實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在湖南油菜根腫病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

周游　謝芳玲　肖蓉等

關(guān)鍵詞 油菜根腫?。粚?shí)時(shí)熒光定量PCR;休眠孢子；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S 432.44 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2022282油菜作為湖南省的主要油料作物，其種植面積居全國首位[1]。近年來，由于油菜根腫病的發(fā)生和蔓延，嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)湖南油菜產(chǎn)業(yè)構(gòu)成重大威脅。油菜根腫病是由蕓薹根腫菌Plas-modiophora brassicae侵染并引起的一種破壞性土傳病害[2]。該病害主要由帶菌土壤中的休眠孢子傳播，休眠孢子可在沒有寄主植物的情況下在土壤中存活20年[3]。對(duì)休眠孢子的早期檢測(cè)有助于及時(shí)采取相應(yīng)措施防止該病害進(jìn)一步傳播，但蕓薹根腫菌作為專性寄生菌，不能人工培養(yǎng)，且傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)不能對(duì)初始模板準(zhǔn)確定量分析，也無法避免污染時(shí)出現(xiàn)的假陽性[4]。而具有定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR逐漸受到青睞和廣泛應(yīng)用[5]。Wallenhammar等采用DNA提取和純化以及PCR分析，將探針和qPCR技術(shù)相結(jié)合建立了一種穩(wěn)定而快速的用于檢測(cè)和定量田間土壤樣品中休眠孢子的方法[6]。Deo-ra等建立的多重TaqMan qPCR測(cè)定法提高了蕓薹屬植物土壤中休眠孢子的檢測(cè)靈敏度。將競(jìng)爭性內(nèi)部陽性對(duì)照（competitive internal positive control，CIPC）用于該測(cè)定法可以更準(zhǔn)確地估計(jì)土壤中的休眠孢子，也減少了假陰性的可能性[7]。Li等開發(fā)了SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)出土壤樣品中休眠孢子的檢測(cè)限為1000個(gè)/g，同時(shí)驗(yàn)證了該方法具有高度特異性[8]。宋瓊等采用SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系對(duì)采集的42份土樣所含根腫病菌休眠孢子進(jìn)行定量檢測(cè)，探索了土壤中根腫病菌數(shù)量與作物根腫病發(fā)病之間的關(guān)系[9]。

本文對(duì)2021年-2022年從湖南各地采集的64份油菜根腫病田塊土樣進(jìn)行系統(tǒng)整理，并根據(jù)蕓薹根腫菌ITS序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測(cè)湖南各地土樣的休眠孢子數(shù)量，總結(jié)出休眠孢子數(shù)量對(duì)油菜田發(fā)病程度的影響，此方法可以作為精準(zhǔn)檢測(cè)蕓薹根腫菌的技術(shù)指導(dǎo)，有助于防止該病害進(jìn)一步傳播。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試病樣

含根腫病菌的樣品采自湖南省油菜種植區(qū)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)油菜根腫病植株。將病株腫根洗凈后，編號(hào)并裝入密封袋，置－20℃冰箱中保存。

1.1.2供試土樣

分別采自湖南省懷化市、常德市、岳陽市、吉首市等各鄉(xiāng)鎮(zhèn)油菜種植區(qū)土樣共64份。采集土樣時(shí)，挖取距地表約5～10 cm的油菜病株根系及周圍土壤，對(duì)整塊油菜田采用隨機(jī)五點(diǎn)取樣法并將采集的土樣混合均勻。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1土壤處理

將采集的土樣放置于陰涼處，風(fēng)干后用研缽研磨，將磨碎的土樣過380μm孔徑的篩網(wǎng)后，裝入密封袋并編號(hào)，保存于－20℃冰箱。

1.2.2油菜腫根DNA提取

取少量洗凈、切碎的油菜腫根采用CTAB法提取總DNA[10]，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量。

