及其降解產物在5種土壤中的平均回收率在71%～111%之間，相對標準偏差為0.9%～10.9%；在高有機碳含量和低有機碳含量的水中的平均回收率在80%～111%之間，相對標準偏差為0.1%～7.5%。啶菌噁唑及其降解產物在土壤中的定量限為1.0μg/kg;在水中的定量限均為0.1μg/L。本方法適用于啶菌噁唑及其降解產物在土壤和水中殘留的檢測，為啶菌噁唑及其降解產物在環(huán)境中殘留的安全風險評估提供技術方法和數(shù)據(jù)支持。