D152樹脂對(duì)多粘菌素E的提取性能研究

趙振中,李海超

(河北圣雪大成唐山制藥有限責(zé)任公司,河北 唐山 064000)

多粘菌素E為白色或類白色粉末,味苦、無臭,易溶于水、苯甲醇,微溶于甲醇,不溶于丙酮和乙醚等,其游離堿微溶于水,目前市售產(chǎn)品為其硫酸鹽。多粘菌素E由多粘芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生,是1種多肽類抗生素,包含多種氨基酸和脂肪酸;其硫酸鹽為硫酸多粘菌素E,有較好的熱穩(wěn)定性,在pH 3.0～7.5內(nèi)較穩(wěn)定。作為抗生素,多粘菌素E與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的游離氨基酸和細(xì)胞膜中游離的磷酸根發(fā)生作用,增加細(xì)胞膜通透性,從而殺死細(xì)菌[1-2]。

多粘菌素E的提取方法主要有溶劑萃取法[3]、泡沫分離法[4]、活性炭吸附法、沉淀法[5-7]、離子交換法[8-10]等,其中離子交換法因易獲得純度較高的產(chǎn)品、成本低而得到廣泛應(yīng)用。目前制藥企業(yè)對(duì)多粘菌素E的提取工藝主要是:發(fā)酵液過濾—樹脂吸附—硫酸洗脫—洗脫液后處理。目前用離子交換法提取多粘菌素E的研究主要是利用溶解多粘菌素E成品得到的溶液進(jìn)行條件優(yōu)化選擇。但在實(shí)際生產(chǎn)中,發(fā)酵過濾液的組分復(fù)雜,不僅存在大量的殘?zhí)?、蛋白質(zhì)、色素等有機(jī)分子,也存在大量的Ca2+、Mg2+、Fe3+等無機(jī)離子,這些物質(zhì)均會(huì)對(duì)吸附過程造成影響,導(dǎo)致收率損失和產(chǎn)能降低。D152樹脂為強(qiáng)堿弱酸型陽離子交換樹脂,對(duì)抗生素具有良好的吸附作用[11]。研究D152樹脂吸附多粘菌素E的特性,旨在優(yōu)化多粘菌素E的生產(chǎn)工藝,提高產(chǎn)品質(zhì)量,為發(fā)揮現(xiàn)有生產(chǎn)裝備最大產(chǎn)能提供生產(chǎn)控制參數(shù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:Waters e2695-2489高效液相色譜儀,pHS-3C型精密酸度計(jì),電子天平(美加寧MJN-681),機(jī)械攪拌器,陶瓷膜(上海奧賽分離技術(shù)工程有限公司),水環(huán)真空泵,自制離子交換柱。

主要試劑:HCl、H2C2O4·2H2O、H2SO4、NaOH、EDTA-2Na、氨水、NH4Cl、Na2SO4等,均為分析純;試驗(yàn)用水為自制無鹽水;D152樹脂(核工業(yè)北京化工冶金研究院):濕視密度0.8 g/mL,粒度(0.27～1.0 mm)90%,水分70.4%。

試驗(yàn)樣品:多粘菌素E發(fā)酵液(河北圣雪大成唐山制藥有限責(zé)任公司)。

1.2 樹脂預(yù)處理

將D152樹脂交替用4.0%鹽酸和3.0%氫氧化鈉溶液浸泡再生3次,每次浸泡后用無鹽水洗樹脂至pH≥3.0(鹽酸浸泡時(shí))或pH≤11.60(氫氧化鈉溶液浸泡時(shí)),備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵液預(yù)處理

取發(fā)酵液,按照草酸質(zhì)量與發(fā)酵液體積比5∶1 g/L,加入H2C2O4·2H2O,攪拌30 min后經(jīng)陶瓷膜過濾處理,收集過濾液。按照試驗(yàn)要求稀釋和調(diào)整pH。

1.3.2 過濾液pH對(duì)吸附系統(tǒng)的影響

在25 ℃下,取200 mL過濾液,用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為4.0～8.0,控制機(jī)械攪拌器轉(zhuǎn)速為1 000 r/min,每1 h采用HPLC法檢測(cè)效價(jià),研究pH對(duì)多粘菌素E過濾液效價(jià)的影響。

