左旋半胱氨酸通過調(diào)控PI3K/AKT 通路減輕大鼠腦缺血損傷的研究

邵麗麗，陸琦，潘學(xué)威，朱思亮

作者單位： 325000 浙江省溫州，溫州市中心醫(yī)院

缺血性腦血管病具有高發(fā)病率和高死亡率的特點。細胞凋亡是缺血性腦損傷中的重要病理進程[1]。在腦缺血中細胞凋亡受多種基因調(diào)控，包括Caspase、Bcl-2 和p53 基因家族，這些基因與PI3K-Akt途徑相關(guān)，該途徑參與調(diào)節(jié)各種其他細胞功能，如細胞增殖、細胞分化和葡萄糖轉(zhuǎn)運并且有神經(jīng)保護作用[2]。目前尚缺乏左旋半胱氨酸（L-Cys）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中作用機制的報道，但已有研究提示L-Cys 在CNS 相關(guān)疾病中具有潛在的神經(jīng)保護作用。在CNS 中，L-Cys 由胱硫醚- -合酶催化，該酶主要在星形膠質(zhì)細胞中表達并產(chǎn)生內(nèi)源性H2S[3]。L-Cys 可通過H2S 使血管舒張并間接調(diào)節(jié)細胞反應(yīng)[4]。此外，H2S 在CNS 相關(guān)疾病中的神經(jīng)保護作用已被證實[5]。然而，L-Cys 在腦缺血模型中的潛在作用及機制尚不清楚。本文探討L-Cys 通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路對缺血性腦卒中的神經(jīng)保護作用及機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2，3，5 氯化三苯基四氮唑（TTC）、Nissl染色試劑盒和總RNA 提取試劑盒（Solarbio 公司）；蘇木精（HE）染色試劑盒和TUNEL 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；胰蛋白酶和胚胎牛血清（Gibco公司）；實時PCR（qPCR）檢測試劑盒（Agilent公司）；p-Akt、p-PI3K、PI3K、Akt、Bim、-actin、Bax、Bcl-2 和GAPDH 抗體（CST 公司）。

1.2 動物模型 選取50 只雄性SD 大鼠（SPF 級），體質(zhì)量（200±10）g，8～10周齡[購自杭州啟真實驗動物科技有限公司（動物質(zhì)量合格證號：WZQZ2021101517）]，建立大腦中動脈閉塞模型（MCAO）模型。首先通過腹腔注射水合氯醛（10%，400 mg/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，沿頸部中線切開，分別暴露左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），將ICA、CCA 和ECA 的近端用微動脈夾鉗夾住；隨后在CCA 中切下一小部分（長4 mm）并將線塞插入ICA；然后輕輕插入塞子，直到感覺到輕微阻力；最后結(jié)扎CCA 遠端并縫合。模型成功的判斷標準是大鼠醒來時右眼出現(xiàn)Horner 綜合征。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理 將大鼠隨機分為5 組（n=10）：Sham 組（假手術(shù)組）、MCAO 組、L-Cys 組（MCAO+L-Cys）、LY294002 組[MCAO+PI3K-Akt通路特異性抑制劑（LY294002）]、L-Cys+LY294002組（MCAO+L-Cys+LY294002）。于術(shù)后2、24 和48 h連續(xù)腹腔注射L-Cys（5 mg/kg）3 次，最后1 次注射后24 h 進行實驗觀察。LY294002 使用DMSO 稀釋至0.5 mg/ml 制備儲備溶液。在建模前30 min 腹腔注射10l 的LY294002 儲備液。

1.3.2 神經(jīng)功能評分 建模后評估大鼠腦組織缺血再灌注損傷程度。根據(jù)Zea-Longa 神經(jīng)功能缺損評分標準，基于行為變化記錄大鼠的神經(jīng)功能。

1.3.3 腦缺血程度 使用2%TTC 染色。栓塞體積通過Image J 計算，梗死面積=（對側(cè)半球面積-同側(cè)非梗死面積）/對側(cè)半球體積×100%。

1.3.4 腦組織變化 處死后大鼠后立即取出腦組織置于4%多聚甲醛內(nèi)24 h，隨后將腦組織進行石蠟包埋并切片（厚度約4m）。按照說明書進行HE 染色或Nissl 染色。使用顯微鏡（NIKON ECLIPSE TI-SR和NIKON DS-U3）拍攝（200 倍顯微觀察）收集樣品的圖像。具體操作步驟按照說明書進行。

