食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

◎ 李昕夢(mèng)，趙相艷

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

隨著人民生活水平的提高，食品安全問(wèn)題日益引起人們的關(guān)注。在眾多的食品安全項(xiàng)目中，微生物和各種毒素所引起的環(huán)境污染日益受到人們的重視。人們開(kāi)始把目光投入食源性微生物的危害。據(jù)世界衛(wèi)生組織估算，每年全球有數(shù)億人因食物傳播疾病而死亡，而在發(fā)達(dá)國(guó)家，食品傳播疾病的發(fā)病率也很高，每年約有1/3 的人會(huì)因食物而受到影響，其中37.1%是由食物引起[1]。從全球來(lái)看，由沙門(mén)氏菌感染的病例數(shù)量明顯上升。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)，國(guó)內(nèi)70%～80%的細(xì)菌食物中毒是由沙門(mén)菌引起。微生物污染對(duì)人類(lèi)健康有很大的影響，所以，加強(qiáng)食品安全檢查是目前我國(guó)食品行業(yè)亟須認(rèn)真解決的問(wèn)題。

為了在基層推廣使用，必須盡快制定一套檢測(cè)和監(jiān)測(cè)食源性疾病的標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)的檢測(cè)手段雖然同樣具有很高的精確度和靈敏度，但是實(shí)驗(yàn)次數(shù)多、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，難以快速檢測(cè)結(jié)果?？焖贆z測(cè)技術(shù)是一種快速、方便、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，既可保證進(jìn)入市場(chǎng)的食品安全，又可增強(qiáng)食品企業(yè)的安全監(jiān)管，促進(jìn)企業(yè)可持續(xù)發(fā)展。因此，對(duì)食品中微生物進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測(cè)的技術(shù)和方法的研究與開(kāi)發(fā)已引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，近幾年，生物技術(shù)、微電子技術(shù)的飛速發(fā)展，使得食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步[2]。

1 快速檢測(cè)技術(shù)的概述

目前，農(nóng)藥、化肥、重金屬離子、生物毒素、病原菌等是我國(guó)食品安全污染的主要來(lái)源。快速檢測(cè)技術(shù)是指通過(guò)相關(guān)的儀器對(duì)樣品中的微生物組成進(jìn)行快速的檢測(cè)與分析，從定性到定量?jī)蓚€(gè)方面進(jìn)行，既能有效地提高檢測(cè)的質(zhì)量，又能確保檢驗(yàn)的科學(xué)性；可采用現(xiàn)場(chǎng)取樣和在線快速檢驗(yàn)等方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品的微生物檢驗(yàn)，避免不合格食品進(jìn)入市場(chǎng)，確保食品的安全。

目前，微生物檢測(cè)的方法多種多樣，常用的方法是培養(yǎng)法。先采樣，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)、觀察、計(jì)數(shù)，以確定食品是否受到了微生物的污染。然而，這一方法耗時(shí)較長(zhǎng)（一般要2 ～3 天，有時(shí)還要更久），這顯然不符合現(xiàn)代食品快速生產(chǎn)的要求。因而，對(duì)食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)的需求也越來(lái)越大。

2 食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)

2.1 免疫分析檢測(cè)技術(shù)

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)是放射免疫與熒光2 種檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合，該技術(shù)是將抗原或抗體吸附到同相位的載體上，然后在載體上進(jìn)行免疫酶的染色。在底物顯色后，用定量的方法測(cè)定被測(cè)物質(zhì)的含量。該方法將免疫熒光法與輻射免疫檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，具有定量、靈敏、準(zhǔn)確、標(biāo)記穩(wěn)定、適用范圍廣、結(jié)果判斷客觀、簡(jiǎn)便徹底、檢測(cè)速度快、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。

2.1.2 酶聯(lián)熒光免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)熒光免疫吸附技術(shù)是一種將酶體系與熒光免疫分析相結(jié)合的方法，以常規(guī)酶免疫法為基礎(chǔ)，以理想的熒光基質(zhì)取代原有的染色基質(zhì)，增加檢測(cè)的靈敏度，擴(kuò)大檢測(cè)范圍，降低試劑使用量。酶放大技術(shù)、固相分離和熒光檢測(cè)聯(lián)合是目前較為靈敏的一種技術(shù)。

2.1.3 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)，又稱熒光抗體技術(shù)，它是利用熒光抗體示蹤檢測(cè)抗體的一種方法，稱為熒光抗體法，而熒光抗體法是一種利用已知的熒光抗原標(biāo)志物進(jìn)行示蹤和檢查抗體的方法。利用熒光標(biāo)記技術(shù)，將抗體和其他蛋白結(jié)合，利用顯微鏡可以檢測(cè)特定的熒光，從而識(shí)別食物中的微生物，具有特異性、敏感性和快速性等優(yōu)點(diǎn)。這種方法無(wú)需耗費(fèi)太多的時(shí)間，且具有很好的適應(yīng)性[3]。

