陜西省番茄黃化曲葉病毒基因間隔區(qū)缺失突變體的鑒定與不同分離物間群體進化研究

潘嵩　魏佩瑤　劉晨等

中圖分類號：S 432. 41；S436. 412.11 文獻標識碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh 2022320

由番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起的番茄黃化曲葉病是番茄生產上最為嚴重的病害之一，每年給中國和世界上其他的主要番茄產區(qū)造成重大損失[1-3]。TYLCV屬于雙生病毒科Gemini-oiridae菜豆金黃花葉病毒屬Begomo-oirus，是一種單組分DNA病毒，具有一個環(huán)狀單鏈基因組。其基因組有6個開放閱讀框，編碼6個與病毒侵染和復制相關的蛋白。其中病毒鏈基因分別編碼AV1（病毒的外殼蛋白）與AV2（與病毒的移動相關）；互補鏈基因分別編碼AC1（復制相關蛋白）、AC2（轉錄激活蛋白）、AC3（復制增強蛋白）和AC4（與AV2共同參與病毒DNA跨膜運輸與病毒移動）。AC1與AV2之間的區(qū)域為基因間隔區(qū)（intergenic region，IR），是TYLCV復制起始位點與轉錄起始信號所在區(qū)域。

TYLCV由帶毒煙粉虱Bemisia tabaci通過持久性方式傳播[4]，番茄感染TYLCV后會出現(xiàn)植株矮化、葉片卷曲、斑駁和黃化等癥狀，最終導致番茄產量下降[5-6]。在我國，TYLCV于2006年首次在上海被發(fā)現(xiàn)[3]，隨后由南向北、由東向西快速擴散。目前，我國已有19個省、自治區(qū)和直轄市報道了TYLCV的發(fā)生和分布。選育抗病品種是防治番茄黃化曲葉病的根本措施，然而，2018年以來，全國多個番茄產區(qū)出現(xiàn)了抗病品種抗性下降甚至喪失的現(xiàn)象。造成這一現(xiàn)象的可能原因之一是TYLCV分離物基因組發(fā)生變異，從而使其產生適應性進化。

自1991年首次獲得以色列分離物TYLCV-IL的全長基因組序列以來[7]，已有較多關于TYLCV分離物基因組的報道[8-14]。在我國，許多地區(qū)的TYLCV分離物基因組序列也被相繼報道[15-20]。然而，有關TYLCV基因組IR區(qū)缺失的報道依然較少[21-22]。在GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的來自中國的TYLCV分離物基因組序列中，目前只有來自北京的分離物BJ04與BJ06報道了IR區(qū)大片段缺失的情況[22]。本研究從陜西省4個番茄產區(qū)采集了24份表現(xiàn)為番茄黃化曲葉病癥狀的樣品，并對15份樣品中的TYLCV分離物基因組序列進行測序及系統(tǒng)進化分析，旨在為明確陜西省TYLCV分離物基因組變異情況及番茄黃化曲葉病毒病的有效防控提供參考。

1材料與方法

1.1植物材料

2021年6月-10月，分別在陜西省渭南市大荔縣、西安市閻良區(qū)、咸陽市涇陽縣和楊凌區(qū)的大棚和日光溫室中調查番茄黃化曲葉病發(fā)病情況。對發(fā)病癥狀明顯的番茄植株進行拍照，采集發(fā)病葉片并記錄番茄品種、采集地點和日期。采集的樣品帶回實驗室置于-80℃保存。

1.2番茄樣品DNA提取

采用改良的CTAB方法[23]提取番茄葉片DNA，提取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增、克隆與測序

將提取的番茄DNA用無菌水稀釋20倍作為模板，采用TYLCV分離物AC2基因的特異性引物TY-DF1/TY-DR1（5′-CATGATCAACTGCTCT-GATTACA-3'／5′-TCATTGATGACGTAGACCC-G-3′） [14]進行擴增。PCR反應條件為：95℃5 min;95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后回收純化（DNA純化試劑盒購自TIANGEN公司），連接至pMD19-T載體（TaKaRa公司）上，轉化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞（TIANGEN公司）中，37 0C條件下，在含有100μg／mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h。挑取單克隆菌落至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h。經過菌液PCR篩選后，選取3個陽性克隆送北京擎科生物公司進行序列測定。

根據(jù)目的片段的測序結果，設計TYLCV基因組全長擴增引物TY-CG-F/TY-CG-R（5′-TCGTCTAGATATTCCCTATATGAG-3′/5′-AT-TCAGATAAGATTCAACCACA-3′），以稀釋后的DNA為模板進行擴增。PCR擴增條件為：95℃5 min; 95℃30 s，52℃45 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃10 min。目的片段回收純化、連接和測序方法同上。

