三疣梭子蟹PtToll6基因克隆及其在免疫中的功能研究*

張偉偉 呂建建 李玉坤 初凡智 高保全 劉 萍

三疣梭子蟹基因克隆及其在免疫中的功能研究*

張偉偉1, 2呂建建2李玉坤1, 2初凡智1, 2高保全2劉 萍2①

(1. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306; 2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 海水養(yǎng)殖生物育種與可持續(xù)產出全國重點實驗室 山東青島 266071)

克隆了三疣梭子蟹TLR家族的一個新基因, 將其命名為。該基因全長為4 034 bp, 預測分子量為109.078 kDa, 理論等電點為6.06, 共編碼977個氨基酸。SMART預測顯示,具有Toll樣受體典型的結構域, 包括前端的序列區(qū)(LRR)、跨膜區(qū)(TM)和胞內(TIR)區(qū), 進化樹分析表明其與同屬節(jié)肢動物門的果蠅聚為一支。組織表達分布結果顯示,在肝胰腺中特異性地高表達, 其次表達于腸道, 在鰓中的表達量最低。采用3種PAMPs進行注射刺激, 發(fā)現對脂多糖的響應最為強烈, 在感染48 h后的表達量為對照組的上千倍, 推測其可能為基因主要識別的病原相關分子模式。在人工感染副溶血弧菌后的12 h開始上調表達, 至24 h達到峰值(上調9.02倍)。采用RNAi敲降后, MyD88的表達量相應下調, 同時發(fā)現感染副溶血弧菌后的死亡率顯著提高, 為陰性對照組的1.8倍。實驗結果表明:基因在抗副溶血弧菌中發(fā)揮重要功能。本實驗對解析三疣梭子蟹抵御病原入侵的分子機制具有重要指導作用。

三疣梭子蟹; Toll樣受體; 模式識別受體; 病原相關分子模式

三疣梭子蟹()隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(), 地理分布集中在我國渤海、黃海, 以及日本等海域, 肉多且脂膏肥美, 具有十分重要的經濟價值(戴愛云等, 1977; 薛俊增等, 1997)。隨著人工養(yǎng)殖的規(guī)模逐漸擴大, 苗種參差不齊,導致病害嚴重, 給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失。副溶血弧菌()是三疣梭子蟹主要的致病菌之一, 可以誘導肝胰腺壞死病等多種病癥, 該病原可引發(fā)梭子蟹生長緩慢、嗜睡、空腹、空腸, 最終致其死亡(郝景偉等, 2019; 霍詩天等, 2022)。與哺乳類動物不同的是, 三疣梭子蟹沒有B淋巴細胞和T淋巴細胞, 缺少獲得性免疫系統(tǒng)。在應對病原入侵時, 只能依賴于與生俱來的先天性免疫系統(tǒng), 通過免疫信號通路級聯反應來實現識別清除病原的作用(Uematsu, 2008)。因此, 研究其先天性免疫機理對三疣梭子蟹抗病以及新品種培育有著重要意義。

Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)等模式識別受體(Pathogen recognize receptor, PRR)能夠在病原刺激中介導三疣梭子蟹等甲殼動物的先天免疫, 各類PRR都能通過識別病原中某種保守的病原相關分子模式(Pathogen associated molecular pattern, PAMPs), 啟動先天性免疫應答(Carty, 2010)。TLR家族基因具有高度的保守性, 在漫長的生物進化歷程中末端的TIR結構域都高度同源, 且Toll蛋白均屬于Ⅰ型跨膜結構蛋白。其結構包括胞外在免疫中起到關鍵識別作用的序列區(qū)(LRR)、跨膜區(qū)(TM)和與白介素受體高度同源的胞內區(qū)(TIR) (Slack, 2000; 章曉聯等, 2002; Uribe, 2011)。TLR家族下信號通路主要有兩種依賴途徑, 一條是MyD88 (髓樣分化因子88)依賴途徑, 另一條是非依賴MyD88途徑, 通過TRIF進行信號轉導, MyD88與TRIF都屬于TLR的下游接頭分子(Yamamoto, 2002; Tang, 2012)。目前在甲殼動物中, TLRs家族基因都只進行了一些基礎性的研究, 如Yang等(2007)在凡納濱對蝦()中發(fā)現了一個Toll樣受體, 命名為, 這是在甲殼動物中發(fā)現的首個TLR家族基因。另外, 在三疣梭子蟹中已克隆了5個TLR基因并初步分析其在病原脅迫后的表達模式(Zhou, 2015; 張杰, 2017)。然而, 相比哺乳類(王有琴等, 2021; 章琳俐等, 2021)和昆蟲類(Yagi, 2010), 甲殼動物TLR基因的研究基礎相對薄弱, 主要體現在: (1) 尚不明確其識別的PAMPs, (2) 缺乏必要的功能驗證研究, (3) 對其分子調控通路解析不足。

