4種植物揮發(fā)油的化學成分分析及其對赤擬谷盜的生物活性

劉晶　蔣超　劉鼎闊等

關鍵詞 飛機草；假蒟；紫穗槐；毛麝香；GC-MS；觸殺活性；驅(qū)避活性

中圖分類號：S 379.5 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022422

赤擬谷盜Tribolium castaneum屬鞘翅目擬步甲科，是世界性倉儲害蟲[1]。赤擬谷盜食性廣，主要蛀食小麥、玉米及中藥材等[2]。該昆蟲繁殖速度快，并且其分泌物中含有苯醌等致癌物質(zhì)，被害物受污染后易結(jié)塊、發(fā)臭，不僅造成資源浪費，還會對人類健康產(chǎn)生潛在威脅[3]。目前，常用的倉儲害蟲防治方法有高溫防治法、低溫冷藏法和化學藥劑防治法等，其中，化學藥劑防治方法應用最為廣泛，但長期、過量使用會導致害蟲耐藥性增強，環(huán)境污染，并對人類健康造成潛在威脅[2]。與傳統(tǒng)的化學藥劑相比，植物源殺蟲劑因具有作用機制多樣、低毒和環(huán)境友好等特點受到了廣泛關注[4]。揮發(fā)油是一種植物次生代謝物質(zhì)，具有特殊的芳香氣味，其主要成分為萜類和苯丙素類物質(zhì)，在植物源農(nóng)藥領域的應用已具一定規(guī)模，其中，用于倉儲害蟲防治的八角茴香油年產(chǎn)量已突破千噸大關[5-7]。

本文在對揮發(fā)油生物活性的研究中發(fā)現(xiàn)，飛機草Chromolaena odorata、假蒟Piper sarmentosum、紫穗槐Amorpha fruticosa和毛麝香Adenosma glutinosa揮發(fā)油具有觸殺和驅(qū)避活性。飛機草為菊科飛機草屬草本植物，主要分布于海南和云南等地區(qū)，其化學成分以黃酮類、萜類和揮發(fā)油類為主[8-9]。飛機草乙醇提取物對褐飛虱Nilaparvoata lugens有驅(qū)避作用，而其揮發(fā)油對荔枝蒂蛀蟲Co-nopomorpha sinensis和柳毒蛾Leucoma salicis分別具有驅(qū)避和毒殺作用[10-12]。假蒟為胡椒科胡椒屬多年生草本植物，大多生長在熱帶濕潤地區(qū)，主要含有萜烯類、酸類、醚類和醇類等化學成分[13-15]。假蒟揮發(fā)油對小菜蛾Plutella xylostella具有良好的驅(qū)避活性[16]，而其石油醚提取物對皮氏葉螨Tetrany-chus piercei、螺旋粉虱Aleurodicus dispersus具有較好的殺蟲活性[15，17]，其乙醇提取物對椰心葉甲Brontispa longissima具有較好的拒食活性[18]。紫穗槐為豆科紫穗槐屬多年生落葉灌木，在我國東北、華北和西北等地區(qū)廣泛種植，其含有黃酮類、二苯乙烯苷類和揮發(fā)油類等化學成分[19-21]。紫穗槐種子的乙醇提取物對淡色庫蚊Culex pipiens pallens和小菜蛾具有殺蟲活性[19，22]，而其鮮葉的乙醇提取物對大皺鰓金龜甲Trematodes grandis有良好的毒殺作用[23]。毛麝香為車前科毛麝香屬草本植物，大多分布于我國廣東、廣西及云南等地[24-25]。其含有豐富揮發(fā)油、萜類和黃酮類等化學成分，在西雙版納常被用作驅(qū)蟲劑[26-27]。

本文對這4種植物的揮發(fā)油進行化學成分分析，并評價其對倉儲害蟲赤擬谷盜的觸殺和驅(qū)避活性，以期為上述植物的開發(fā)及利用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

赤擬谷盜于2017年6月引種自北京師范大學資源學院。將干凈的小麥磨成粉狀，與酵母粉按10：1的比例混勻，裝入玻璃瓶內(nèi)，每瓶接種40～50頭成蟲，蓋上紗布，用皮筋固定，置于培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）中，在28～30℃、相對濕度70%～80%，黑暗條件下飼養(yǎng)。試驗所用的昆蟲為羽化后1～2周的成蟲。

1.2植物材料

植物樣品的采集信息見表1。采集樣品均經(jīng)天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院尤春雪老師鑒定。其中，飛機草、假茹和毛麝香樣品為地上部分，紫穗槐樣品為枝葉及果實。植物樣本保存于天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室。

