N-乙酰半胱氨酸對體外循環(huán)所致大鼠肺損傷的影響及機制研究

曹惠鵑,劉 敏,張曉東,孫瑩杰*,刁玉剛

0 引言

體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass,CPB)誘發(fā)的肺損傷是心臟手術(shù)的常見并發(fā)癥之一,嚴重影響患者預后。CPB過程中,全身炎癥反應和缺血再灌注引起的氧化應激對肺組織造成損傷,可導致肺水腫、肺不張、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等嚴重疾病[1-2]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)具有抗炎、抗氧化作用,可減輕感染性休克小鼠肺損傷的嚴重程度[3],降低CPB下行心臟瓣膜置換術(shù)患者血漿肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A水平,并改善呼吸功能參數(shù)[4]。因此,本研究將NAC用于CPB大鼠,旨在探討其對CPB 所致肺損傷的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級健康成年雄性SD大鼠24只,體重350～450 g,12～16周齡,由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心提供。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(control組)、CPB組、NAC+CPB組,每組8只。本研究對實驗動物的處置均符合動物倫理學標準(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物倫理號:2014076)。

1.2 模型建立 大鼠飼養(yǎng)環(huán)境:安靜,空氣清新,溫度18～25 ℃,相對濕度55%～60%,12 h光暗循環(huán)。每天更換墊料,大鼠可自由進食和飲水。術(shù)前禁食6 h,不禁飲。大鼠稱重后,10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,大鼠翻轉(zhuǎn)反射消失后,將其固定于鼠板,行氣管插管后,連接小動物呼吸機,設定呼吸參數(shù):氧體積分數(shù)1.0,潮氣量3 ml/100 g,呼吸頻率60次/min,吸呼比1.0∶1.5,氣道峰壓9 cmH2O。穿刺部位備皮、消毒后,右股靜脈穿刺置管,經(jīng)微量輸液泵補液;尾動脈穿刺置管后接壓力傳感器,行有創(chuàng)動脈血壓監(jiān)測;右頸靜脈穿刺,將自制的帶側(cè)孔的18G導管置于右心房;22G套管針左股動脈置管,用于CPB過程中血液回輸,進行預充和血氣管理[5]。初始轉(zhuǎn)流量為25～30 ml/(kg·min),逐漸增加至100～150 ml/(kg·min),將儲血器液體平面控制在3～4 ml。轉(zhuǎn)流開始將氧氣與膜式氧合器相連,關(guān)閉呼吸機。轉(zhuǎn)流期間,維持平均動脈壓>60 mmHg,pH 7.35～7.45,動脈二氧化碳分壓35～45 mmHg,堿剩余-3～3 mmol/L,紅細胞壓積>25%。轉(zhuǎn)流時間達到1 h后,逐漸減小轉(zhuǎn)流量至停止,開啟小動物呼吸機,恢復機械通氣。實驗過程中,維持大鼠體溫在35.5～36.5 ℃。轉(zhuǎn)流結(jié)束2 h后,實驗動物生命體征平穩(wěn)視為模型建立成功。Control組只進行動靜脈置管不進行CPB,CPB組、NAC+CPB組置管并進行CPB 1 h,轉(zhuǎn)流結(jié)束后觀察2 h。NAC+CPB組在預充液中加入NAC 100 mg/kg,然后以20 mg/(kg·min)持續(xù)泵注直至轉(zhuǎn)流停止。CPB組在預充液中加入等容量的生理鹽水,轉(zhuǎn)流期間泵注等容量生理鹽水。

1.3 觀察指標 建模成功后,取大鼠股動脈血進行血氣分析,計算氧合指數(shù)(Oxygenation index,OI)和呼吸指數(shù)(Respiratory index,RI)。麻醉狀態(tài)下放血處死大鼠,開胸取左上肺葉進行濕/干重比值測定;左下肺葉經(jīng)甲醛固定,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,HE染色,在光鏡下進行病理學觀察。參照Kim等[6]的標準,對肺組織損傷程度進行評分。右肺置于液氮中,采用ELISA法檢測肺組織腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平,試劑盒均購自美國R&D公司。比色法測定肺組織丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的水平,試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。蛋白免疫印跡法檢測肺組織緊密連接蛋白claudin-4的表達情況,一抗購自美國Abcam公司,二抗工作液購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學情況 光鏡下,control組肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整,未見明顯異常,而CPB組和NAC+CPB組肺泡、肺泡腔、肺泡間隔均有不同程度的損傷。CPB組表現(xiàn)為部分肺泡壁斷裂、肺泡腔塌陷,肺泡腔內(nèi)可見炎癥細胞、紅細胞和水腫液滲出。NAC+CPB組表現(xiàn)為肺泡間隔略增寬,肺泡毛細血管略擴張,肺泡腔內(nèi)有少許炎癥細胞及紅細胞滲出。與control組比較,CPB組和NAC+CPB組肺泡間隔變厚;與CPB組比較,NAC+CPB組肺泡間隔變薄,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1和表1。

表1 各組大鼠肺泡間隔厚度、肺損傷評分、濕/干重比值及肺功能指標比較(n=8)

