鮮凍水產(chǎn)品中生物胺含量及組分檢測技術(shù)概述

◎ 馮洪燕，欒立寧，楊從發(fā)

（1.江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市質(zhì)量技術(shù)綜合檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222005）

世界糧農(nóng)組織發(fā)布2022 年《世界漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖狀況》報告中提到，2020 年全球魚類產(chǎn)量約為2.14 億t，魚類消費(fèi)占全球人口動物蛋白攝入量的1/6，魚類的重要飲食價值凸顯了發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要性。盡管魚類加工和流通做法不斷完善，在上岸與消費(fèi)之間的損失或浪費(fèi)仍占上岸水產(chǎn)鮮品的20%左右。鮮凍海水魚含有豐富的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，為產(chǎn)胺菌和產(chǎn)蛋白酶菌提供了良好的生長環(huán)境。蛋白質(zhì)經(jīng)產(chǎn)蛋白酶菌分解后產(chǎn)生組氨酸、酪氨酸、賴氨酸和鳥氨酸等小分子物質(zhì)為生物胺的形成提供了前體物質(zhì)。凡是體內(nèi)水分多、含氮物質(zhì)高、游離氨基酸豐富的水產(chǎn)品都比較容易腐敗，并產(chǎn)生生物胺。

生物胺是小分子含氮化合物[1]，是合成核苷酸[2]、蛋白質(zhì)[3]、生物堿[4]、激素和芳香族化合物[5]的前體物質(zhì)，在生命活動中發(fā)揮著重要的生理作用，普遍存在于鮮凍水產(chǎn)品中，對產(chǎn)品安全質(zhì)量、口感風(fēng)味等影響巨大。一些研究表明，攝入過多的生物胺會導(dǎo)致食物中毒，如腹瀉和頭痛等，攝入總胺1 000 mg·kg-1被認(rèn)為會對人體健康造成損害。為了保護(hù)公眾健康，許多國家對生物胺設(shè)定定量限。例如，美國食品藥物監(jiān)督管理局將水產(chǎn)品中組胺含量限定為50 mg·kg-1[6]。因為大多數(shù)生物胺具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和耐熱、耐酸性，所以無論感官檢查是否檢測到腐爛，50 mg·kg-1或更多的組胺含量都表示魚已經(jīng)腐爛。歐盟將某些魚種的組胺可接受水平定為100 mg·kg-1[7]。中國政府將海水魚（如鱈魚、金槍魚、鯡魚等）的組胺限量定為400 mg·kg-1，其他海水魚的限量為200 mg·kg-1（GB 2733—2015），鯡魚罐頭產(chǎn)品的限量1 000 mg·kg-1（GB 7098—2015）。根據(jù)上海食品藥品監(jiān)管局發(fā)布的DB 31/2004—2012，組 胺 限 量 設(shè) 定 為100 mg·kg-1。2011 年，歐洲食品安全局、世界衛(wèi)生組織對發(fā)酵食品中組胺進(jìn)行了風(fēng)險評估，認(rèn)為健康成年人組胺的急性參考劑量為50 mg，歐洲食品安全局生物危害小組認(rèn)為當(dāng)魚及其產(chǎn)品中組胺的含量低于200 mg·kg-1時，風(fēng)險較低。

1 生物胺的檢測方法

鮮凍水產(chǎn)品中生物胺測定方法必須具有高分離效率、高選擇性和高靈敏度以避免分析物被復(fù)雜的基質(zhì)和結(jié)構(gòu)類似物的干擾。

1.1 高效液相色譜法

1.1.1 采用衍生化工藝的吸收光譜和熒光檢測

高效液相色譜使用高壓系統(tǒng)將樣品加載到裝有固定相的色譜柱上，流動相選擇可以溶解生物胺的溶劑，根據(jù)不同生物胺中組分在兩相中分配系數(shù)的不同，依次洗脫不同類別的生物胺成分流動到檢測器進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對樣品的分離分析。大多數(shù)生物胺沒有紫外吸收和熒光發(fā)射所以需要衍生。生物胺的衍生化技術(shù)包括丹磺酰氯、苯甲酰氯、氯甲酸熒甲酯、乙氧甲基丙二酸二乙酯、鄰苯二甲醛和異硫氰酸熒光素。鄰苯二甲醛具有靈敏度高、反應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)，但其衍生物很不穩(wěn)定。丹磺酰氯衍生劑，其衍生物穩(wěn)定性好，檢測范圍廣較為常用。目前常用的檢測方法有紫外檢測法、熒光檢測法、二極管陣列檢測法和光電二極管陣列檢測法。