1.4序列分析

使用DNAMAN 6.0對TY-DF1/TY-DR1與TY-CG-F/TY-CG-R擴增得到的DNA片段進行拼接，獲得TYLCV的AC2基因和基因組全長片段。TYLCV分離物基因組的多序列比對通過DNA-MAN及ClustaIW軟件進行；利用DnaSP 6.0進行基因組變異分析；在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：∥WWW.ncbi.nlm.nih. gov／）下載TYLCV分離物基因序列，利用MEGA 6.0中鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設置為2000次。

2結果與分析

2.1番茄樣品癥狀與TYLCV檢測

2021年6月-10月，對陜西省渭南市大荔縣、西安市閻良區(qū)、咸陽市涇陽縣和楊凌區(qū)日光溫室和大棚中番茄樣品感染TYLCV狀況進行調查發(fā)現(xiàn)，各番茄種植地區(qū)的不同番茄品種上均出現(xiàn)了較為明顯的番茄黃化曲葉病癥狀。具體表現(xiàn)為番茄植株矮化，番茄新葉出現(xiàn)明顯的斑駁、皺縮和黃化，部分樣品的葉片則呈現(xiàn)了簇縮狀（圖1）。采集24份具有明顯番茄黃化曲葉病癥狀的葉片樣品，其中抗病品種樣品20份，感病品種樣品4份（表1），帶回實驗室后置于－80℃保存。

以番茄葉片樣品DNA為模板，采用TYLCV特異性引物TY-DF1／TY-DR1進行PCR擴增。結果顯示，24個樣品均可以擴增到695 bp的特異性條帶（圖2）。對擴增得到的條帶進行純化、克隆和測序，并將所得到的測序結果在NCBI上進行BLAST序列比對，結果表明，擴增片段均為TYLCV的AC2基因。

2.2 TYLCV分離物基因組的克隆和初步分析

選取‘瑞星大寶’‘金棚1828’‘金棚秋盛’‘桑粉180' 21C-8’‘金棚101’‘ 21YF-14’‘金棚8號’‘金棚148‘T2108-2’‘T2105-1‘S42-3-2-1’‘金棚21-02’‘2019w-120’‘443-21-1-1’共15份TYLCV檢測陽性的番茄樣品，采用引物TY-CG-F/TY-CG-R進行擴增，分別得到了15個TYLCV分離物的基因組全長序列并上傳GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得的序列登錄號見表1。其中DL-1、DL-2、DL-3、JY-2、JY-3、YAL-1和YL-7分離物基因組大小為2 781 bp；而JY-1、JY-4、JY-6、YL-2、YL-4、YL-5、YL-6和YL-11分離物基因組大小為2 768 bp。15個分離物基因組均編碼6個開放閱讀框，基因組間序列一致性為99.35%。通過在NCBI上進行BLAST序列比對，所得的分離物基因組均與已報道的TYLCV分離物基因組同源性最高。選取所得到的15個TYLCV分離物，以及代表性的TYLCV分離物TYLCV-Israel- China、TYLCV-Gezira、TYLCV-Iran、TYL-CV-MLD和TYLCV-OM構建基因組系統(tǒng)進化樹。結果顯示，所得到的15個TYLCV分離物均與TYLCV-Israel-China分離物處于同一個分支，屬于TYLCV-Israel分離物種群（圖3）。

2.3TYLCV基因間隔區(qū)缺失突變體基因組差異分析

進一步對基因組大小不同的兩類TYLCV分離物進行序列比對與分析，發(fā)現(xiàn)8個基因缺失突變體也含有AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4 6個開放閱讀框。與2781 bp的正?；蚪M相比，8個基因缺失突變體均是在IR區(qū)2707-2719 nt處出現(xiàn)了13個核苷酸的缺失，缺少序列為TTGTA-AAAGTACA。該缺失位置位于IR區(qū)TATA-box與保守的9核苷酸序列（nonanucleotide motif）之間（圖4）。在IR區(qū)，除出現(xiàn)13個核苷酸缺失外，TYLCV基因間隔區(qū)缺失突變體與2781 bp基因組分離物之間的差異還表現(xiàn)為：缺失突變體在2 596 nt位點處核苷酸為A，而在2781 bp分離物中，除YAL-1分離物該位點為A外，其他6個分離物均為T；TYLCV缺失突變體在2 688 nt處核苷酸為T，在2 781 bp基因組分離物中，只有DL-3該位點為T，DL-1、DL-2、YAL-1和YL-7分離物該位點為G，而JY-2和JY-3分離物該位點為C。15個TYLCV分離物在IR區(qū)核苷酸一致性為97.45%。

