外源ACC通過激活乙烯合成及信號轉(zhuǎn)導誘導小豆抗銹性

章國慶　殷麗華　孫治國等

關鍵詞 小豆； 豇豆單胞銹菌； 誘導抗性； 乙烯信號通路； 活體營養(yǎng)型真菌

中圖分類號： Ｓ４３５．２１ 文獻標識碼： Ａ DIO： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２３１６

小豆Vigna angularis是我國傳統(tǒng)的雜糧作物， 大約于１２０００年前起源于中國［１］，至今已有近千年的栽培歷史。小豆因適應性廣、耐瘠薄、可固氮養(yǎng)地等優(yōu)點［２］，常以混／間作或輪作的方式改善土壤氮素狀況，在現(xiàn)代種植業(yè)結構調(diào)整中發(fā)揮重要作用。黑龍江省作為我國最大的小豆產(chǎn)區(qū)，年均產(chǎn)量占國內(nèi)總產(chǎn)量的４２．８２％［３］。然而，由活體營養(yǎng)型真菌豇豆單胞銹菌Uromyces vignae引起的小豆銹?。郏矗荩陙碓诤邶埥「餍《巩a(chǎn)區(qū)嚴重發(fā)生，導致葉片提前脫落和植株早衰，嚴重影響小豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。培育抗病品種，合理利用品種抗性是防治作物銹病最為經(jīng)濟有效的措施。植物抗病性通常源于其自身抗性和外界因素的誘導，后者即為誘導抗性，水楊酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ，ＳＡ）、乙烯（ｅｔｈｙｌｅｎｅ，ＥＴ）、茉莉酸（ｊａｓｍｏｎｉｃａｃｉｄ，ＪＡ）等植物類激素作為抗病誘導劑已被廣泛應用［５６］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，外源１-氨基環(huán)丙烷-１-羧酸（１-ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ-１-ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ，ＡＣＣ）、ＳＡ、茉莉酸甲酯（ｍｅｔｈｙｌｊａｓｍｏｎａｔｅ，ＭｅＪＡ）等可顯著提高小豆抗銹性，其中ＡＣＣ的誘抗效果最好［７］。

植物內(nèi)源乙烯的合成始于甲硫氨酸（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍｅｔ），Ｍｅｔ在犛腺苷甲硫氨酸合成酶（S-ａｄｅ-ｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＡＤＳ）的催化下生成犛腺苷甲硫氨酸（S-ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＡｄｏＭｅｔ），隨后ＡｄｏＭｅｔ在ＡＣＣ合酶（１-ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ-１-ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＣＳ）的作用下形成乙烯前體ＡＣＣ，ＡＣＣ 最終在ＡＣＣ 氧化酶（ＡＣＣ ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＣＯ）的作用下生成乙烯［８］，ＡＣＳ將ＡｄｏＭｅｔ轉(zhuǎn)化為ＡＣＣ是乙烯生物合成的第一步，也通常被認為是乙烯生物合成的限速步驟［９］。植物內(nèi)源乙烯形成后，首先和位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的ＥＴＲ１ （ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅ-ｓｐｏｎｓｅ１）等受體結合，導致ＣＴＲ１（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｔｒｉ-ｐｌｅｒｅｓｐｏｎｓｅ１）蛋白失活，進而誘發(fā)ＥＩＮ２（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ２）去磷酸化，隨后ＥＩＮ２的Ｃ末端結構域被釋放進入細胞核，在核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子ＥＩＮ３（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ３）和乙烯不敏感樣蛋白１（ＥＩＮ３-ｌｉｋｅ１，ＥＩＬ１），進而激活下游乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子（ｅｔｈｙｌｅｎｅ-ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｆａｃｔｏｒ，ＥＲＦｓ）的表達，ＥＩＮ２和ＥＩＮ３在乙烯信號通路中發(fā)揮核心正調(diào)控作用［１０］。外源ＡＣＣ則可通過激活乙烯信號通路在植物免疫中發(fā)揮功能。如外源ＡＣＣ可誘導湖北海棠Malus hupehensis MhWRKY1基因在葉、莖和根中顯著上調(diào)表達，同時誘導蘋果對輪紋病菌Botryo-sphaeria dothidea的侵染產(chǎn)生抗性，而MhWRKY1在乙烯介導的抗病信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用［１１］。此外，１００μｍｏｌ／ＬＡＣＣ也可通過誘導番茄中Solanum lycopersicum乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子ＥＲＦ 家族基因SlERF.A1、SlERF.A3、SlERF.B4和SlERF.C3等的表達，提高番茄對灰霉病菌Botrytis cinerea的抗性［１２］。乙烯調(diào)節(jié)植物抗性與其信號通路下游乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子的激活密切相關。如小麥Trutucyn aestuvum中乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子TaPIE1的表達受病菌侵染的誘導，并通過調(diào)節(jié)乙烯信號通路下游防衛(wèi)相關基因（PR２、PR4、PR１０等）的表達正調(diào)控小麥對紋枯病菌Rhizoctomia cerealis的抗性［１３］。在大豆Glycine max中過表達GmERF5基因，可顯著誘導防衛(wèi)反應基因PR１０、PR１-１和PR１０-１等的表達，提高大豆對大豆疫霉Phytophthoru sojae的抗性［１４］。上述研究表明，ＡＣＣ誘導的植物對死體營養(yǎng)型病原菌的抗性與乙烯信號通路的激活密切相關，這與長期以來認為乙烯信號通路主要參與植物應答死體或半活體營養(yǎng)型真菌的觀點一致［１５１６］。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，乙烯信號通路在小麥應答白粉菌Blumeria graminis f.sp.tritici侵染中同樣發(fā)揮重要作用。如異位表達乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子ERF1-V可顯著提高小麥對白粉菌的抗性［１７］。另有研究表明，小麥TuMYB４６L-TuACO3犔犜狌犃犆犗３互作調(diào)控乙烯合成，進而提高小麥對白粉病的抗性［１８］。顯然，乙烯信號通路在植物應答活體營養(yǎng)型真菌中也同樣發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

