經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、體外擴增及形態(tài)學(xué)特點

摘要：目的 從婦女經(jīng)血來源的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞（MenSSCs）中獲得一種具有特殊生物學(xué)特性的細(xì)胞。方法 用 Percoll濃度梯度離心法對大鼠月經(jīng)血進(jìn)行了分離和傳代培養(yǎng)；免疫熒光法測定培養(yǎng)細(xì)胞Vimentin的表達(dá)情況，鑒定細(xì)胞來源；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定 MSCs表面標(biāo)志物CD90、CD146的表達(dá)。結(jié)果 利用 Percoll濃度梯度離心法，可使婦女經(jīng)期血液中的原代細(xì)胞呈漩渦狀、放射狀或集落狀；增殖快，傳代周期約7～8 d；結(jié)果表明，經(jīng)傳代培養(yǎng)，其增殖速度較快，且主要為成纖維細(xì)胞。經(jīng)免疫熒光法鑒定，該細(xì)胞為 Vimentin （vimentin）表達(dá)的間質(zhì)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果表明，在傳代培養(yǎng)的第1代和第3代細(xì)胞中，CD90和CD146擁有較高的表達(dá)，CD146也有較低的表達(dá)。第三代細(xì)胞CD146的表達(dá)率高于第一代細(xì)胞。結(jié)論 從月經(jīng)血中分離培養(yǎng)的細(xì)胞來源于間質(zhì)；具有干細(xì)胞特性：具有高度增殖能力，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物；用傳代法對細(xì)胞進(jìn)行提純。

關(guān)鍵詞：血源性；干細(xì)胞；傳代培養(yǎng)；鑒定

干細(xì)胞由于具有細(xì)胞保護(hù)、再生和免疫調(diào)節(jié)能力備受關(guān)注[1]。成體干細(xì)胞在目前的研究中是首選，這些未成熟的干細(xì)胞在進(jìn)入臨床之前，還要面臨致畸、倫理問題、高成本和低效率等問題。目前，源自骨髓和臍帶血的細(xì)胞已經(jīng)成為細(xì)胞療法。后來開始研究一些更容易獲得的組織來源，主要是一次性組織，如胎盤、羊水、羊膜、臍帶組織、牙髓和脂肪組織等[2]。由于間充質(zhì)細(xì)胞具有良好的體內(nèi)修復(fù)能力，已被更廣泛地研究。間充質(zhì)細(xì)胞不自主表達(dá)MHC-II分子，具有低免疫原性和耐受能力，因此它們已經(jīng)被研究為治療自身免疫性疾病、炎癥性疾病和退行性疾病的工具。連續(xù)的研究報告了不同來源的間充質(zhì)細(xì)胞，可能或多或少適合于特定疾病的治療[3～4]。

從婦女經(jīng)期血液進(jìn)行分離和純化，其對形態(tài)學(xué)和生長特性進(jìn)行了觀察，并對其進(jìn)行了體外擴增，并通過免疫熒光及流式細(xì)胞分析技術(shù)鑒定細(xì)胞來源，以及分析間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD90、CD146）的表達(dá)情況，可以為科研或單位在 MenSCs細(xì)胞制品的制作過程中提供借鑒。

1材料及方法

1.1 材料來源

1.1.1 研究對象

選取月經(jīng)規(guī)律的育齡期健康女性30名為研究對象。排除標(biāo)準(zhǔn)：近6個月內(nèi)使用性激素或?qū)m內(nèi)放置節(jié)育器者；異常有子宮出血的癥狀，或者是有其他的婦科疾病，比如子宮腺肌癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉等。所有受試者都已知曉并簽字，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.1.2 細(xì)胞獲取與處理

在捐助者經(jīng)期第2～3天采集5～10 ml的經(jīng)血，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到了含有青霉素/鏈霉素（1%）的 PBS緩沖液中，24 h之內(nèi)將樣品運輸?shù)搅藢嶒炇?，在運輸?shù)綄嶒炇抑?，這些樣品應(yīng)該放在4℃的環(huán)境下進(jìn)行存儲。

1.2 細(xì)胞分離及培養(yǎng)

1.2.1 細(xì)胞分離

在實驗室取出存儲的經(jīng)血樣本5 ml，以等量的消毒PBS-緩沖劑稀釋，攪拌，轉(zhuǎn)速1500 r/min，沖洗5 min，重復(fù)2次，去掉上層清液，加3 ml完整的培養(yǎng)基重新懸浮，3 ml的淋巴細(xì)胞分離物 Percoll在另一根離心管內(nèi)，3 ml的細(xì)胞懸浮物慢慢地加到Percoll上。注意不要損壞細(xì)胞懸液-培養(yǎng)基的分界面，于室溫下以1800 r/ min的速度離心25 min，在離心完畢后，將Percoll和介質(zhì)間所形成的白色薄膜取出，并轉(zhuǎn)移到一個新的離心管內(nèi)。用3 mlPBS-緩沖劑使細(xì)胞重新懸浮，然后在室溫下以1500 r/ min的速度離心5 min，反復(fù)清洗，將上層清液完全除去。用DMEM/F12完全培養(yǎng)基（10%（V/V）FBS，1%雙抗（青霉素/鏈霉素）重新懸浮，計數(shù)，調(diào)節(jié)到合適的濃度，然后將其接種在涂有 FN纖維連接蛋白的玻璃瓶中，放入5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃。每隔24 h用顯微鏡觀察細(xì)胞的粘附和生長。每隔72 h更換一種新的培養(yǎng)基，將沒有貼壁的細(xì)胞剔除，每隔3～4 d更換一次新的培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