根據(jù)現(xiàn)有生產(chǎn)參數(shù),將處理好的D152樹脂采用單柱濕法裝柱,控制徑高比為2∶5;料液溫度為25 ℃。用3.0% NaOH溶液將過濾液pH調(diào)整至4.5、5.0、6.0、7.0、8.0,然后在吸附流速1.0 BV/h條件下進(jìn)行吸附,待出口濃度與進(jìn)口濃度相等時(shí),吸附結(jié)束,計(jì)算每mL濕樹脂的吸附量。

1.3.3 過濾液效價(jià)對(duì)D152樹脂吸附量的影響

根據(jù)現(xiàn)有生產(chǎn)工藝設(shè)備進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。單柱濕法裝柱,樹脂裝量徑高比為2∶5,試驗(yàn)溫度為25 ℃,吸附流速1.0 BV/h,過濾液pH 6.0～7.0。分別將過濾液效價(jià)稀釋至25、30、35、40萬U/mL進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,待出口濃度與進(jìn)口濃度相等時(shí),終止試驗(yàn),繪制吸附量曲線。

1.3.4 吸附流速優(yōu)化

吸附流速和吸附量的平衡點(diǎn)影響產(chǎn)能的高低。因此,對(duì)吸附流速進(jìn)行研究,選擇更適合D152樹脂的吸附流速。選擇單柱濕法裝柱,樹脂裝量徑高比為2∶5,試驗(yàn)溫度為25 ℃,過濾液效價(jià)為32萬U/mL、硬度為400 μg/mL、pH 6.0～7.0,控制吸附流速為1.0、2.0 BV/h,待出口效價(jià)與進(jìn)口效價(jià)相等時(shí),終止試驗(yàn)。繪制穿透曲線和吸附曲線。

1.3.5 洗脫劑濃度優(yōu)化

以稀硫酸作為洗脫劑,按照1.0 BV/h流速進(jìn)行洗脫。在25 ℃條件下,研究洗脫劑濃度對(duì)D152樹脂洗脫效果影響。選擇在過濾液效價(jià)30萬U/mL、pH 7.0、吸附流速1.0 BV/h條件下動(dòng)態(tài)吸附飽和且清洗完畢的D152樹脂柱,進(jìn)行洗脫試驗(yàn),洗脫液濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 mol/mL,繪制洗脫曲線。

1.3.6 洗脫劑流速優(yōu)化

取吸附飽和且清洗完畢的D152樹脂進(jìn)行裝柱,選取1.3.6得到的最佳洗脫劑濃度,以不同的洗脫流速(0.5、1.0、1.5 BV/h)進(jìn)行洗脫試驗(yàn),繪制洗脫曲線。

1.3.7 生產(chǎn)工況性能評(píng)價(jià)

根據(jù)上述優(yōu)化條件調(diào)整生產(chǎn)工藝參數(shù),從產(chǎn)能、物料質(zhì)量、收率、樹脂運(yùn)行情況等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。生產(chǎn)采用3柱串聯(lián)吸附工藝,依過濾液流向分別作為主、副、次交換柱,吸附方式采用自下而上的反進(jìn)吸附方式,切換周期8 h。

1.4 檢測(cè)方法

使用高效液相色譜法對(duì)多粘菌素E的效價(jià)進(jìn)行檢測(cè),具體測(cè)定方法參考2020版獸藥典[12]。按照《水質(zhì) 鈣和鎂總量的測(cè)定 EDTA滴定法》(GB/T 7477—1987)檢測(cè)溶液總硬度[13]。

1.5 計(jì)算公式

吸附收率=(c1V1-c2V2)/c1V1×100%,

洗脫收率=c3V3/(c1V1-c2V2)×100%,

總收率=吸附收率×洗脫收率,

式中:c1—過濾液效價(jià),U/mL;c2—吸附廢水效價(jià),U/mL;c3—洗脫液效價(jià),U/mL;V1—過濾液體積,mL;V2—吸附廢水體積,mL;V3—洗脫液體積,mL。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 過濾液pH對(duì)吸附系統(tǒng)的影響