在編碼蛋白的氨基酸差異方面，15個TYLCV分離物間AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4的編碼蛋白一致性較高，分別為99.88%、99.84%、99.40%、99.31%、99.21%和99.16%。一些主要的氨基酸差異位點為：在AC1蛋白的第6位氨基酸處，TYLCV基因間隔區(qū)缺失突變體編碼氨基酸為Leu，而2781 bp基因組分離物中，除YAL-1分離物該位點氨基酸為Leu外，其他6個分離物該位點均為Ile；在AC2蛋白第26位氨基酸處，2781 bp基因組分離物編碼氨基酸為Pro，而在基因間隔區(qū)缺失突變體中，除JY-4、YL-4和YL-11分離物該位點編碼氨基酸為Pro外，其他5個基因間隔區(qū)缺失突變體該位點為Ala；在AC4蛋白第14位氨基酸處，TYLCV基因間隔區(qū)缺失突變體編碼氨基酸為Ser；而2781 bp基因組分離物中，除YAL-1與DL-1分離物該位點編碼氨基酸為Ser外，其他5個分離物該位點均為Asn。

2.4 TYLCV分離物的群體變異與進化分析

選取來自我國19個地區(qū)的35個TYLCV分離物，與本研究分離得到的15個TYLCV分離物進行基因組全序列比對，發(fā)現(xiàn)不同分離物間核苷酸一致性為98.31%，說明TYLCV在我國的進化比較保守。為進一步分析不同分離物在基因組不同區(qū)域的變異情況，采用DnaSP 6.0軟件對上述50個TYL-CV分離物全基因組序列變異情況進行了分析，結果顯示，我國TYLCV分離物基因組的變異在基因組不同區(qū)域的差異較大。IR區(qū)域是基因組變異發(fā)生最為頻繁的區(qū)域，除此之外AC2與AC3基因的重疊區(qū)域，AC1與AC4基因的重疊區(qū)域，都是TYLCV基因組變異發(fā)生較為頻繁的區(qū)域。與之相反，AV1基因的前端與后端區(qū)域，AC1基因的后端區(qū)域，都是核苷酸序列相對保守的區(qū)域（圖5）。

目前，我國已有19個省、自治區(qū)與直轄市的TYLCV分離物的全長基因組序列被報道。為進一步分析本研究分離到的TYLCV IR缺失突變體的可能來源，我們選取了來自國內不同地區(qū)的50個TYLCV分離物，4個國外的代表性TYLCV分離物以及15個國外典型TYLCV-Israel分離物的全基因組序列，通過MEGA 6.0進行序列比對并構建系統(tǒng)進化樹（圖6）。結果顯示，來自我國的TYLCV分離物中，除廣西分離物TYLCV-GXBS3與TYL-CV-GXBS1外，其他48個分離物均與TYLCV-Is-rael分離物聚為一支，為TYLCV-Israel分離物進化過程中出現(xiàn)的分支種群。從進化樹上看，目前已報道的TYLCV-Israel分離物種群分為3個主要的亞群，分別為Cl亞群、C2亞群和Wl亞群。其中Cl亞群和C2亞群均主要由TYLCV中國分離物構成，而Wl亞群則由TYLCV-Israel國外分離物構成。在Cl和C2亞群中，根據(jù)進化關系，又分別分為2個亞群，分別為Cl亞群中的CH1和CH2亞群，以及C2亞群中的CH3和CH4亞群。DL-2和YL-7分離物屬于CH1亞群，其與TYLCV湖北分離物TYLCV-HuBWHl親緣關系較近。而本研究分離到的8個IR區(qū)缺失突變體以及DL-1、DL-3、JY-2、JY-3分離物共同構成了CH2亞群，其親緣關系較近，表明本研究分離得到的IR缺失突變體可能是由本地正常TYLCV分離物突變而來。YAL-1分離物則位于CH3亞群，與TYLCV山東分離物TYL-CV-SDQD親緣關系較近。本研究獲得的15個TYLCV分離物均與之前報道的陜西分離物TYL-CV-SHX1和TYLCV-SHX2親緣關系較遠，表明TYLCV陜西分離物的來源可能比較分散。從不同亞群分離物分布的地理區(qū)域來看，可以初步看出在Cl亞群中的國內TYLCV分離物與日本分離物TYLCV-Israel-Japan親緣關系最為接近，而C2亞群中的國內TYLCV分離物與墨西哥分離物TYL-CV-Israel-Mexico更為接近。