CHONG 等[8]用6% 三 氯 乙 酸 勻 漿 和BNZ-Cl衍生化程序制備印度鯖魚樣品進(jìn)行HPLC 分析以確定生物胺含量。采用液相色譜法研究了環(huán)境溫度（25 ～29℃）和冰溫（0 ℃）等不同貯藏條件與生物胺水平之間的相關(guān)性。使用5.0 μm C18色譜柱以乙腈水混合物為流動相在254 nm 波長處進(jìn)行紫外檢測，檢測中組胺與組氨酸高度相關(guān)（r2=-0.963，p＜0.01），為探究水產(chǎn)品在不同溫度的貯存條件下生物胺變化提供了有效檢測方法。HU 等[9]對74 個不同的魚類樣品中生物胺的含量進(jìn)行了測定，建立了HPLC-柱前衍生方法。反應(yīng)條件為pH=9.5，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時間30 min。衍生化后，用反相高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行紫外檢測，4 ℃和25 ℃貯藏時生物胺組分含量顯著升高（p＜0.05）。CHIN-CHEN 等[10]對魚露中的尸胺、2-苯乙胺、組胺和亞精胺等生物胺進(jìn)行了定量測定。用DN-BNZ-Cl 衍生化后采用膠束液相色譜進(jìn)行分離。根據(jù)美國食品和藥物管理局的要求使用添加的樣本驗證。此方法的線性范圍為0.5 ～500.0 μg·mL-1，檢測范圍在158 ～375 ng·mL-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜3.2%和精確度在88.6%～103.7%。該方法可應(yīng)用于魚露產(chǎn)品中生物胺的常規(guī)分析。DONTHUAN 等[11]采用超聲輔助分散液-液微萃取與液相色譜聯(lián)用的方法同時分析發(fā)酵魚的組胺、色胺、尸胺、酪胺和亞精胺。采用FMOC-Cl 衍生化分析物，以便靈敏地使用熒光檢測。30 min 內(nèi)在C18色譜柱和乙腈以及1%乙酸在梯度模式下進(jìn)行有效的分離和定量。校準(zhǔn)范圍在0.2 ～300.0 ng·mL-1計算，相關(guān)生物胺的定量限為0.02 ～0.50 ng·mL-1，該方法可應(yīng)用于發(fā)酵魚樣品中生物胺的分析，回收率在77.02%～126.38%。TRIKI 等[12]在HPLC 研究中，結(jié)合OPA 柱后衍生化以提供熒光檢測試驗了不同的提取程序來測量魚粉中樣品制備程序的功效。使用不同濃度的三氯乙酸，實驗結(jié)果表明除酪胺外，使用7.5%和10.0%的三氯乙酸提取生物胺之間沒有顯著差異，可以看出，這種提取方式對魚粉中的生物胺是可行的，使用7.5%三氯乙酸一步提取和離心為魚粉中的生物胺檢測提供了一種高效快速的前處理方法。

1.1.2 紫外可見光度法無需衍生的吸收光譜和熒光檢測

PAWUL 等[13]建立了一種采用HPLC-DAD 測定組胺的方法。使用C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）和保護(hù)柱（10 mm×3 mm，3 μm）在25 ℃下分離；以甲醇和0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀與1.6 mmol·L-11- 辛 烷 磺 酸（180 ∶820，v∶v）為 流 動 相；以0.5 mL·min-1的 流 速 和 等 度 洗 脫 進(jìn) 行 分 離； 紫外波長215 nm；進(jìn)樣量20 μL。方法檢測范圍為3.6 ～420 mg·kg-1，而LOD 和LOQ 分別為1.3 mg·kg-1和1.8 mg·kg-1。PLONKA 等[14]在一項研究中，研究了加工中使用的熱處理（干燥、煮沸、冷凍和巴氏殺菌）對生物胺含量的影響。使用帶有熒光檢測器的RP-HPLC 測定分析物含量。C18色譜柱柱溫在25 ℃，流動相為水和乙腈，按照洗脫時間混合兩流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5 mL·min-1。檢測限和定量限值分別為85 μg·kg-1（85 μg·L-1）和275 μg·kg-1（275 μg·L-1）。結(jié)果表明，每種生物胺都具有熱穩(wěn)定性，蒸煮過程將生物胺含量從18%提高到27%，凍結(jié)對生物胺含量影響最小，對生物胺含量影響最大的過程是沸騰，使用的溫度最高，處理時間最長。

