超高效液相色譜技術在雞蛋獸藥檢測中的應用

◎ 李 蕙

（臨淄區(qū)檢驗檢測中心，山東 淄博 255400）

由于儀器創(chuàng)新和色譜技術的改進，液相色譜技術在靈敏度、分離度和速度等方面實現(xiàn)了快速的發(fā)展和進步[1]。超高效液相色譜技術是在高效液相色譜技術應用的基礎上，進一步提高了測控性能和指標，設計了承受能力更高的壓力裝置（色譜柱填充的小顆粒為1.7 μm，承受的流動相在15 000 psi），進一步提高了檢測的靈敏度和反應時間[2]。目前，超高效液相色譜技術的應用場景正逐步得到擴展，特別是在醫(yī)藥學、化學工業(yè)和生物技術、食品領域、環(huán)境領域等得到了廣泛使用[3]。近年來，不少國家對超高效液相色譜技術進行了探索，特別是在生命領域的研究更為深入，這也推動了超高效液相色譜技術的進一步創(chuàng)新。

1 超高效液相色譜的基本概念與技術特點

1.1 基本概念

超高效液相色譜技術是以范德米特方程（HETP=AdP+B/v+CdP2v）作為理論基礎（HETP為理論塔板高度；A為渦流擴散系數(shù)；dP為填料粒徑；B為分子徑向擴散系數(shù)；C為傳質因子；v為流動相線速度）。由該方程可得到顆粒度越小柱效越高；每個顆粒度尺寸有自己的最佳柱效流速；更小的顆粒度使最高柱效點向更高流速（線速度）方向移動，而且有更寬的線速度范圍，所以降低顆粒度可提高柱效，也可提高速度。但是當固定相的粒度很小時，且維持最佳的線性速度時，高效液相色譜具備的快速分離和高效率的特點才會顯示出來。因此，超高效液相色譜分析要達到最佳使用效果，除了柱內填充的顆粒小于2 μm 外，還需要具備以下幾個條件，即提供快速的檢測器、高壓溶劑輸送單元、快速自動進樣器、控制系統(tǒng)和色譜系統(tǒng)等，這些將會使超高效液相色譜技術更為完善。

1.2 技術特點

1.2.1 高效色譜柱

色譜柱中裝填的固定相的粒度對于色譜柱的性能至關重要。采用雜化顆粒技術能夠合成新型的耐高壓、全多孔球形反相固定相。運用新設計的篩板和裝填技術，能夠制備高效能的色譜柱。由于采用1.7 μm 顆粒，具備較高的優(yōu)越性，而且還可以將柱長縮短原來柱長的1/3，也就是5 μm 顆粒色譜柱，效能也比原來提高了3 倍，既能夠加快分離速度，還能將分離效能提高70%以上，而且峰容量和色譜柱也更窄。因此，超高效液相色譜技術在分析速度、效率和靈敏度上要比高效液相色譜技術更高效。

1.2.2 超高壓輸液泵

該輸液泵裝備了獨立的柱塞驅動，并且還裝置了能夠實現(xiàn)4 種溶劑速度自由切換的二元高壓梯度泵，能夠為柱長10 cm 的固定相色譜柱提供1.0 mL·min-1的流速，而且耐高壓能力達到105 MPa。在很寬的壓力范圍內，溶劑輸送系統(tǒng)能夠很好地彌補因為工作導致的溶劑壓縮性變化，從而維系流速的穩(wěn)定性。通過系統(tǒng)集成改進的高敏度真空脫氣技術，可以推動進樣器內的流動相溶劑脫氣條件達到最高的試驗條件。

2 超高效液相色譜技術在雞蛋獸藥分析領域的應用

2.1 藥物成分分析與研究

超高效液相色譜技術具備高通量、速度快、靈敏度高等特點，常常和串聯(lián)質譜技術、新型四極桿質譜系統(tǒng)技術等聯(lián)用來進行常規(guī)分析。當超高效液相色譜和串聯(lián)質譜技術聯(lián)用時，能夠加快代謝產物離子化的效率。相比于高效液相色譜技術，超高效液相色譜技術具備更高的檢測靈敏度，即使低濃度的代謝產物也能夠被檢測出來。

超高效液相色譜和串聯(lián)質譜聯(lián)用技術在藥物篩選中的應用表明，在高通量藥物篩選上，超高效液相色譜技術的應用更深入、前景更廣闊，能夠大幅度縮短應用時間，提高靈敏度以及將生物樣品不純帶來的分析干擾降到最低程度。MENSCH 等[3]在超高效液相色譜技術和串聯(lián)質譜技術聯(lián)用的條件下，可以檢測出包括咖啡因在內的多種化合物。這種方法的檢測限在0.61 ～12.00 nmol·L-1，并且處理量的速度提高了4 倍，增加了靈敏度，可以應用在早期的藥物篩選中。HAVLíKOVá 等[4]將高效液相色譜技術替換為超高效液相色譜技術，對氟氫可的松等4 種藥物成分進行分析，結果發(fā)現(xiàn)超高效液相色譜技術分析速度是高效液相色譜技術的3 ～9 倍。