2.2 各組大鼠肺損傷評分、濕/干重比值及肺功能指標比較 與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組的肺損傷評分、濕/干重比值、RI增高;與CPB組比較,NAC+CPB組上述指標顯著降低,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組OI顯著降低;與CPB組比較,NAC+CPB組OI顯著升高,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織MDA、TNF-α、IL-6、SOD水平比較 與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組肺組織TNF-α、IL-6及MDA水平顯著升高;與CPB組比較,NAC+CPB組上述指標顯著降低,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組SOD水平顯著降低;與CPB組比較,NAC+CPB組SOD水平顯著升高,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織MDA、TNF-α、IL-6、SOD水平比較(n=8)

2.4 各組肺組織claudin-4蛋白表達情況比較 與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組大鼠肺組織claudin-4蛋白的表達均下調(diào),與CPB組比較,NAC+CPB組肺組織claudin-4蛋白的表達上調(diào),且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組肺組織claudin-4蛋白表達情況比較(n=8)注:*與Control組比較,P<0.05;#與CPB組比較,P<0.05

3 討論

CPB可致多個器官損傷,肺損傷是常見的并發(fā)癥之一。血液與CPB管路接觸后,血細胞、炎癥細胞及補體被激活,釋放出多種炎癥因子,誘發(fā)肺損傷;而缺血再灌注可破壞肺血管內(nèi)皮細胞,造成肺水腫,進一步加重肺損傷[5,7]。動物實驗表明,腹腔注射一定劑量的NAC,可在一定程度上降低脂多糖導致的感染性休克小鼠的肺組織炎性因子水平和肺組織病理學評分[8]。課題組的前期臨床研究發(fā)現(xiàn),在CPB前及CPB過程中應用一定劑量的NAC,可降低風濕性心臟病患者CPB下行心內(nèi)直視術(shù)的血漿肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A水平[4],改善呼吸指數(shù)、氧合指數(shù)和氣道阻力等呼吸功能參數(shù),但NAC對CPB致肺損傷的具體保護作用及機制尚不明確。

目前,CPB 誘發(fā)的炎癥級聯(lián)反應被認為是CPB所致肺損傷的主要原因,而TNF-α、IL-6和IL-8可導致多臟器功能障礙且與患者預后密切相關(guān)[7,9]。有研究表明,在CPB過程中經(jīng)肺動脈灌注TNF-α抗體,可降低兔肺組織TNF-α水平,改善氧合指數(shù)及減輕肺泡結(jié)構(gòu)的損傷程度。此外,CPB過程中肺組織缺血,CPB結(jié)束后肺組織恢復灌注所致的再灌注損傷,以及CPB時肺組織的高氧耗狀態(tài)[10],也可導致肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn),CPB后,肺組織發(fā)生了明顯的損傷性改變,存在明顯的氧化應激;而在CPB前及CPB中靜脈應用一定劑量的NAC,可以降低肺組織MDA水平,上調(diào)肺組織SOD抗氧化酶的活性,顯著減輕肺損傷。通過測量MDA、SOD及肺損傷評分評價損傷的情況,發(fā)現(xiàn)NAC通過清除氧自由基、過氧化氫等物質(zhì)發(fā)揮保護作用,降低肺損傷評分。本動物實驗發(fā)現(xiàn),在CPB前和CPB過程中應用一定劑量的NAC,可顯著降低大鼠肺組織中TNF-α和IL-6水平,提示NAC除抗氧化應激作用外,還在一定程度上降低CPB所誘發(fā)的肺組織炎癥反應。臨床研究表明,NAC可降低體外循環(huán)下?lián)Q瓣患者血漿炎性因子水平[4],而本研究進一步在肺組織水平證明NAC的抗炎作用和肺保護作用。

緊密連接是調(diào)節(jié)細胞旁屏障對水、小分子和離子通透性的頂端連接復合體成分,而調(diào)節(jié)細胞旁通透性的主要決定因素是claudin家族跨膜蛋白。緊密連接蛋白claudin形成具有不同特異性和通透性的細胞旁離子通道,組織特異性 claudin 復合物決定器官的特異性細胞旁通透性[11]。緊密連接蛋白claudin的組成和結(jié)構(gòu)也對環(huán)境應激(如炎癥)敏感,其組成和結(jié)構(gòu)的改變會影響細胞旁屏障功能,而肺泡上皮緊密連接表達下降會影響肺泡上皮細胞旁離子通道的特異性功能,無法正常轉(zhuǎn)運物質(zhì)和清除肺泡內(nèi)的液體,導致肺水腫[12-13]。本研究結(jié)果表明,CPB可誘發(fā)肺組織氧化應激及炎性反應,下調(diào)大鼠肺組織claudin-4蛋白表達,導致肺水腫;而NAC具有抗氧化和抗炎作用,能夠改善CPB大鼠的claudin-4蛋白表達和肺水腫情況。NAC可能通過抗氧化及抗炎作用減輕緊密連接蛋白claudin的環(huán)境應激,進而上調(diào)緊密連接蛋白claudin的表達,從而減輕肺水腫,發(fā)揮肺保護作用。

綜上所述,在CPB過程中應用一定劑量的NAC,可減輕CPB誘發(fā)的肺損傷,其機制可能與其抗炎、抗氧化作用及上調(diào)緊密連接蛋白claudin-4的表達有關(guān)。