1.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜可以將有機(jī)成分從基質(zhì)中分離出來，而質(zhì)譜可以獲得有機(jī)物的相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和含量信息。質(zhì)譜學(xué)的原理是基于電離，通過質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度來區(qū)分生成的離子。離子源使樣品帶正電荷或負(fù)電荷，通常分為ESI 和APCI 兩種類型。在ESI 中，帶電液滴隨著電場中表面電荷密度的增加而蒸發(fā)和收縮。重復(fù)這個過程，直到離子進(jìn)入質(zhì)譜儀。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用被廣泛應(yīng)用于強(qiáng)極性、低揮發(fā)性混合有機(jī)化合物的分析。為了檢測的高度精準(zhǔn)性，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法已成為分析食品和生物樣品中生物胺的重要方法。

ROMERO-GONZALEZ 等[15]采用新型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-MS/MS）法測定了鳳尾魚中腐胺、尸胺、組胺和酪胺的含量。使用正離子模式下的ESI 將所有魚樣品均質(zhì)在0.6 mol·L-1高氯酸中在經(jīng)過過濾和提取過程后，使用由甲酸（0.1%）的甲醇水溶液和C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm粒徑）組成的流動相色譜程序。所有生物胺的定量限均低于25 μg·kg-1。PLADIKI 等[16]開發(fā)并驗證了一種新型、經(jīng)濟(jì)有效的方法來測定魚類組織中主要的生物胺。該方法包括高氯酸提取、吡喃磺酰氯（PSCL）柱前衍生化、甲苯提取、蒸發(fā)后在乙腈中反溶、反相高效液相色譜-紫外檢測和分子內(nèi)準(zhǔn)分子熒光檢測最后用電噴霧電離（ESI）的質(zhì)譜分析儀對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析確定。ZHANG 等[17]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測定了水產(chǎn)品中存在的8 種生物胺，該方法無需使用衍生劑，提取液采用5%的高氯酸溶液，具有較好的線性相關(guān)系數(shù)（R2＞0.99），較高的靈敏度（幾種生物胺的檢出限為0.1 ～1.0 mg·kg-1），平均回收率為70.9%～113.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.33%～10.81%，建立了一種快速靈敏的適用于魚、蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)品中生物胺的檢測方法。MOLOGNONI 等[18]發(fā)現(xiàn)了一種快速而新穎的LC-MS/MS 方法，用于測定17 種不同肉類和魚類產(chǎn)品中的生物胺。方法通過SPE從肉類和魚類產(chǎn)品中提取生物胺（所有提取程序和色譜分離相同），使用與羥基化二氧化硅結(jié)合的二異丙基-3-氨丙基硅烷的固定相，在10 min 內(nèi)實現(xiàn)完全檢測分離。線性范圍在25 ～200 mg·kg-1。分析生物胺的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程的相關(guān)系數(shù)大于0.996。組胺的檢測范圍最低為25 mg·kg-1。開發(fā)的這種方法可以取代其他幾種耗時的分析程序，成為實驗研究的主要手段。