中藥的成分比較復雜，超高效液相色譜技術與質譜聯(lián)用，能夠分析復雜的中藥成分，并且還具有高通量、靈敏度高和準確性高等優(yōu)勢，在中獸藥研發(fā)和推廣上發(fā)揮了重要的作用。武為寶等[5]采用高效液相色譜技術對丹參中的藥用成分，包括降鼠尾草氧化物、二氫丹參酮Ⅰ和丹參酮Ⅰ在內的5 種脂溶性成分進行了重點分析，發(fā)現(xiàn)在根及根莖中，這5種成分比較相近。曹悅等[6]采用超高效液相色譜技術對龍膽藥材中的獐芽菜苦苷和龍膽苦苷的含量進行了測定。結果表明，龍膽苦苷的含量為56.75 ～86.61 mg·g-1，遠高于《中國藥典》規(guī)定；獐牙菜苦苷的含量在3.27 ～5.52 mg·g-1。楊俊等[7]利用超高效液色譜-蒸發(fā)光散法對黃芪甲苷進行測定，保留時間控制在2.1 min，出峰時間控制在12 min，能夠很好地解決黃芪甲苷無法測定問題。

2.2 獸藥殘留檢測

近些年來獸藥殘留問題頻發(fā)，并且難以有效解決，其不僅對人們的身體健康造成負面影響，還長期困擾著畜禽產品的出口，導致畜禽產品出口受阻。近年來，不少學者在超高效液色譜技術檢測獸藥領域進行了相關探索，取得了大量的研究成果。李文杰等[8]利用UPLC-MS/MS 法對11 種喹諾酮類藥物在蝦產品中的殘留進行了抽樣分析，再利用C18色譜柱進行分離，結果發(fā)現(xiàn)這些藥物的檢出限均達到0.01 μg·kg-1，綜合回收率甚至超過100%，最高能達到102%；而且相對偏差也能夠達到1.6%～9.9%。該種方法具備簡便、靈敏度高且快速等特征，適用性非常廣。同樣，黃子敬等[9]應用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對7 種磺胺類、3 種喹諾酮類及4 種硝基咪唑類獸藥在畜禽肉中的殘留進行了測定，綜合應用效果較好。同樣，李杏翠等[10]采用UPLC-MS/MS 法對畜禽產品中3 種磺胺的殘留量進行了檢測，效果非常靈敏。陳德瑩等[11]采取超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用技術對獸藥中的三聚氰胺殘留量進行了測定。研究發(fā)現(xiàn)具備三聚氰胺分離狀態(tài)良好且檢測線性度好等特點，該方法回收率在80.23%～96.52%，檢測線均小于2 ng·mL-1。該種方法處理程序簡單，適宜于食品中低含量三聚氰胺的測定。

3 問題與展望

超高效液相色譜技術具有靈敏、快速等無可比擬的優(yōu)點，這為雞蛋獸藥的研發(fā)和檢測等提供了新的平臺載體和思路。盡管優(yōu)點較多，但是超高效液相色譜技術在實際應用中還存在一些問題和局限性，在一些關鍵技術環(huán)節(jié)上還需要改善和突破。超高效液相色譜技術超高通量的樣品分析能力的提升，大幅度提升了樣品的批處理效率，但樣品前處理環(huán)節(jié)消耗時間較長，成為制約藥品檢測分析周期的一個明顯的瓶頸[12]。因此，縮短樣品前處理時長也成為需要解決的一大難題。目前，1.7 μm 顆粒度色譜柱的壓力已經(jīng)達到103.4 MPa，這種情況下如果降低顆粒度，將會使色譜柱的反壓呈現(xiàn)幾何級數(shù)倍增[13]。因此，當前狀態(tài)下，通過降低色譜柱的顆粒度來提高色譜儀的分析效率已經(jīng)不可實現(xiàn)，毛細管柱和檢測芯片技術的應用成為液相色譜分析新的發(fā)展方向[14]。對于高效液相色譜技術來說，要想在雞蛋獸藥檢測中進一步提高應用價值，還需要提高峰面積的重復性。另外，由于國外一些國家已經(jīng)壟斷了高效液相色譜的關鍵技術，使得儀器設備和試劑耗材等非常昂貴，實驗室需投入的資金量較大，這也為該項技術在獸藥研發(fā)和檢測領域的推廣造成了成本性的障礙因素。因此，研發(fā)適合我國的超高效液相色譜設備和耗材，降低成本，也成為當前國內超高效液相色譜技術開發(fā)和應用的關鍵因素之一。

4 結語

目前，超高效液相色譜技術在農產品檢測中應用較為廣泛，具有檢測靈敏、速度快等特點。隨著人們對農產品質量的要求越來越高，其在農產品檢測領域將具備更加廣闊的使用空間。