3結論與討論

目前，關于TYLCV分離物基因組已有較多的研究。根據(jù)地區(qū)和序列的差異，一般將TYLCV分為TYLCV-Israel、TYLCV-Gezira、TYLCV-Iran、TYLCV-MLD和TYLCV-OM 5個典型株系[24]。據(jù)報道，我國的TYLCV分離物大多屬于TYLCV-Israel株系[16-18， 25-27]，是TYLCV-Israel分離物進化過程中出現(xiàn)的分支種群。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列登錄信息，我國所報道的絕大多數(shù)TYLCV分離物基因組大小為2781 bp，只有極少的TYLCV分離物基因組小于2781 bp[20，22]，且沒有來自不同地區(qū)的多個TYLCV分離物同時發(fā)生IR區(qū)大段基因片段缺失的報道。

本研究從陜西省不同地區(qū)感染TYLCV的番茄樣品中分離得到了15個TYLCV分離物，并發(fā)現(xiàn)了一類基因間隔區(qū)缺失核苷酸的TYLCV突變體。該突變體在基因組IR區(qū)2707-2719 nt處缺失13個核苷酸，缺失位置位于TATA-box與保守的9核苷酸序列之間。相較于TYLCV基因組編碼的其他基因，有關IR區(qū)功能的研究依然較少。與已報道的TYLCV北京分離物基因間隔區(qū)缺失突變體BJ04（2713-2753 nt位置缺失）相比，本研究的IR區(qū)缺失突變體的缺失序列位置與BJ04相近。前期研究結果顯示，與正常基因組大小的分離物BJ03相比，BJ04的致病能力不同可能是由于IR區(qū)片段缺失引起的[22]。然而，由于本研究在進行TYLCV發(fā)生調查時，多個生產區(qū)番茄品種上番茄黃化曲葉病已經發(fā)生較為嚴重，且一些正?；蚪M大小的TYLCV分離物與TYLCV IR缺失突變體分離自相鄰發(fā)病田塊，因此，難以判斷所分離到的IR缺失突變體是否引起TYLCV致病力的變化，還需要進一步通過構建不同分離物的侵染性克隆等試驗來加以研究和證實。

值得注意的是，本研究分離到的8個TYLCV基因間隔區(qū)缺失突變體分別來自涇陽縣與楊凌區(qū)，表明這類基因缺失突變體并不只在單獨的地點出現(xiàn)，而是已經在更廣泛的地域范圍內發(fā)生。為了對其變異與進化關系進行進一步的研究，我們對得到的15個分離物與來自國內不同地區(qū)的35個TYL-CV分離物進行了基因組水平的核苷酸變異分析，發(fā)現(xiàn)我國的TYLCV分離物整體上進化保守，最大的變異峰值在IR區(qū)域。同時，我們選取了54個國內外不同地區(qū)的TYLCV典型分離物序列，與本研究分離到的15個TYLCV分離物進行了群體進化分析。結果顯示，與國內其他TYLCV分離物類似，15個TYLCV分離物均屬于TYLCV-Israel株系分支。不同的是，國內報道的IR缺失突變體BJ04與BJ06處于1個分支，而本研究分離到的8個TYL-CV IR突變體處于不同亞群的分支之中，親緣關系相對較遠。與之相應的是，8個TYLCV IR突變體與本研究分離的4個正常基因組大小的TYLCV分離物親緣關系最近，表明這類TYLCV IR突變體更有可能是由陜西本地的TYLCV分離物突變而來。同時，除YAL-1分離物外，其他14個分離物均具有較近的親緣關系，與之前報道的陜西省TYLCV分離物TYLCV-SHX1和TYLCV-SHX2的親緣關系都相對較遠，表明陜西省TYLCV分離物可能有多個來源。

TYLCV基因組變異頻繁，而這可能與外部的選擇壓力有關[14， 28-29]。近年來，番茄生產種植中各類抗病品種大規(guī)模使用可能使原有的TYLCV分離物出現(xiàn)適應性變異，產生致病能力更強的毒株。2018年后，國內多個番茄產區(qū)出現(xiàn)了原有抗病番茄品種抗性下降甚至喪失的現(xiàn)象，其原因之一就是原有TYLCV分離物基因組發(fā)生了變異。因此，及時掌握番茄產區(qū)TYLCV分離物基因變異情況，分析并檢測其可能導致的致病能力變化，對篩選番茄薪抗病品種，從而保障我國番茄生產安全是十分必要的。