等瓶子里的紡錘體細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時進(jìn)行傳代。加入0.25%胰蛋白酶，將其放到37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，進(jìn)行2 min的消化。在顯微鏡下對其進(jìn)行觀察，可以看到貼壁細(xì)胞間隙逐漸增大，細(xì)胞逐漸變圓，并有部分細(xì)胞已從培養(yǎng)瓶上脫落。將培養(yǎng)瓶置再次放置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)消化2 min，如此反復(fù)，直至有90%以上的粘附細(xì)胞脫離。通過添加等體積的完整培養(yǎng)基來結(jié)束該消化，并以1000 r/ min的速度將細(xì)胞懸浮液移走離心5 min。取上清液，以2 ml純正培養(yǎng)液對試管進(jìn)行重新懸浮，并調(diào)節(jié)其濃度，以1：2的比例接種于試管內(nèi)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以（±s）表示，采用ｔ檢驗，計數(shù)資料用比率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點

細(xì)胞接種培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始出現(xiàn)了平鋪性的貼壁生長，其形狀為梭形或多邊形，具有明顯的輪廓，混有少量圓形的紅細(xì)胞（圖1a）。每天在顯微鏡下，對細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行觀察，每3 d換液一次，將未貼壁的細(xì)胞及雜質(zhì)剔除掉。第3天可以看到部分細(xì)胞出現(xiàn)集落狀生長，集落大小和分布都不均勻（圖1 b）。大約培養(yǎng)7 d后，可以看到約80%的細(xì)胞融合（圖1 c）。15 d后，細(xì)胞聚集在一起，形成了一個漩渦，放射狀的群落（圖1 d）。

當(dāng)融合率達(dá)80%時開始傳代，傳代時間為7～8 d。隨著代數(shù)的增加，大多數(shù)雜質(zhì)可被去除，并且細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于同類化（圖2a～b）。

2.2 免疫熒光染色法觀察細(xì)胞Vimentin的表達(dá)

Vimentin（波形蛋白）是一種III型中間絲蛋白，是間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物。用免疫熒光法對一、三代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果顯示Vimentin在細(xì)胞中的表達(dá)呈陽性： Vimentin用 DAPI標(biāo)記的細(xì)胞骨架顯示出綠光，用來標(biāo)記的細(xì)胞核顯示出藍(lán)光，可觀察到細(xì)胞的形態(tài)呈扁平的梭形或多邊形。確認(rèn)作為間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞源（圖3 a～b）。對照組結(jié)果為陰性。

2.3 流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞中CD90及CD146的表達(dá)情況

對培養(yǎng)的第1代和第3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析，結(jié)果顯示CD90在細(xì)胞中呈高表達(dá)，CD146呈低表達(dá)。CD90的陽性表達(dá)率在第1代和第3代細(xì)胞中分別為54.3%和47.3%，沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.918）。CD146的陽性表達(dá)率在第1代和第3代細(xì)胞中分別為0.29%和4.27%，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.0001）（圖4～5）。

3討論

子宮厚度可以影響到胚胎的發(fā)育，8～14 mm的子宮內(nèi)膜厚度可以極大地促進(jìn)胚胎發(fā)育，從而為其發(fā)育提供良好的環(huán)境。機械性損傷、服用藥物以及年齡增長，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜變得較薄的情況非常普遍，子宮內(nèi)膜薄不利于孕卵的著床。隨著時代的進(jìn)步，晚婚晚育的情況變得日益普及，這就使得由于年齡而引起的子宮內(nèi)膜薄的情況變得更加嚴(yán)重。由于多種原因，子宮內(nèi)膜的細(xì)胞增殖受到了嚴(yán)重的阻礙，從而導(dǎo)致其發(fā)育受到限制。目前，治療薄型子宮內(nèi)膜（TE）的主要方法是采用藥物治療，其中包括使用雌激素、阿司匹林和枸櫞酸西地那非等藥物。除了傳統(tǒng)的血漿、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）以及骨盆底神經(jīng)肌肉電刺激（NMES），現(xiàn)在也提供了多種治療方案滿足患者的不同需求。

近年來，“萬能細(xì)胞”的發(fā)現(xiàn)極大地推動了干細(xì)胞自我更新和多向分化的發(fā)展，這一發(fā)展趨勢也引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，尤其是在薄型子宮內(nèi)膜研究方面，這一課題受到了極大的重視。本研究利用密度梯度離心方法進(jìn)行篩選，可以除去大多數(shù)的紅血球，從而達(dá)到初步純化的目的。在此基礎(chǔ)上，對原代細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，利用Percoll初步分離月經(jīng)血，觀察原代培養(yǎng)的細(xì)胞，僅存有少量紅細(xì)胞雜質(zhì)。FN是一種細(xì)胞培養(yǎng)液，它可以促進(jìn)細(xì)胞的貼壁率超過90%，還可以提高細(xì)胞的成活率，縮短生長周期。此外，在本試驗中，所用的試管都涂有纖維連接蛋白，這也是決定試管能否成功的重要原因。

參考文獻(xiàn)

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