多粘菌素E在不同pH條件下,效價(jià)隨時(shí)間變化情況見圖1。多粘菌素過濾液效價(jià)在pH 6.0～7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好,在堿性條件下降解嚴(yán)重,這與文獻(xiàn)[14-16]表述一致。

圖1 過濾液pH對(duì)多粘菌素E穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effect of filtrate pH on the stability of polymyxin E

D152樹脂在不同pH條件下的吸附量見圖2。可以看出,D152樹脂的吸附量隨著過濾液pH的升高而明顯增加。這是由于D152樹脂上的—COONa為弱酸性基團(tuán),其電離程度受溶液pH影響很大,尤其是在強(qiáng)酸性條件下很難發(fā)生離子交換反應(yīng),所以D152樹脂的吸附量隨溶液pH下降而減小,隨pH升高而增加。在實(shí)際應(yīng)用中考慮到多粘菌素E的穩(wěn)定性,將過濾液pH控制在6.0～7.0內(nèi)進(jìn)行吸附。

圖2 過濾液pH對(duì)D152樹脂吸附量的影響Fig. 2 Effect of filtrate pH on adsorption capacity of D152 resin

2.2 過濾液效價(jià)對(duì)吸附量的影響

過濾液效價(jià)是影響產(chǎn)能和D152樹脂吸附量的重要因素之一。模擬了動(dòng)態(tài)吸附條件下,過濾液效價(jià)對(duì)D152樹脂吸附量的影響,結(jié)果見圖3～圖4?？梢钥闯?過濾液效價(jià)在25～40萬U/mL,D152樹脂吸附量呈緩慢遞增趨勢(shì);效價(jià)大于30萬U/mL以后,D152樹脂吸附速率基本不增加。

圖3 過濾液效價(jià)對(duì)D152樹脂吸附量的影響Fig. 3 Effect of filtrate titer on adsorption capacity of D152 resin

圖4 D152樹脂吸附曲線Fig. 4 D152 resin adsorption curve

分析其原因,認(rèn)為是由于在過濾液效價(jià)較低時(shí),離子交換速率主要是由外擴(kuò)散控制,此時(shí)濃度增加,交換速率也會(huì)增加;但隨著效價(jià)增加,交換速率受內(nèi)擴(kuò)散和外擴(kuò)散同時(shí)作用,此時(shí)交換速率增加緩慢;繼續(xù)增加過濾液效價(jià),離子交換過程主要受內(nèi)擴(kuò)散控制,交換速率到達(dá)極限,此時(shí)會(huì)造成收率損失。所以實(shí)際生產(chǎn)過程中,為了同時(shí)保證吸附收率和產(chǎn)能,過濾液效價(jià)應(yīng)盡可能控制在30萬U/mL左右。

2.3 過濾液流速對(duì)吸附量的影響

過濾液流速對(duì)D152樹脂吸附量的影響見圖5～圖6。

圖5 不同流速下D152樹脂的穿透曲線Fig. 5 Penetration curves of D152 resin at different flow rates

圖6 過濾液流速對(duì)D152樹脂吸附量的影響Fig. 6 Effect of filtrate flow rate on adsorption capacity of D152 resin

從圖5可看出,在1.0 BV/h流速下吸附8 h,出口溶液的效價(jià)為900 U/mL,而2.0 BV/h流速吸附8 h出口效價(jià)為5 000 U/mL左右,說明過濾液效價(jià)增加至30萬U/mL,D152樹脂性能完全滿足生產(chǎn)要求(1.0 BV/h)。在常溫稀溶液中,離子的化合價(jià)越高,越易被交換[17]。多粘菌素E在溶液狀態(tài)下呈+5價(jià),所以隨著吸附過程的進(jìn)行,多粘菌素E會(huì)置換已經(jīng)被吸附的Ca2+、Mg2+,因此出口溶液的硬度會(huì)增加(圖6)。但隨著多粘菌素E吸附量的增加,出口溶液的效價(jià)不可控,造成收率損失。雖然較低流速能夠增加吸附量,但會(huì)降低生產(chǎn)效率,所以選擇1.0 BV/h流速作為吸附上柱流速。