1.3 生物傳感器法

在生物傳感器方法中，當(dāng)分析物進(jìn)入生物活性物質(zhì)時會發(fā)生生物反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化為可量化的電信號最后計算出濃度。用生物傳感器測定生物胺主要是由于固定在探針上的氨基氧化酶能特異性地催化生物胺脫氨為過氧化氫，通過計算過氧化氫產(chǎn)量可以量化生物胺的含量。此方法分離和檢測同時完成，不需要任何其他過程。該方法具有特異性，只對選定的底物反應(yīng)，不受其他雜質(zhì)和物理性質(zhì)的干擾。LERGA 等[19]通過指數(shù)富集選擇檢測組胺的適配體，所選適配體與其他幾種生物胺沒有表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性，表明該方法對組胺的測定具有專一性。通過這種方法，開發(fā)了基于利用氫氣和磁珠適配體的競爭測定法來檢測尿液中的組胺，檢測限達(dá)到0.1 mg·kg-1。該學(xué)者的另一項研究表明，基于納米金顆粒適配體法和先前報道的氫氣適配體法均適用于金槍魚和沙丁魚樣品中組胺含量的分析，開發(fā)的納米金（AuNP）適配體法測定的組胺非常靈敏，在食品樣品分析和臨床分析中檢出限均可達(dá)到0.5 mg·kg-1。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是通過用生物胺免疫動物產(chǎn)生特異性單克隆抗體以檢測產(chǎn)品中的生物胺，該方法具有較高的靈敏度。KIM 等[20]為了建立豆瓣醬和苦椒醬中生物胺的快速測定方法開發(fā)了一種用于測定組胺的競爭性直接酶聯(lián)免疫吸附劑測定法方法，并將其與液相色譜進(jìn)行了比較。通過競爭性直接酶聯(lián)免疫吸附劑測定法測定組胺含量為0.7 ～420.0 mg·kg-1，通過HPLC法測定組胺含量為2.2 ～382.4 mg·kg-1。競爭性直接酶聯(lián)免疫吸附劑測定法被認(rèn)為是定量測定組胺超過10 mg·kg-1水平的可靠方法。此外，競爭性直接酶聯(lián)免疫吸附劑測定法測定的組胺含量與樣品中7 種主要生物胺的總和呈正相關(guān)（R=0.910），這表明競爭性直接酶聯(lián)免疫吸附劑測定法可作為豆瓣醬和苦椒醬中總胺的快速指標(biāo)。這種方法快速靈敏，但不能重復(fù)使用，復(fù)雜的食物基質(zhì)可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此本方法暫時還停留在實驗室階段未能正式投入使用。

1.5 離子交換層析法

離子交換層析法檢測生物胺是通過生物胺的陽離子交換能力差異進(jìn)行分離并檢測。RABIE 等[21]使用3 種檸檬酸鈉緩沖液（均含有58.8 g·L-1二水合檸檬酸鈉、氯化鈉、2 g·L-1聚氧乙烯月桂醚、0.5g·L-1苯酚、55.0 mL·L-1甲醇和45 mL·L-1乙醇）逐步梯度洗脫分離生物胺，其中溶劑A（1.5 mol·L-1Na+，pH=6.00）42.5 min，溶劑B（2.0 mol·L-1Na+，pH=5.70）30.0 min，溶 劑C（2.5 mol·L-1Na+，pH=5.45）35.0 min。 用 茚三酮柱后衍生化后，比色檢測在570 nm 和440 nm 處進(jìn)行。該方法對萃取過程中甲基磺酸的濃度和分離條件進(jìn)行了細(xì)致的優(yōu)化。該分離條件具有良好的分辨率和較高的分離度，在食品樣品中的回收率達(dá)到82%～103%，檢出限達(dá)到（23 ～65）μg·kg-1。

1.6 合相色譜法

合相色譜是一種新型的環(huán)保色譜分析方法，以二氧化碳和微量有機(jī)試劑為流動相，分離效率高，是一種綠色、快速的分離方法。合相色譜法具有運(yùn)行時間短、溶劑消耗少、峰容量和靈敏度大幅提高等顯著優(yōu)點(diǎn)，這使得它在常規(guī)分析中的應(yīng)用更具吸引力。這項技術(shù)可以作為色譜和質(zhì)譜之外的一種替代或補(bǔ)充方法?？紤]到其靈敏度高、重復(fù)性好、耗時少等優(yōu)點(diǎn)，合相色譜法越來越受人們的青睞。GONG 等[22]建立了一種快速合相色譜法在6.5 min 內(nèi)測定出中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的8 種生物胺。用丹磺酰氯預(yù)先衍生化生物胺，并在合相色譜法系統(tǒng)上用HSS C18SB 柱（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）使用CO2和正己烷：異丙醇：氫氧化銨（70 ∶30 ∶0.15，v∶v∶v）的二元系統(tǒng)梯度洗脫，背壓為2 000 psi，流速為2.0 mL·min-1，DAD 檢測為254 nm。結(jié)果顯示線性相關(guān)系數(shù)在0.999 5 ～1.000 0。檢測限和定量限分別為21 ～67 ng·L-1和72 ～224 ng·L-1。重復(fù)性和重現(xiàn)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.21%～0.87%和1.98%～4.02%。

1.7 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是在高壓電場和毛細(xì)管分離的作用下進(jìn)行的，分離是由于樣品中每個組分的不同遷移率和分布特征造成的。JASTRZ?BSKA 等[23]使用等速電泳技術(shù)檢測了肉類樣品中的生物胺提出了兩種電解質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行分離和測定?；厥章蔬_(dá)到96%～99%，表明所提出的雙電解質(zhì)系統(tǒng)的精確度達(dá)到一個可靠標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 薄層色譜法