本實驗克隆了三疣梭子蟹基因, 分析了該基因的組織表達分布特征, 明確了其主要識別的PAMPs。初步驗證了基因在抗副溶血弧菌感染中具有一定作用, 可能依賴MyD88途徑發(fā)揮免疫功能。研究結果為深入解析甲殼動物TLR基因的功能提供依據, 同時可為三疣梭子蟹抗病良種培育提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品的采集

實驗所用的三疣梭子蟹取自于山東省昌邑市海豐水產公司。在飼養(yǎng)至80日齡時, 選取健康有活力的三疣梭子蟹[體重為(30±5) g], 將其置于一個20 m3的混凝土池塘中暫養(yǎng)7 d, 用于后續(xù)實驗。實驗條件保持晝夜水溫(25±3) °C, 鹽度35, pH 8.7。每天對水體進行換水, 換水量為1/3, 并定時喂食新鮮雜魚, 實驗全程于此公司實驗車間進行。

在室內水泥池暫養(yǎng)7 d后, 隨機選取9只暫養(yǎng)的健康三疣梭子蟹, 分別采集心臟、表皮、胃、腸、腦、肝胰腺、鰓、眼柄、血淋巴、肌肉共10個不同的組織, 置于液氮中保存, 用于合成RACE模板和的組織表達分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取、cDNA和RACE模板合成 取上述三疣梭子蟹10個不同的組織各50 mg, 按照TRIzol?Reagent (Roche公司)方法進行總RNA提取, 并利用紫外分光光度計(NanoDrop2000, Thermo)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的質量和濃度。

選取不同組織高質量的RNA, 使用HiScript II Q RT Super Mixfor qPCR (+gDNA wiper) kit (諾維贊, 南京)合成cDNA。將各組織中高質量的總RNA均勻混合, 使用SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa, 日本)合成3′和5′ RACE cDNA模板。

1.2.2 三疣梭子蟹的cDNA全長的克隆、序列及進化分析 根據從本實驗室構建的三疣梭子蟹基因組數據庫中篩選驗證得到的基因EST序列, 利用PrimerPremier5.0軟件設計的3′和5′ RACE特異性引物及通用引物并由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。使用TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity (HiFi)高保真聚合酶(全式金生物, 北京)參照說明書進行RACE 3′和5′末端巢式PCR擴增, 將PCR產物回收純化并進行連接轉化, 挑取單克隆, 經菌落PCR鑒定后篩選目的菌液送至上海生工生物工程有限公司進行測序, 參照宋柳等(2019)。

通過ContigExpress軟件將克隆序列與EST序列進行拼接、驗證, 得到基因的 cDNA全長, 分別采用NCBI-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)、ORFFinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)在線網站對序列進行比對分析及開放閱讀框(ORF)的預測。蛋白質功能結構域利用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)網站進行預測。利用DNAMAN軟件將與甲殼動物中的TLR基因進行蛋白質序列比對, 并通過MEGA軟件對進行構建系統(tǒng)進化樹分析。