1.3.5 細胞凋亡 使用TUNEL 染色試劑盒檢測大鼠腦組中的凋亡細胞。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，計算3 個非重疊腦組織區(qū)域中TUNEL 陽性（凋亡）細胞的數(shù)量。

1.3.6 腦組織PI3K/AKT 通路蛋白及凋亡相關(guān)因子表達水平 主要抗體按如下比例稀釋：p-Akt（1∶500），p-PI3K（1∶1 000），PI3K（1∶1 000），Akt（1∶1 000），Bad（1∶1 000），Bim（1∶2 000），Bax（1∶500），Bcl-2（1∶500），GAPDH（1∶1 000），然后使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑用Westernblot 檢測蛋白質(zhì)條帶。每個實驗重復(fù)3 次取平均值。

1.3.7 腦組織p53、血清細胞色素C（Cyt-C）和MDM2 的mRNA 表達水平 使用TRIzol 法提取樣本總RNA，之后按照試劑盒進行qRT-PCR。qRT-PCR條件如下：95 ℃變性5 min，然后是40 個循環(huán)，95 ℃15 s，60 ℃60 s。用于qRT-PCR 的引物序列如表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計方法 使用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，兩組比較采用t 檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位間距）表示，采用Kruskal-Wallis H 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 除Sham 組外，其他4 組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損傷。與Sham 組相比，MCAO 組各時間點評分均顯著升高（均P ＜0.05）；與MCAO 組相比，L-Cys 組、L-Cys+LY294002 組的72 h 評分低（均P ＜0.05）；與L-Cys 組相比，L-Cys+LY294002 組72 h 評分高（P ＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后2、24、48、72 h 神經(jīng)功能評分

2.2 腦梗死體積 與Sham 組相比，MCAO 組的梗死體積大（P ＜0.05）；與MCAO 組相比，L-Cys 組的梗死體積小（P＜0.05）；與L-Cys 組相比，LY294002組、L-Cys+LY294002 組的梗死體積大（均P ＜0.05），L-Cys+LY294002 組的梗死體積與LY294002組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見圖2。

圖2 TTC 染色觀察各組大鼠腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積變化

2.3 皮層的組織病理學(xué) Sham 組大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)正常，輪廓清晰，細胞質(zhì)均勻著色，細胞核位于細胞中心，腦組織紋理清晰。MCAO 組和LY294002組皮質(zhì)神經(jīng)元均有不同程度的損傷，神經(jīng)元萎縮，輪廓模糊，細胞質(zhì)深染，細胞核與細胞質(zhì)邊界不清，腦組織質(zhì)地紊亂，尼氏小體數(shù)量明顯減少。與MCAO組相比，L-Cys組神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞壞死、核濃縮、細胞膜和細胞結(jié)構(gòu)破壞等病理改變均有所改善。與LCys 組相比，LY294002 組、L-Cys+LY294002 組的神經(jīng)元壞死增加，病理改變加重，L-Cys+LY294002 組的神經(jīng)元形態(tài)較LY294002 組無明顯差別，見圖3。

圖3 皮層組織病理改變（HE 染色、Nissl 染色，×200）

2.4 腦組織細胞凋亡程度 與Sham組相比，MCAO組的細胞凋亡多（P ＜0.05）；與MCAO 組相比，在L-Cys 組中細胞凋亡少（P ＜0.05）；與L-Cys 組相比，LY294002 組、L-Cys+LY294002 組的細胞凋亡多（均P ＜0.05）；L-Cys+LY294002 組的細胞凋亡水平與LY294002組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 腦組織細胞凋亡（×200）

2.5 PI3K-Akt 通路相關(guān)蛋白的表達水平 與Sham組相比，MCAO 組p-Akt、p-PI3K 蛋白表達水平下調(diào)（均P ＜0.05）；與MCAO 組相比，L-Cys 組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達升高（均P ＜0.05）；與L-Cys 組相比，LY294002 組、L-Cys+LY294002 組腦組織中p-Akt、p-PI3K、PI3K 和Akt 蛋白的表達水平降低（均P＜0.05）；L-Cys+LY294002 組腦組織p-Akt 蛋白表達較LY294002 組顯著上調(diào)（P＜0.05），其他指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見圖5。