薄層色譜法是一種快速分離并測定微量物質(zhì)的檢測技術(shù)。薄層色譜法因其分離速度快、操作簡單、成本低廉、靈敏度高和對設(shè)備需求低等優(yōu)點(diǎn)成為目前應(yīng)用較為廣泛的分離技術(shù)之一，現(xiàn)已應(yīng)用于生物化學(xué)、毒理學(xué)、藥理學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)和化學(xué)等學(xué)科。薄層色譜可用于混合物中組分的分離和定量，它還可以制備分離特定的組分。ROMANO 等[24]建立了一種簡單快速的薄層色譜測定方法，用于魚類和水產(chǎn)品的組胺分析，此方法不需要煩瑣的樣品預(yù)處理。該方法利用咪唑環(huán)與對氨基苯磺酸的反應(yīng)，建立了一種定量比色法定量測定組氨酸的方法。氨基苯甲酸在鹽酸溶液中用亞硝酸鈉重氮化。然后，重氮化的氨基苯甲酸在弱堿性條件下與咪唑環(huán)化合物反應(yīng)，形成紅色偶氮染料。將樣品提取物和標(biāo)準(zhǔn)溶液通過氨-乙醇流動相（1 ∶3，v/v）向上展開在薄層色譜板上，組胺在80%乙醇魚提取物中與其他Pauly 試劑陽性組分成功分離。一次可以在一個板上同時分析5 ～6 個樣品，從而降低了溶劑消耗的成本。組胺的檢測限為0.02‰，比美國食品和藥品管理局設(shè)定的0.05‰ 的標(biāo)準(zhǔn)更靈敏。雖然薄層色譜法簡單快速，但衍生化技術(shù)是關(guān)鍵因素，衍生過程較為復(fù)雜，從長遠(yuǎn)角度看隨著設(shè)備的更新?lián)Q代，此方法具有比較優(yōu)勢的前景。

2 結(jié)語

本文提及的分析方法對多數(shù)生物胺具有良好的靈敏度和較高的選擇性，但其中一些方法在實際應(yīng)用時并不穩(wěn)定。毛細(xì)管電泳法可以處理由于熱不穩(wěn)定而不適合氣相色譜的分析物，同時可以提供比液相方法更快速的分離并且仍然保持高分辨度。毛細(xì)管電泳法具有分離速度快、操作成本低等優(yōu)點(diǎn)，通常需要對生物胺進(jìn)行衍生化才能進(jìn)行檢測，適用于分離環(huán)境樣品、食品和飲料中的生物胺。生物傳感器具有檢測迅速、反應(yīng)靈敏、成本廉價、操作簡單和可連續(xù)動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，但其選擇性低難以穩(wěn)定進(jìn)行檢測，所以需要通過其他方法輔助驗證檢測結(jié)果。至于離子交換層析法檢測時質(zhì)子化生物胺和陽離子交換固定相之間的強(qiáng)疏水相互作用可能會延長保留時間和降低分辨率，這也使得離子交換層析法難以作為檢測生物胺的通用技術(shù)。由于生物胺衍生后的產(chǎn)物易產(chǎn)生拖尾問題，因此氣相色譜不常用于生物胺的測定，日后科研人員對生物胺衍生方法進(jìn)行改進(jìn)或能使其穩(wěn)定而精準(zhǔn)地用于氣相色譜的檢測。高效液相色譜法是目前生物胺定量檢測最為廣泛使用的方法，其中液相串聯(lián)質(zhì)譜法是一種集篩選、鑒定和定量于一體的檢測方法，較單純使用液相色譜省去了復(fù)雜且不穩(wěn)定的衍生化步驟，提高了檢測效率和對各種底物的適用性。

盡管過量的生物胺具有毒性作用，但在限定的范圍內(nèi)食用不會引起毒性反應(yīng)，所以世界各國都缺少生物胺每日攝入量限制，這個限制標(biāo)準(zhǔn)難度就在于同一產(chǎn)品在不同儲存條件下的生物胺含量都存在巨大差異，所以建立快捷、精準(zhǔn)、穩(wěn)定、便捷的生物胺檢測技術(shù)十分必要，這也對保障食品安全和消費(fèi)者健康非常重要。