2.1.4 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠法是一種將磁性微球和免疫化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。這種方法是將抗體包裹的磁珠與試樣進(jìn)行混合，然后用磁力設(shè)備將其收集。利用免疫磁珠法，可以較快地將食物中的目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行分離，從而解決了選擇性培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌的抑制問(wèn)題。利用免疫磁力法從乳制品、肉類(lèi)、蔬菜中分離沙門(mén)菌，其檢測(cè)限為每克1×102個(gè)細(xì)菌，與其他測(cè)試手段聯(lián)合使用，可以使分離效率和檢測(cè)極限成倍增加。

2.1.5 免疫層析技術(shù)

利用免疫層析技術(shù)，結(jié)合抗原抗體特異反應(yīng)，建立了一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。將一種特定的抗體固定在硝酸纖維素薄膜的一個(gè)區(qū)帶內(nèi)，干燥的硝酸纖維素的一端被浸泡在試樣中，在毛細(xì)管的作用下，沿著薄膜向前移動(dòng)到被固定的抗體區(qū)域，當(dāng)樣本的抗原與抗體結(jié)合時(shí)，通過(guò)免疫膠體金和免疫酶染色，就可以在相應(yīng)的部位得到染色，從而得到特異的免疫反應(yīng)。在應(yīng)用免疫色譜的過(guò)程中，常用的是膠體金免疫層析技術(shù)，通過(guò)膠體金進(jìn)行標(biāo)記。在食品微生物檢測(cè)中，免疫層析技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、不會(huì)產(chǎn)生任何污染的優(yōu)點(diǎn)。因此，可以很好地檢測(cè)食物中的布氏菌、沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌等。

2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

目前，常用的分子生物學(xué)技術(shù)包括PCR、基因芯片技術(shù)、分子雜交技術(shù)等。PCR 可以根據(jù)不同的溫度對(duì)食物中的DNA 進(jìn)行定向復(fù)制，具有很高的敏感性，而且不會(huì)對(duì)食品本身造成任何污染，因而被廣泛用于食品的微生物檢測(cè)?；蛐酒夹g(shù)是對(duì)傳統(tǒng)PCR 技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化和改造的一種技術(shù)，其采用了分子生物學(xué)技術(shù)和自動(dòng)化技術(shù)，通過(guò)一套檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，對(duì)探針與被測(cè)基因進(jìn)行雜交，并對(duì)其組成進(jìn)行不同的反應(yīng)，從而達(dá)到對(duì)食物微生物成分的檢測(cè)，其中包含潛在致病因素、遺傳性指標(biāo)等，確保了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.2.1 PCR 技術(shù)

腸毒素大腸桿菌是一種嗜熱、嗜酸、好氧的細(xì)菌，能夠在巴氏滅菌條件下生存，對(duì)濃縮果汁的質(zhì)量造成很大的影響。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外對(duì)蘋(píng)果濃縮果汁中耐高溫細(xì)菌的含量要求不超過(guò)1。目前，國(guó)內(nèi)蘋(píng)果濃縮果汁生產(chǎn)中存在的最大問(wèn)題是耐熱細(xì)菌超標(biāo)。耐高溫細(xì)菌的檢測(cè)仍然是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常要4 ～5 d 才能得出結(jié)果。由于檢驗(yàn)的滯后，不能對(duì)生產(chǎn)進(jìn)行及時(shí)引導(dǎo)，也不能將相關(guān)的信息反饋給生產(chǎn)線，從而無(wú)法對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)防、控制和清洗。PCR 技術(shù)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將DNA 擴(kuò)增到幾百萬(wàn)倍，并通過(guò)篩選合適的引物，將DNA 片段擴(kuò)增到易于檢測(cè)的程度。因此，在理論上，可以通過(guò)特異擴(kuò)增抗熱細(xì)菌的基因片段，從而達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

2.2.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片，也叫DNA 微陣列，是一種生物芯片。由核酸分子雜交發(fā)展而來(lái)，其是通過(guò)1 個(gè)與已知的序列結(jié)合在一起的基因探針，對(duì)不確定的序列進(jìn)行雜交。在此基礎(chǔ)上，采用共聚焦熒光技術(shù)，將其與探針進(jìn)行雜交，從而達(dá)到快速檢測(cè)基因信息的目的。其工藝主要包括樣品的處理和放大，對(duì)基因芯片進(jìn)行雜交、清洗、檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理，以及集成的信息處理?；蛐酒械臄?shù)據(jù)處理與信息抽取要求對(duì)混合樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的定位，而樣本的自動(dòng)識(shí)別將直接影響芯片的檢測(cè)準(zhǔn)確率。

2.2.3 分子雜交技術(shù)

分子雜交技術(shù)通過(guò)將DNA 和RNA 與某些微生物的核酸結(jié)合，對(duì)微生物進(jìn)行診斷和識(shí)別。這種方法能夠很好地解決抗體的檢測(cè)問(wèn)題，為了得到較大的樣本數(shù)量，在食物的微生物研究中，主要采用了瓊脂平板上的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交。

2.3 代謝學(xué)技術(shù)

在微生物的代謝過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生物理化學(xué)的改變，這是一種代謝學(xué)的方法，其包括ATP 生物發(fā)光法、微量生化法。代謝學(xué)技術(shù)由于具有快速、準(zhǔn)確、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，目前被越來(lái)越多地采用。