1.3揮發(fā)油的提取

將4種植物切碎后，分別放入揮發(fā)油提取器中，采用水蒸氣蒸餾法，提取5～7 h，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉（NaSO）去除水分，將得到的揮發(fā)油置于4℃冰箱中密封保存。

1.4揮發(fā)油的GC-MS分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，QP2010SE型，日本島津）對揮發(fā)油的化學成分進行鑒定。色譜柱選用Rtx-5Sil MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），起始柱溫設定為85℃，保持4 min，然后以10℃/min升至200℃，在此溫度下保持2 min后以15℃/min升溫至280℃，保持10 min。掃描范圍為80～600 m/z，離子化方式為EI，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。通過與標準譜庫（NIST 14.0）中的化合物對比，鑒定5種揮發(fā)油的化學成分組成，采用面積歸一法計算其相對含量。

1.5觸殺活性

根據(jù)Feng等[28]的方法測定植物揮發(fā)油對赤擬谷盜的觸殺活性。每種植物揮發(fā)油分別采用50%、10%和2%3種濃度進行預試驗，以尋找合適的檢測濃度。用移液槍吸取0.5μL樣品稀釋液滴于赤擬谷盜的前胸背板，處理后，將試蟲放入玻璃瓶中，飼養(yǎng)條件同1.1。以正己烷為空白對照，每個濃度重復5次，每個重復處理10頭試蟲，整個試驗重復3次，24 h后觀察并記錄試蟲的死亡率。

1.6驅(qū)避活性

根據(jù)You等[29]的方法測定植物揮發(fā)油對赤擬谷盜的驅(qū)避活性。配制5個濃度（78.63、15.73、3.15、0.63、0.13 nL/cm）的供試溶液，將濾紙（直徑9cm）剪成2等份，用移液槍吸取500μL供試溶液均勻滴在其中一份上作為處理，另一份用等量的正己烷處理作為對照。待溶劑自然揮發(fā)后，將兩份濾紙緊貼在培養(yǎng)皿（直徑9cm）底部。每個培養(yǎng)皿在中心接入20頭試蟲。每處理重復5次，整個試驗重復3次。同時以市售驅(qū)避劑避蚊胺（DEET，純度>98%，購自TCI開發(fā)有限公司，上海）作為陽性對照。分別于2、4h統(tǒng)計不同區(qū)域的試蟲數(shù)量，計算驅(qū)避率（PR）：

PR=[（N-N）/（N+N）]×100%。

其中，N是對照區(qū)試蟲數(shù)量，N是處理區(qū)試蟲數(shù)量。求出平均PR值和標準誤。在驅(qū)避試驗中，每種揮發(fā)油有5個測試濃度和兩個時間點，共10個PR值，很難直觀比較驅(qū)避活性。因此引入灰色關聯(lián)度分析，基于相對關聯(lián)度r對驅(qū)避活性進行比較，r值越大，驅(qū)避活性越顯著。相對關聯(lián)度r的計算方法參照You等[30]。

1.7統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。采用Probit分析計算半數(shù)致死量（LD）。采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比較法比較不同樣本驅(qū)避率的差異顯著性，顯著水平設置為a=0.05。在方差分析和Tukey多重比較前數(shù)據(jù)先進行反正弦平方根變換。

2結(jié)果與分析

2.1揮發(fā)油提取結(jié)果

飛機草、假蒟、紫穗槐和毛麝香揮發(fā)油提取結(jié)果見表2。在提取飛機草揮發(fā)油過程中，2h之前揮發(fā)油在水上方，采用輕油提取器進行提取，2h之后揮發(fā)油在水下方，改用重油提取器，因此，將這兩種揮發(fā)油分別記為飛機草輕油和飛機草重油。

2.2揮發(fā)油的化學成分分析

飛機草、假蒟、紫穗槐和毛麝香揮發(fā)油的化學成分分析見表3，共鑒定出100種成分，其中，飛機草輕油和假蒟揮發(fā)油以倍半萜類成分為主，飛機草重油、紫穗槐和毛麝香揮發(fā)油以單萜類成分為主。飛機草輕油主要成分有肉豆蔻醚（34.32%）、β-石竹烯（22.35%）和（－）-α-古蕓烯（12.14%）。飛機草重油主要成分有肉豆蔻醚（46.58%）、β-石竹烯（17.98%）和α-古巴烯（7.34%）。假蒟揮發(fā)油中β-胡椒烯（18.23%）、β-石竹烯（14.60%）和萘，1，2，3，5，6，8a-六氫化-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）（10.05%）含量較高。紫穗槐揮發(fā)油主要成分有α-蒎烯（26.31%）和早熟素Ⅰ（7.46%）。毛麝香揮發(fā)油成分含量較高的有γ-松油烯（24.90%）、環(huán)葑莰烯（16.59%）、雙戊烯（11.57%）和桉葉油醇（11.42%）。其中，5種揮發(fā)油均含有β-石竹烯，其含量在3.10%～22. 35%之間，飛機草輕油、飛機草重油、假茹揮發(fā)油和毛麝香揮發(fā)油共有成分為萘，1，2，3，5，6，8a-六氫化-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基），其含量在0.87%～10.05%之間。