外源ＡＣＣ可誘導小豆抗銹性。為深入解析乙烯合成及其信號轉(zhuǎn)導在ＡＣＣ誘導小豆抗銹病中的作用，本研究應用外源ＡＣＣ激發(fā)處理小豆真葉，于處理后不同時間采用ＲＴ-ｑＰＣＲ 技術分析小豆內(nèi)源乙烯合成及信號通路關鍵基因的表達模式，進一步于ＡＣＣ激發(fā)處理后挑戰(zhàn)接種銹菌，分析接種后不同時間乙烯信號通路下游防衛(wèi)反應基因的表達模式，旨在為深入探索ＡＣＣ誘導植物抗病的分子機理提供參考，為解析乙烯信號通路在植物抵抗活體營養(yǎng)型真菌中的作用提供新證據(jù)。

１材料與方法

１．１供試材料

小豆高感銹病品種‘寶清紅’（ＢＱＨ）由黑龍江八一農(nóng)墾大學國家雜糧工程技術中心種質(zhì)資源研究室提供；豇豆單胞銹菌分離株ＺＸＬ０１，由黑龍江八一農(nóng)墾大學植物免疫研究室分離純化。

１．２供試植株培育

挑選籽粒飽滿無病的ＢＱＨ 種子，預先在２５℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，待種子萌動后，種植于直徑１６ｃｍ 的營養(yǎng)缽內(nèi)，置于晝（２５±２）℃／夜（２０±２）℃，光周期為Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ的溫室內(nèi)培養(yǎng)，待小豆真葉展開度達６０％～７０％時備用。

１．３試驗方法

１．３．１ ＡＣＣ處理及樣品采集

選取長勢一致的小豆幼苗，參考康靜等［７］的方法，以０．２５ｍｇ／ｍＬＡＣＣ（源葉生物科技有限公司）處理小豆真葉，噴施量以葉片表面潤濕但不成股流下為準，以噴施無菌水為對照，處理后置于（２５±２）℃的保濕桶內(nèi)培養(yǎng)１２ｈ，隨后將植株置于晝（２５±２）℃／夜（２０±２）℃，光周期為Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ的溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。處理后每天觀察小豆植株的形態(tài)，同時于處理后０、２、３、４ｄ和７ｄ分別取樣，每處理３次重復，每重復選?。粗?，樣品經(jīng)液氮速凍后－８０℃保存?zhèn)溆?，用于乙烯合成（VaACS1）及乙烯信號通路關鍵基因（VaE1N2、VaE1N3和VaERF5）的表達分析。