1.2.3特異性引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)蕓薹根腫菌的ITS序列應(yīng)用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物pbF/pbR，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為pbF（5′-ACAACGATGAAGAACGCAGCGAACT-3′）和pbR（5′-CGCAAACAAACAGAAACCGA-CACTC-3′）。PCR反應(yīng)體系（25μL）為：2×Mix12.5μL，PbF（10μmol／L）和PbR（10μmol／L）各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min。以ddH20為對(duì)照。擴(kuò)增后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4制備標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

純化PCR產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物與pMD18-T（TaKa-Ra）載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trelie 5α（北京擎科生物技術(shù)有限公司），取100、200μL菌液涂布到含有氨芐（50μg／mL）的LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～16 h。做菌落PCR，隨機(jī)挑取被鑒定為陽性克隆的3個(gè)單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)4h，送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。提取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的菌株質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.2.5提取土壤DNA

稱取0.25g過篩細(xì)土，使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（德國QIAGEN GmbH）提取土壤DNA，將提取的DNA于－20℃冰箱中保存。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR

總反應(yīng)體系為20μL：Platinu SYBR GreenqPCR SuperMix-UDG with ROX（Invitrogen）10μL，pbF（10μmol／L）和pbR（10μmol／L）各0.5μL，DNA模板1μL，ddHO 8μL。反應(yīng)條件為：50℃熱激活2min，95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15s，63℃退火30s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解段94℃30s，60℃90s，94℃10s。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，檢測(cè)結(jié)果取平均值。

1.2.7檢測(cè)方法靈敏度

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA濃度按10倍梯度稀釋為3×10，3X10，3×10，3×10，3×10μg/μL進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，獲取檢測(cè)樣品Ct值，并與常規(guī)PCR的最低檢測(cè)限對(duì)比，分析qPCR檢測(cè)體系的靈敏性。

1.2.8實(shí)地調(diào)查

對(duì)湖南各地主要油菜種植區(qū)采取實(shí)地調(diào)查的方式，調(diào)查方法為隨機(jī)五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)拔4株，共20株，洗凈根部的泥土，根據(jù)病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄當(dāng)?shù)匕l(fā)病程度。分析發(fā)病程度與休眠孢子數(shù)量的關(guān)系。

根腫病苗期病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：根部無腫瘤；1級(jí)：側(cè)根有小腫瘤；3級(jí)：主根腫大，其直徑小于2倍莖基部；5級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的2～3倍；7級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的3～4倍；9級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的4倍以上或腫大的根部變黑。

成株期病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無??；1級(jí)：腫根只附著在側(cè)根上，數(shù)量占根系全部的1%～25%；2級(jí)：主根上有腫根附著，側(cè)根上腫根數(shù)量占25%以上；3級(jí)：腫根數(shù)量占50%～75%的根系，主根上有腫根附著；4級(jí)：腫根數(shù)量占75%以上的根系，主根上有腫根附著。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）／（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)值）×100；

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)／調(diào)查總株數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1引物pbF／pbR的特異性評(píng)價(jià)

利用針對(duì)蕓薹根腫菌的特異性引物pbF和pbR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到目的片段為143 bp，無非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。熒光定量熔解曲線（圖1）只有單個(gè)峰值說明該引物特異性良好，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序并與在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與蕓薹根腫菌部分基因相似性超過99%，可用于檢測(cè)根腫菌。

以油菜菌核病核盤菌Sclerotinia sclerotiorum（Lib.） de Bary和油菜黑斑病蕓薹鏈格孢Alternar-ia brassicae （Berk.）Sacc.所提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以ddHO作為空白對(duì)照，驗(yàn)證該引物的特異性。結(jié)果表明該引物只對(duì)蕓薹根腫菌的基因組DNA進(jìn)行有效擴(kuò)增，而其他病害及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)條帶（圖2），說明該引物對(duì)蕓薹根腫菌具有很好的特異性。

2.2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋為5個(gè)濃度（3×10，3×10，3×10，3×10，3×10μg／μL）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）并計(jì)算回歸方程，根腫菌質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)（X）的對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)的Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式為：Ct=－3.561×logX+49.242（R=0.999），擴(kuò)增效率為90.903%，在濃度3×10～3×10μg/μL范圍內(nèi)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度線性關(guān)系良好。質(zhì)?？截悢?shù)根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算：質(zhì)?？截悢?shù)=N·6.02×10/MW·10，N為質(zhì)粒濃度，單位ng/μL，MW為重組質(zhì)粒分子量一線性質(zhì)粒長度×660，660為一個(gè)堿基的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.3靈敏度檢測(cè)