2.3揮發(fā)油觸殺活性

5種植物揮發(fā)油對赤擬谷盜均有觸殺活性，結(jié)果如表4所示。其中，紫穗槐揮發(fā)油的觸殺活性最強，其24h的LD為44.08μg/頭，其次是毛麝香揮發(fā)油（LD=51. 69μg/頭）、假蒟揮發(fā)油（LD=51.94μg/頭）和飛機草輕油（LD=58.83μg/頭），飛機草重油的觸殺活性最弱，LD為62.73μg/頭，紫穗槐揮發(fā)油的觸殺活性是其1.42倍。

2.4揮發(fā)油驅(qū)避活性

5種植物揮發(fā)油對赤擬谷盜的驅(qū)避活性結(jié)果見圖1。在高濃度78.63nL/cm下，2h和4h均是毛麝香揮發(fā)油的驅(qū)避率最高，PR值分別為94%和100%；在濃度為15.73 nL/cm時，假蒟揮發(fā)油在2h和4h的驅(qū)避率均是最高，PR值分別為100%和96%；在3.15nL/cm濃度下，飛機草重油在2h驅(qū)避率最高，PR值為86%，假蒟揮發(fā)油在4h驅(qū)避率最高，PR值為84%;在濃度為0.63nL／cm時，2h和4h毛麝香揮發(fā)油驅(qū)避率均是最高，PR值均為76%；在最低濃度0.13nL/cm，毛麝香揮發(fā)油在2h和4h的驅(qū)避率皆為最高，PR值分別為72%和76%。

由此可知，不同濃度和時間，揮發(fā)油樣品的驅(qū)避活性存在差異，僅通過驅(qū)避率很難直觀地比較多個樣品的驅(qū)避活性，因此，本文引入“灰色關聯(lián)度法”評價驅(qū)避活性，結(jié)果見表5。飛機草重油、假蒟揮發(fā)油、紫穗槐揮發(fā)油和毛麝香揮發(fā)油呈現(xiàn)顯著的驅(qū)避活性，其r值均大于陽性對照避蚊胺，其中，毛麝香揮發(fā)油的驅(qū)避活性最為顯著，其r值為0.6572，因此毛麝香具有開發(fā)成天然驅(qū)避劑的潛力，可用于倉儲害蟲的防治。

3結(jié)論與討論

Sharma等[32]的研究表明，印度迪布魯加的飛機草鮮葉揮發(fā)油密度為0.796g/mL，主要成分有吉枝烯（25.10%）、鍺烯D（20.27%）、β-石竹烯（10.04%）、α-蒎烯（9.64%）和β-蒎烯（4.85%），其中吉枝烯含量最高。與本研究的飛機草揮發(fā)油相比，共有成分為j石竹烯，但本研究中含量最高的成分為肉豆蔻醚。Hieu等[33]從越南假蒟莖、葉中提取的揮發(fā)油主要成分為苯甲酸芐酯（49.1%）、苯甲醇（17.9%）、2-羥基苯甲酸苯甲酯（10.0%）和2-丁烯基苯（7.9%），與本文中的假茹揮發(fā)油相比，兩者的主要成分中并沒有相同的成分。Lis等[34]于波蘭中部采集的紫穗槐鮮葉中提取的揮發(fā)油的主要成分有曠桉葉醇（13.9%）、（E）-P-檸檬烯（11.9%）和α-蒎烯（11.8%）。與本試驗的紫穗槐揮發(fā)油進行對比發(fā)現(xiàn)，兩者主要成分中均有α-蒎烯，但含量差異較大。楊東娟等[27]從廣東省潮州市的毛麝香中提取的揮發(fā)油的主要成分是檸檬烯（24.40%）、桉樹醇（19.82%）、葑酮（19.36%）、紅沒藥烯（8.24%）、α-蒎烯（6.98%）和γ-松油烯（6.78%），與本文毛麝香揮發(fā)油主要成分相比，兩者均有γ-松油烯，但含量差異較大。經(jīng)以上分析得知，本試驗中揮發(fā)油的成分和含量與文獻報道存在差異，可能是由于采集時間、地理位置、氣候和儲存時間不同，而這些差異可能會導致?lián)]發(fā)油生物活性不同[35]。