2.4 洗脫劑濃度選擇

洗脫劑濃度對(duì)洗脫液出口效價(jià)的影響見圖7～圖8。

圖8 洗脫劑濃度對(duì)洗脫液pH的影響Fig. 8 Effect of eluent concentration on eluate pH

從圖7～圖8可看出,0.2 mol/L硫酸的洗脫曲線出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象,洗脫時(shí)間較長(zhǎng),影響進(jìn)度與產(chǎn)能;而0.5 mol/L硫酸的洗脫曲線,高效價(jià)集中,但pH下降較快,過低的pH會(huì)增加后續(xù)的中和難度,增加處理成本。所以洗脫劑以0.3～0.4 mol/L硫酸為宜。

2.5 洗脫劑流速優(yōu)化

選擇動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)考察洗脫劑流速對(duì)D152樹脂吸附多粘菌素E的影響。不同流速下的洗脫曲線見圖9。

圖9 單柱洗脫曲線Fig. 9 Single column elution curve

從圖9可看出,當(dāng)洗脫液流速在1.0～1.5 BV/h時(shí),洗脫曲線峰型較好,沒有出現(xiàn)明顯的拖尾;當(dāng)洗脫流速為2.0 BV/h時(shí),雖能較快回收高效價(jià)段,但拖尾比較明顯,且pH降低較快。所以確定適宜的洗脫液流速為1.0～1.5 BV/h,此時(shí)洗脫液效價(jià)較高且pH較為適中,有利于后續(xù)工藝進(jìn)行。

2.6 生產(chǎn)工況性能評(píng)價(jià)

2.6.1 運(yùn)行評(píng)價(jià)

在3柱串聯(lián)吸附工藝下,相比第1吸附周期,D152樹脂的第2周期和第3周期的平均吸附量分別增加25.90%和53.85%。從洗脫曲線來看,在8 h切柱周期內(nèi),洗脫液總pH在2.0左右,高效價(jià)段較為集中。連續(xù)運(yùn)行周期內(nèi)各柱吸附量變化和洗脫曲線見圖10～圖11。

圖10 不同周期吸附量Fig. 10 Adsorption capacity of different cycles

圖11 周期內(nèi)各柱洗脫曲線Fig. 11 Elution curve of each column in the period

2.6.2 收率評(píng)價(jià)

根據(jù)生產(chǎn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):吸附平均收率為98.96%,洗脫平均收率為99.18%,提取總收率為98.15%。可以看出,D152樹脂對(duì)多粘菌素E提取效果良好,平均收率達(dá)98.0%以上。收率損失主要包括:1)吸附廢水中約有0.3%～0.5%的損失;2)在實(shí)際生產(chǎn)過程中,D152樹脂堿性再生pH控制在11.60以下(否則耗水量將急劇增加),堿性較強(qiáng)的環(huán)境會(huì)造成多粘菌素E變性,導(dǎo)致收率損失。

2.6.3 D152樹脂性能評(píng)價(jià)

為了考察D152樹脂在實(shí)際生產(chǎn)中的性能變化,在樹脂運(yùn)行6個(gè)月時(shí)進(jìn)行了理化性能分析檢測(cè),并將檢測(cè)結(jié)果與新樹脂指標(biāo)對(duì)比(表1)。

表1 D152樹脂運(yùn)行6個(gè)月前后理化性能對(duì)比Table 1 Comparison of physicochemical properties of D152 resin before and after 6 months operation

從表1可看出,D152樹脂在運(yùn)行6個(gè)月后,理化性能指標(biāo)基本保持穩(wěn)定。由于受反洗操作影響,樹脂在使用過程中會(huì)出現(xiàn)磨損;但樹脂交換當(dāng)量變化不大,與新樹脂相當(dāng)。

3 結(jié)論

用D152樹脂提取多粘菌素E時(shí),控制過濾液效價(jià)30萬U/mL、pH 6.0～7.0、吸附流速1.0 BV/h、樹脂裝量徑高比2∶5、洗脫劑硫酸濃度0.3～0.4 mol/L、洗脫流速1.0～1.5 BV/h,采用3柱串聯(lián)吸附工藝,更適合現(xiàn)有生產(chǎn)設(shè)備。此時(shí),D152樹脂吸附量可達(dá)680萬U/mL濕樹脂,洗脫液pH≥1.80,總收率≥98.0%,得到的洗脫液效價(jià)穩(wěn)定。