2.6 腦組織凋亡相關(guān)因子的表達水平 與Sham組相比，MCAO 組腦組織Bad、Bim 和Bax 蛋白表達水平上調(diào)，而Bcl-2 蛋白表達水平下調(diào)（均P ＜0.05）；與MCAO 組相比，L-Cys 組腦組織中Bad、Bim 和Bax蛋白表達水平下調(diào)，Bcl-2 蛋白表達水平上調(diào)（均P ＜0.05）；與L-Cys 組相比，LY294002 組和L-Cys+LY294002 組腦組織中Bad、Bim 和Bax 蛋白表達上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達量下調(diào)（均P ＜0.05）。LY294002組和L-Cys+LY294002 組各指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見圖6。與Sham 組相比，MCAO組腦組織p53 mRNA 水平上調(diào)（P＜0.05）；與MCAO組相比，L-Cys 組腦組織p53 mRNA 水平下調(diào)（P ＜0.05）；與L-Cys 組相比，LY294002 組和L-Cys+LY294002 組腦組織中p53 mRNA 水平上調(diào)（均P ＜0.05），見圖6。

圖6 不同組大鼠腦組織凋亡相關(guān)因子的蛋白及mRNA 表達水平

2.7 Cyt-C和MDM2 的mRNA表達水平 與Sham組相比，MCAO 組大鼠血清Cyt-C 和MDM2 的mRNA 水平高（均P ＜0.05）；與MCAO 組相比，LCys 組Cyt-C、MDM2 的mRNA 表達水平低（均P ＜0.05）；與L-Cys 組相比，LY294002 組和L-Cys+LY294002 組Cyt-C 和MDM2 的mRNA 表達水平均高（均 P ＜ 0.05）；LY294002 組和 L-Cys+LY294002 組各指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見圖7。

圖7 各組大鼠血清Cyt-C 和MDM2 的mRNA 表達水平

3 討論

腦缺血損傷是由許多因素引起的，而在這些病理生理進程中細胞凋亡是細胞死亡的主要原因[6]。細胞凋亡是一個基因調(diào)控的主動死亡過程，其中caspase-3、Bcl-2 和Bax 基因起著重要的調(diào)控作用。

Akt 激活在腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)元存活過程中起重要作用。在MCAO 模型大鼠中，Akt1 過表達可以使腦缺血后的梗塞面積降低35%[7]。最近研究還發(fā)現(xiàn)，Aktl 對大鼠缺血再灌注損傷具有重要的保護作用，Akt過表達可將腦梗死組織的體積下降50%[8]。此外，Akt 通路激活所介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用已在許多研究中得到證實[9]。本研究通過對MCAO模型注射L-Cys 和LY294002，構(gòu)建MCAO 挽救模型及MCAO 的PI3K-AKT 通路抑制模型，并通過對各組小鼠的行為學(xué)、大腦梗死體積和病理、細胞凋亡程度、PI3K-Akt通路相關(guān)蛋白的蛋白表達水平、腦組織凋亡相關(guān)因子的表達水平和血清Cyt-C和MDM2的表達水平比較，證明了L-Cys 的神經(jīng)保護作用可能是通過PI3K-Akt 途徑介導(dǎo)的。

p53 和MDM2 基因都與細胞凋亡相關(guān)，并且在Akt 下游信號傳導(dǎo)中至關(guān)重要[10]。本研究結(jié)果顯示，與sham 組相比，MCAO 組p53 和MDM2 表達水平上調(diào)；與MCAO 組相比，L-Cys 組p53 和MDM2 表達水平下調(diào)。當(dāng)PI3K-Atk 通路的激活被抑制時，LCys 的作用大大減弱，這表明L-Cys 的神經(jīng)保護作用的機制涉及通過PI3K-Atk 信號通路調(diào)節(jié)p53 基因表達。但是由于PI3K 通路的抑制劑LYZ94002未能完全阻斷這種作用，因此不能排除有其他通路參與到L-Cys 的神經(jīng)保護作用的機制中。

PI3K-Akt 的磷酸化導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)錄因子和Cyt-C氧化酶的上調(diào)，導(dǎo)致ATP 生成減少和細胞死亡[11]。Cyt-C 的釋放是由促凋亡基因Bax 的表達誘導(dǎo)的，抗凋亡基因Bcl-2 會阻止Cyt-C 的釋放和半胱天冬酶的激活[12]。Bax 和Bcl-2 都是PI3K-Akt 信號通路中的下游蛋白，它們調(diào)節(jié)線粒體中Cyt-C 的釋放和caspase 的激活[13]。本研究的結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)一致。

本研究表明，L-Cys可以通過減少腦組織細胞的炎癥反應(yīng)和凋亡來保護大鼠腦組織免受缺血再灌注損傷，這種作用是受PI3K-Akt 通路介導(dǎo)的。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 邵麗麗、陸琦：實驗操作、論文撰寫；邵麗麗、潘學(xué)威：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析；朱思亮：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費支持