2.3.1 ATP 生物發(fā)光法

ATP 是生物體內(nèi)的一種不穩(wěn)定物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定ATP 在體內(nèi)的含量，可以得到實(shí)際的活菌數(shù)。在此基礎(chǔ)上，此技術(shù)利用光譜儀對(duì)食品進(jìn)行熒光分析，具有操作簡(jiǎn)單、高效等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)。

2.3.2 微量生化法

微量生化法用于食品的微生物分析，需要采用商業(yè)化的微生化鑒別試劑，其主要有放射測(cè)量法和微熱量法。輻射測(cè)定是根據(jù)微生物生長(zhǎng)時(shí)所釋放的放射CO2來(lái)判定微生物的真實(shí)數(shù)目[4]。微熱分析技術(shù)要求對(duì)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中的溫度變化規(guī)律進(jìn)行研究，以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的識(shí)別。這2 種檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于檢測(cè)食品中的乳酸菌、大腸桿菌和酵母菌。

2.4 免疫傳感器

免疫傳感器是一種將生物檢測(cè)技術(shù)和傳感技術(shù)有機(jī)結(jié)合的一種新的生物傳感器[5]。生物敏感單元是一種分子層，其可以將抗原或抗體固定；傳感器是把生物化學(xué)過(guò)程轉(zhuǎn)化為光和電信號(hào)；信號(hào)處理器會(huì)放大、處理、顯示或記錄光信號(hào)。當(dāng)被測(cè)物體與分子識(shí)別單元特異地結(jié)合時(shí)，合成的復(fù)合體會(huì)被信號(hào)變換成能夠被輸出的光、電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)的分析和探測(cè)。

2.5 近紅外光譜技術(shù)

近紅外光譜法是以光譜技術(shù)為基礎(chǔ)，用于食品的質(zhì)量和品種的鑒定[6]，其波長(zhǎng)在780 ～2 526 nm。近紅外光譜是一種分子振動(dòng)光譜，在近紅外光中，各種含氫的化合物對(duì)近紅外光的產(chǎn)合頻率及倍頻進(jìn)行吸收，并利用不同的基團(tuán)對(duì)其吸收波長(zhǎng)及強(qiáng)度的影響，獲得了含有豐富結(jié)構(gòu)和物理信息的近紅外光譜，用于食品品質(zhì)的探測(cè)與分析。微生物的核酸、蛋白質(zhì)等能吸收近紅外光產(chǎn)生的各種光譜信息，從而為微生物的結(jié)構(gòu)和數(shù)量提供了依據(jù)。

2.6 高光譜成像技術(shù)

高光譜成像技術(shù)（HS）結(jié)合了光譜學(xué)和圖像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)Ρ粶y(cè)食物進(jìn)行光譜和圖像信息的同時(shí)探測(cè)。其光譜分辨率可達(dá)10-2λ 量級(jí)，在200 ～2 560 nm，或超過(guò)2 560 nm。高光譜成像系統(tǒng)包括光源、分光設(shè)備、照相機(jī)、高分光光度計(jì)以及電腦等。通過(guò)分光器件將混合光分解為不同頻率的單色光，利用高成像光譜儀將所發(fā)射的光轉(zhuǎn)化為光譜圖像，并在一定的頻譜范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)對(duì)象進(jìn)行幾十到幾百個(gè)頻帶的連續(xù)成像，從而獲得含有大量樣本信息的立體譜圖像[7]。高光譜圖像具有較高的解析度，能夠探測(cè)蛋白質(zhì)、核酸等成分的振動(dòng)信號(hào)，同時(shí)還能為微生物的探測(cè)提供大量的信息[8]。

2.7 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜法是一種新型的后基因組檢測(cè)技術(shù)，其是一種新型的檢測(cè)手段，通常用于檢測(cè)海產(chǎn)品的腐敗菌、革蘭氏陽(yáng)性菌等。經(jīng)過(guò)高效的分離，可以用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分析，并繪出光譜，標(biāo)記特異性和特異性峰的質(zhì)量數(shù)，從而提高鑒定效率。此外，質(zhì)譜技術(shù)中的液相色譜分離技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源雙歧菌亞種的鑒定、發(fā)酵食品的微生物鑒定。如檢測(cè)蔬菜、肉類(lèi)食品是否被微生物污染時(shí)，推薦采用GC-MS、HPLC 等方法，此類(lèi)方法具有成本低、檢測(cè)周期短、檢測(cè)操作方便的優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

微生物快速檢測(cè)技術(shù)是保障食品安全的一項(xiàng)重要手段，涉及的技術(shù)種類(lèi)很多。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)微生物檢測(cè)的需要和目的，有針對(duì)性地選用免疫分析檢測(cè)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、代謝學(xué)技術(shù)、免疫傳感器、近紅外光譜技術(shù)、高光譜成像技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等。這些技術(shù)解決了傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率低等問(wèn)題，同時(shí)也為食品安全生產(chǎn)工作提供了技術(shù)支持。