1.2.3 三疣梭子蟹的組織表達分析 將不同個體相同組織的cDNA等濃度混合, 用于組織表達分析。根據已獲得的cDNA全長序列, 通過PrimerPremier5.0軟件設計實時熒光定量PCR特異性引物, 內參基因選用β-actin (表1), 具體PCR實驗體系及方法參考宋柳等(2019)。使用SPSS19.0軟件對實驗過程中產生的數據進行單因素方差分析, 借助OriginPro將統(tǒng)計結果整理形成圖表,0.05為顯著差異,0.01為極顯著性差異。

1.2.4 病原相關分子模式刺激 隨機選擇120只經過室內暫養(yǎng)后大小一致、健康有活力的三疣梭子蟹, 平均分成4組, 各組分別注射1×PBS緩沖液100 μL、1 mg/mL脂多糖100 μL、1 mg/mL肽聚糖100 μL以及1 mg/mL Poly IC 100 μL。在注射后0、12、24、48、72 h, 每組分別隨機選取3只三疣梭子蟹, 取肝胰腺組織置于液氮中保存, 用于RNA提取。

表1 實驗所用的引物序列

Tab.1 The sequence of primers used in the experiment

1.2.5 副溶血弧菌感染 隨機將60只室內暫養(yǎng)后大小一致、健康有活力的三疣梭子蟹, 平均分成2組(攻毒組和對照組)進行預實驗。對照組為注射無菌的海洋甲殼動物生理鹽水, 攻毒組為注射副溶血弧菌, 濃度依據張杰等(2017)報道注射副溶血弧菌的濃度(2.6×107CFU/mL)進行預實驗。劑量均為1 μL/g (體重)。在自然海水以及最適溫度下, 72 h半致死, 而對照組沒有死亡情況出現, 此劑量濃度作為正式實驗使用。

選取180只三疣梭子蟹進行正式實驗, 平均分為兩組即實驗組與對照組, 在梭子蟹游泳足的第一關節(jié)基部處進行注射(謝建軍等, 2011; Ren, 2017)。實驗組注射2.6×107CFU/mL的副溶血弧菌, 對照組注射海洋甲殼動物生理鹽水, 劑量均為1 μL/g。副溶血弧菌懸液參照竇全偉等(2018)的方法提取制備。分別在注射后0、12、24、48、72 h, 每組各隨機取3只三疣梭子蟹的肝胰腺組織于液氮中保存, 用于RNA提取。

1.2.6基因RNAi實驗 本實驗通過生工生物工程(上海)股份有限公司設計的干擾序列進行位點篩選, 最后確定具有干擾效果的一對序列由公司合成(表2)。

RNAi實驗共分為4組各60個個體: 實驗組(注射siRNA)、陰性對照組(注射NC siRNA)、空白對照組(注射生理鹽水)、陽性對照組(注射生理鹽水)。將siRNA濃度稀釋為1 μg/μL, 陰性對照組和實驗組根據三疣梭子蟹個體的體重進行注射(注射量為1 μg/g); 空白對照組和陽性對照組根據三疣梭子蟹個體的體重進行注射生理鹽水(注射量為1 μL/g)。在注射后0、24、48、72 h, 分別取空白對照組、陰性對照組和實驗組3只三疣梭子蟹的肝胰腺組織于液氮中保存, 用于干擾效率檢測。

在RNAi實驗24 h后, 4組各取30個個體進行攻毒實驗, 按體重注射(注射量為1 μL/g): 空白對照組注射1×PBS緩沖液; 其他3個組注射2.6×107CFU/mL副溶血弧菌。實驗每3 h統(tǒng)計一次死亡數。在0、12、24、48、72 h, 每組分別選取3只依然存活的三疣梭子蟹解剖取肝胰腺組織存于液氮中保存。

1.2.7 接頭分子的實時熒光定量分析 利用材料1.2.2方法, 得到了MyD88與TRIF的cDNA序列, 并設計了qRT-PCR引物, 所用引物如表3, 使用1.2.6中RNAi材料, 對其下游接頭分子進行實時熒光定量分析。