１．３．２ ＡＣＣ激發(fā)處理與銹菌挑戰(zhàn)接種

按１．３．１的方法，采用０．２５ｍｇ／ｍＬＡＣＣ激發(fā)處理小豆真葉，激發(fā)處理后２ｄ參考鄭素嬌等［４］的方法，用１×１０ 個／ｍＬ的夏孢子懸浮液，噴霧法進行挑戰(zhàn)接種，噴施量以葉片表面潤濕但不成股流下為準，以ＡＣＣ激發(fā)處理后接種無菌水為對照，同時設置水處理（未激發(fā)）接種銹菌和水處理（未激發(fā)）不接種的對照。接種后將小豆植株置于（２０±２）℃的保濕桶內(nèi)黑暗培養(yǎng)２４ｈ，隨后將植株置于晝（２５±２）℃／夜（２０±２）℃，光周期為Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ的溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，于接種后１２ｄ參考Ｓｔａｖｅｌｙ［１９］的方法，分析不同處理小豆葉片的發(fā)病情況和夏孢子堆產(chǎn)生情況，明確ＡＣＣ激發(fā)處理對小豆抗銹性的影響。于挑戰(zhàn)接種后０、０．５、１、２、５ｄ和８ｄ取接種的真葉，每處理３次重復，每重復選?。粗?，樣品經(jīng)液氮速凍后－８０℃保存?zhèn)溆?，用于防衛(wèi)反應基因犞犪犘犚２和犞犪犘犚４的表達模式分析。

１．３．３小豆樣品總ＲＮＡ 提取及基因表達分析

采用ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）法提取各樣品總ＲＮＡ，并用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）合成ｃＤＮＡ。參考Ｃｈｉ等［２０］的方法，以VaACT為內(nèi)參基因，參考ＴＨＵＮ-ＤＥＲＢＩＲＤＳＹＢＲＧｒｅｅｎ試劑盒說明書進行ＰＣＲ擴增。實時熒光定量ＰＣＲ 反應體系（１０μＬ）：ＳＹＢＲＰｒｅｍｉx Ｅｘ Taq５．０μＬ，上、下游引物各０．５μＬ，模板ｃＤＮＡ１μＬ，ｄｄＨＯ 補足１０μＬ。擴增在ＣＦＸ９６實時熒光定量ＰＣＲ 儀上進行，反應程序：９５℃預變性１ｍｉｎ；９５℃變性１５ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，４０個循環(huán)。每處理重復３次，采用２犆狋法［２１］計算基因的相對表達量。本研究分析的基因及其引物見表１，引物由賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成。

１．３．４數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用ＳＰＳＳ２２．０軟件進行，所得數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示，采用獨立樣本狋測驗和單因素方差分析比較差異顯著性（α＝０．０５）。

２ 結果與分析

2．１外源犃犆犆處理對小豆生長及乙烯合成和信號通路基因表達的影響

以高感銹病小豆品種ＢＱＨ 為材料外源噴施０．２５ｍｇ／ｍＬＡＣＣ，處理后２ｄ小豆幼苗頂端出現(xiàn)明顯的彎鉤（圖１），頂端彎鉤加劇是植物應答激素乙烯的“三重反應”之一［２２］。進一步利用ＲＴ-ｑＰＣＲ分析不同處理乙烯生物合成關鍵基因犞犪犃犆犛１的表達情況，結果表明，ＡＣＣ處理后２ｄ，VaACS1的表達量顯著升高，并持續(xù)升高至處理后４ｄ，處理后７ｄ，ＶａＡＣＳ１的表達量雖有所下降但仍顯著高于對照（圖２ａ）。對乙烯信號通路關鍵基因VaEIN２、VaEIN3和VaERF5的表達分析發(fā)現(xiàn)，VaEIN２的表達同樣受外源ＡＣＣ 的誘導，于ＡＣＣ 處理后２ｄ顯著升高，處理后３ｄ表達量達到峰值，隨后有所下降，但到處理后７ｄ仍顯著高于對照（圖２ｂ）；VaEIN3表達水平的變化趨勢和VaEIN２類似，處理后２ｄ顯著上調(diào)表達，處理后４ｄ達到峰值后下降，至處理后７ｄ表達量仍顯著高于對照（圖２ｃ）；VaERF5作為乙烯信號通路下游的乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子，其顯著上調(diào)表達的時間稍有滯后，于處理后３ｄ表達量顯著升高達到峰值，處理后４ｄ表達量雖有所下降但仍顯著高于對照，至處理后７ｄ再次下降后顯著低于對照（圖２ｄ）。