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋后，分別用常規(guī)PCR和qPCR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，常規(guī)PCR檢測(cè)到的最低濃度為3×10μg/μL，低于該濃度無擴(kuò)增條帶（圖4）。當(dāng)檢測(cè)濃度為3×10-Uμg/μL時(shí)Ct值為35. 92，Ct值大于35判定為陰性，熒光定量PCR檢測(cè)體系的最低檢測(cè)限為3×10μg/μL（Ct=32.05），即qPCR檢測(cè)靈敏度比常規(guī)PCR靈敏度高100倍。

2.4 qPCR檢測(cè)湖南各地土樣休眠孢子數(shù)量

對(duì)采自湖南懷化市、常德市、岳陽市、吉首市的64份油菜種植區(qū)土樣應(yīng)用qPCR體系檢測(cè)可知休眠孢子數(shù)量為2.95×10～2.22×10個(gè)/g（表1），其中沅陵縣、中方縣和臨澧縣的各鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)病田塊的休眠孢子含量較高，據(jù)實(shí)地調(diào)查，休眠孢子含量較高的田塊其發(fā)病程度也較為嚴(yán)重，其中部分發(fā)病嚴(yán)重的田塊發(fā)病率可達(dá)100%。沅陵縣筲箕灣3號(hào)田塊發(fā)病最重，檢測(cè)出休眠孢子數(shù)目為2.22×10個(gè)/g。各地患病土壤中的休眠孢子基本大于10個(gè)/g，表明當(dāng)土壤中休眠孢子數(shù)量≥10個(gè)/g時(shí)，油菜易發(fā)生根腫病且土壤中休眠孢子的數(shù)量直接影響油菜田的發(fā)病程度。

3結(jié)論與討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析[11]。其檢測(cè)方法分為SYBR Green Ⅰ法[12]和TaqMan探針法[13]。本研究采用SYBRGreen I法對(duì)蕓薹根腫菌進(jìn)行定量檢測(cè)，SYBR只結(jié)合雙鏈DNA，可以通過熔解曲線保證PCR反應(yīng)的特異性。相較于Taq Man探針法通用性好、價(jià)格低、應(yīng)用廣泛[14]。

如今，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在公共衛(wèi)生[15-16]、食品安全[17-18]、基因篩選[19-20]等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在植物病原檢測(cè)方面的研究也在不斷深入發(fā)展[21]，陳清清等將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于小麥根腐病菌索氏平臍蠕孢Bipolaris soro-kiniana的檢測(cè)[22]。余鵬舉等利用SYBR GreenⅠ法優(yōu)化建立了檢測(cè)核桃膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系[23]。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行定量檢測(cè)可以在短時(shí)間內(nèi)掌握病原菌的變化規(guī)律和發(fā)展趨勢(shì)[24]。

蕓薹根腫菌主要以休眠孢子的形式在土壤中越夏越冬。土壤中休眠孢子數(shù)量和發(fā)病的嚴(yán)重程度有著密切聯(lián)系[25]。本研究對(duì)湖南各地采集的64份土樣進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，明確了湖南各地病田中根腫病菌休眠孢子的數(shù)量。當(dāng)土壤中休眠孢子數(shù)量≥104個(gè)/g時(shí)，油菜易發(fā)生根腫病，應(yīng)及時(shí)采取有效防控措施。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)了快速、精準(zhǔn)地定量檢測(cè)田間蕓薹根腫菌的數(shù)量，對(duì)湖南油菜根腫病的流行監(jiān)測(cè)預(yù)警具有重要意義[26]。然而，qPCR依賴于使用合適的引物和合理的DNA模板，并且無法區(qū)分活菌和死菌的DNA[27]。因此該檢測(cè)方法未來仍需要進(jìn)一步研究。