觸殺活性測定結(jié)果表明，這5種植物的揮發(fā)油對赤擬谷盜均具有一定的觸殺活性，活性由強到弱依次為紫穗槐揮發(fā)油>毛麝香揮發(fā)油>假蒟揮發(fā)油>飛機草輕油>飛機草重油，其中，紫穗槐揮發(fā)油的觸殺活性最強，其24 h的LD為44.08μg/頭。雖然其對赤擬谷盜觸殺活性弱于陽性對照除蟲菊酯，但要強于一些文獻報道的揮發(fā)油，例如：Liang等[36]研究發(fā)現(xiàn)，灌木亞菊揮發(fā)油對赤擬谷盜的LDso為105.67μg/頭；吳彥等[37]研究表明，側(cè)柏葉揮發(fā)油對赤擬谷盜觸殺活性的LD為48.59μg/頭。因此，紫穗槐揮發(fā)油具有開發(fā)為植物源殺蟲劑的潛力。Luo等[38]研究發(fā)現(xiàn)，肉豆蔻醚對赤擬谷盜的觸殺活性LDso為39.48μg/頭，Cao等[39]研究表明，曠蒎烯對赤擬谷盜的觸殺活性LD為30.09μg/頭，Luo等[40]研究發(fā)現(xiàn)，γ-松油烯對赤擬谷盜的觸殺活性LD為35.60μg/頭，因此，紫穗槐揮發(fā)油主要成分曠蒎烯的觸殺活性最強，其次是毛麝香揮發(fā)油主要成分γ-松油烯，最后是飛機草輕油和重油主要成分肉豆蔻醚，由此推測，揮發(fā)油的觸殺活性與其主要成分的活性有一定的相關性。

此外，5種揮發(fā)油對赤擬谷盜均具有一定的驅(qū)避活性，且飛機草重油、假茹、紫穗槐和毛麝香揮發(fā)油的驅(qū)避活性強于陽性對照避蚊胺，其中毛麝香揮發(fā)油的驅(qū)避活性最為顯著。并且，飛機草重油、紫穗槐和毛麝香揮發(fā)油的驅(qū)避活性呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著濃度的降低，驅(qū)避率減?。伙w機草輕油、飛機草重油、假蒟和紫穗槐揮發(fā)油的驅(qū)避活性呈現(xiàn)時間依賴性，隨著時間的延長，驅(qū)避率降低。文獻已有類似報道，Guo等[41]研究7種藥物對倉儲害蟲的生物活性發(fā)現(xiàn)，蒼術、艾蒿和野薄荷揮發(fā)油的驅(qū)避活性呈現(xiàn)濃度依賴性，高良姜和草果揮發(fā)油呈現(xiàn)時間依賴性。根據(jù)驅(qū)避效率和驅(qū)避時間的不同，揮發(fā)油及其主要成分的驅(qū)避效果可分為3種模式，第一種是高效型，即在高濃度作用良好，隨著濃度降低作用效果下降；第二種是持久型，即在所有測試濃度下都表現(xiàn)出穩(wěn)定的效果；第三種是兩者兼?zhèn)鋄42]。因此，本文中假蒟揮發(fā)油屬于高效型，在高濃度時驅(qū)避活性良好，隨著濃度降低作用效果逐漸下降。飛機草輕油、飛機草重油、紫穗槐和毛麝香揮發(fā)油屬于兩者兼?zhèn)?，在高濃度時驅(qū)避活性良好，在低濃度時仍表現(xiàn)出良好的驅(qū)避作用。而陽性對照避蚊胺屬于高效型，隨著濃度降低作用效果下降。因此，飛機草輕油、飛機草重油、紫穗槐和毛麝香揮發(fā)油的驅(qū)避活性比陽性對照更為顯著可能是由于其兼具高效型和持久型的特點。

綜上所述，本文研究了飛機草、假蒟、紫穗槐和毛麝香揮發(fā)油的化學成分組成及其對倉儲害蟲赤擬谷盜的觸殺和驅(qū)避活性。結(jié)果表明，紫穗槐揮發(fā)油的觸殺活性最為顯著，毛麝香的驅(qū)避作用效果最好。以上結(jié)果為這4種植物作為植物源農(nóng)藥提供理論基礎，但其抗蟲機制還需進一步研究。