２．２外源犃犆犆激活防衛(wèi)反應基因的表達，參與小豆抗銹性

ＡＣＣ激發(fā)處理后２ｄ挑戰(zhàn)接種豇豆單胞銹菌，接種后１２ｄ，未激發(fā)處理接種的小豆真葉發(fā)病嚴重，葉片表面布滿褐色夏孢子堆（圖３ａ），ＡＣＣ激發(fā)處理后２ｄ挑戰(zhàn)接種的葉片發(fā)病則明顯減輕（圖３ｂ）。對不同處理葉片表面夏孢子堆數(shù)的統(tǒng)計結果表明（圖３ｃ），ＡＣＣ 激發(fā)處理后挑戰(zhàn)接種的葉片夏孢子堆數(shù)僅為９．９１個／１．５ｃｍ，顯著低于對照處理的４０．６２個／１．５ｃｍ。

在明確ＡＣＣ顯著提高小豆抗銹性的基礎上，應用ＲＴ-ｑＰＣＲ技術分析了ＡＣＣ激發(fā)處理后２ｄ挑戰(zhàn)接種豇豆單胞銹菌的葉片防衛(wèi)反應基因表達模式。結果表明，水處理（未激發(fā)）后接種銹菌的葉片中，VaPR2的表達水平總體偏低，接種后０．５ｄ和１ｄ的表達量顯著低于水處理不接種的對照，但水處理接種銹菌后５ｄ和８ｄ，VaPR2的表達水平升高，顯著高于水處理不接種對照（圖４）。此外，ＡＣＣ激發(fā)處理２ｄ后挑戰(zhàn)接種的葉片中，VaPR2的表達量于接種后１ｄ即顯著升高達到峰值，隨后雖有所下降，但與ＡＣＣ激發(fā)后不挑戰(zhàn)接種的處理比，VaPR2仍維持較高的表達水平。

VaPR4表達分析的結果表明，在水處理接種銹菌的葉片中，除接種后０．５ｄ外，VaPR4在接種后不同時間的相對表達水平與水處理未接種對照間均無顯著差異（圖５）。而ＡＣＣ激發(fā)后挑戰(zhàn)接種的葉片中，VaPR4的總體表達水平較高，且自挑戰(zhàn)接種銹菌后１ｄ開始，其相對表達量即顯著高于水處理不接種、水處理接種及ＡＣＣ激發(fā)不挑戰(zhàn)接種等處理，VaPR4的表達峰值出現(xiàn)在ＡＣＣ激發(fā)挑戰(zhàn)接種后第８天（圖５）。

比較分析VaPR2和VaPR4在不同處理條件下的相對表達水平發(fā)現(xiàn)，ＡＣＣ激發(fā)處理后挑戰(zhàn)接種銹菌，VaPR4響應銹菌侵染時的表達水平更高，應答更為及時。

３結論與討論

植物誘導抗性是一種普遍存在的由植物基因調(diào)控的特性，越來越多的研究證實通過生物或化學誘導因子提升植物抗性是防治植物病害的一種有效途徑［２３］。研究表明，在植物培養(yǎng)基中添加ＡＣＣ 可誘發(fā)植物表現(xiàn)頂端彎鉤加劇、下胚軸增粗和莖伸長被抑制等乙烯“三重反應”［２４］。本研究發(fā)現(xiàn)，外源ＡＣＣ激發(fā)處理后２ｄ即觀察到小豆幼苗出現(xiàn)明顯的頂端彎鉤加劇現(xiàn)象，對VaACS1基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，外源ＡＣＣ 誘導VaACS1顯著上調(diào)表達，表明外源ＡＣＣ促進了小豆內(nèi)源乙烯的合成。進一步分析發(fā)現(xiàn)，外源ＡＣＣ 同時誘導了VaEIN２、VaEIN３ 和VaERF５表達水平顯著上調(diào)，表明ＡＣＣ激活了小豆乙烯信號通路。乙烯信號級聯(lián)的下游，乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子（ＥＲＦ）家族成員在植物防御調(diào)節(jié)中發(fā)揮主導作用。如在擬南芥Arabidopsis thaliana中過表達或沉默ＥＲＦ轉(zhuǎn)錄因子，可提高或抑制擬南芥對灰葡萄孢Botrytis cinerea、尖鐮孢Fusarium oxysporum等真菌的抗性［２５］。在煙草中過表達NtERF5可顯著提高煙草對煙草花葉病毒（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）的抗性［２６］。綜上所述，外源ＡＣＣ 激活了小豆乙烯信號通路，并可能通過ＥＲＦ轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控小豆抗銹性。然而，一般認為乙烯信號通路主要在植物對死體或半活體營養(yǎng)型真菌抗性中發(fā)揮功能［２７］。且有研究發(fā)現(xiàn)，乙烯不僅無法誘導煙草對白粉菌Oidium neolycopersici產(chǎn)生抗性，還會導致番茄對活體營養(yǎng)型卵菌煙草霜霉Peronospora tabacina更加敏感［１５］。但近期的一項研究發(fā)現(xiàn)，小麥ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄因子TuMYB46L可與TuACO3互作促進乙烯的合成，進而提升一粒小麥Triticum monococcum對白粉菌B.graminis f.sp.tritici的抗性［１８］，說明乙烯信號通路在植物應答活體營養(yǎng)型真菌中同樣發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

乙烯信號通路調(diào)控植物抗性最終是通過誘導多種防衛(wèi)反應基因的表達實現(xiàn)的，包括病程相關蛋白編碼基因PR1-5、PR12-13等［１６］，且PR4的表達可能依賴乙烯信號通路［２８］。本研究分析表明，先用ＡＣＣ激發(fā)后再接種銹菌，VaPR2和VaPR4的表達量在銹菌侵染早期即顯著升高，并始終維持較高水平。與本研究相似，在小麥-白粉菌互作體系中，外源乙烯同樣可誘導小麥幾丁質(zhì)酶基因（PR４）的表達提升幾丁質(zhì)酶活性，進而誘導小麥對白粉菌的抗性［１８］。除PR４外，乙烯也可顯著提高豆科植物葉片中β-１，３-葡聚糖酶基因（PR２）的表達［２９］。上述結果說明，ＡＣＣ處理可激活小豆內(nèi)源乙烯信號通路，誘導下游ＥＲＦ轉(zhuǎn)錄因子的表達，最終促進防衛(wèi)反應基因的表達，誘導小豆抗銹性。

然而，課題組前期采用乙烯信號通路抑制劑１-甲基環(huán)丙烯（１-ＭＣＰ）和ＡＣＣ共同激發(fā)處理小豆，２ｄ后挑戰(zhàn)接種銹菌，發(fā)現(xiàn)１-ＭＣＰ抑制了小豆幼苗的“三重反應”，但不能完全抑制ＡＣＣ誘導的抗性，因而推測ＡＣＣ誘導抗銹性部分依賴乙烯信號通路［７］。這一結論與本研究不完全一致，其可能原因是１-ＭＣＰ處理２ｄ僅能部分抑制乙烯，當１-ＭＣＰ解除后小豆可恢復乙烯敏感性。如１-ＭＣＰ處理蘋果可顯著減少乙烯的生成，從而延遲果實成熟［３０］，但１-ＭＣＰ對梨和桃成熟的抑制作用僅在１-ＭＣＰ熏蒸時有效，一旦１-ＭＣＰ 解除則果實會迅速軟化［３１］。其機理可能是１-ＭＣＰ會誘發(fā)植物形成新的乙烯受體，從而在１-ＭＣＰ解除后恢復對乙烯的敏感性［３０］。

綜上所述，本研究初步證實了外源ＡＣＣ通過激活乙烯信號通路促進防衛(wèi)反應基因表達，進而提高小豆的抗銹性。研究結果豐富了乙烯信號通路調(diào)控植物應答活體營養(yǎng)型真菌的分子證據(jù)，但有關外源ＡＣＣ誘導植物免疫的分子機制，以及乙烯信號通路在植物應答不同營養(yǎng)類型病原菌中的調(diào)控機理仍需進一步試驗驗證。