表2 本研究所用雙鏈RNA

Tab.2 The double-stranded RNA used in the experiment

表3 實驗所用的引物序列

Tab.3 The sequence of primers used in the experiment

2 結果與分析

2.1 PtToll6基因cDNA全長及序列結構特征

的cDNA全長為4 034 bp, 其中包括129 bp的5′ UTR, 2 934 bp的ORF區(qū)域, 和1 100 bp的3′ UTR, 預測分子量為109.078 kDa, 理論等電點為6.06, 共編碼977個氨基酸(圖1)。利用SMART在線預測分析網站以及DNAMAN軟件對進行蛋白結構、序列比對分析。結果顯示,具有Toll樣受體蛋白的重要結構域: LRR、TIR (圖2), 且與其他甲殼動物Toll具有高度同源的TIR保守區(qū), 而胞外的LRR較為復雜多樣(圖3)。三疣梭子蟹與其他Toll的序列同源性較低, 同源性為8.42%～17.92%, 其中同源性最高的是克氏原螯蝦(), 同源性為17.92%。利用MEGA 5.0軟件對基因進行系統(tǒng)進化分析, 圖4結果顯示,沒有與親緣關系近的甲殼動物聚在一起, 反而是與同屬節(jié)肢動物門的果蠅單獨聚為一支(以紅色圓點表示)。在已發(fā)表的三疣梭子蟹中, 有兩個分別與親緣關系較近的中華絨螯蟹()、擬穴青蟹()聚在一起, 而其他三疣梭子蟹Toll都是與果蠅Toll聚在一起(已發(fā)表的三疣梭子蟹Toll以紅色圓圈表示)。

圖1 PtToll6基因cDNA全長及氨基酸序列

2.2 PtToll6的組織表達分布

利用實時熒光定量PCR技術, 分析了在不同組織中的相對表達情況。如圖5所示,在心臟、表皮、胃、腸、腦、肝胰腺、鰓、眼柄、血淋巴、肌肉這10個組織中均有表達。其中,在肝胰腺中特異性地高表達, 其次在腸以及腦中的表達量相對較高, 在鰓組織中的表達量最低。

圖2 PtToll6基因編碼蛋白結構域位置

圖4 PtToll6的系統(tǒng)進化樹

注:以紅色圓點表示; 已發(fā)表的三疣梭子蟹Toll以紅色圓圈表示

圖5 PtToll6基因在不同組織中的表達分析

注: H: 心臟; Hp: 肝胰腺; E: 眼柄; M: 肌肉; B: 血細胞; G: 鰓; S: 胃; C: 表皮; I: 腸; Br: 腦

2.3 病原相關分子刺激后PtToll6的表達規(guī)律

利用熒光實時定量PCR對PAMPs刺激的3個實驗組和對照組進行分析。從圖6中可以發(fā)現, 在肝胰腺組織中, 脂多糖以及 Poly IC 的刺激均使基因的表達顯著上調(<0.05), 且都在48 h達到峰值, 72 h開始回落, 但對脂多糖的響應更加強烈(對照組的上千倍)。在肽聚糖的刺激下,基因在12 h、24 h下調, 但在48 h出現上調現象(<0.05)。

圖6 不同PAMPs刺激下PtToll6基因的表達分析

注: *表示差異顯著(<0.05), **表示差異極顯著(<0.01)。下同

2.4 副溶血弧菌感染后PtToll6及其接頭分子的表達特征

在副溶血弧菌的感染下,在三疣梭子蟹的肝胰腺中呈顯著上調表達(<0.05), 12 h顯著上調至0 h的2.74倍, 于24 h上調至9.02倍達到峰值, 后有回落又小幅上調(圖7)。 MyD88也在感染下呈上調表達(<0.05), 在72 h達到峰值為0 h的11.4倍。而TRIF在感染后則是下調趨勢(圖8)。

圖7 副溶血弧菌刺激后PtToll6基因的表達變化情況

圖8 副溶血弧菌刺激后PtToll6接頭分子的表達變化情況

2.5 功能驗證

RNAi實驗結果顯示, 注射雙鏈RNA后, 三疣梭子蟹基因在24 h、48 h都呈現下調表達, 差異顯著(<0.05), 產生敲降效果, 24 h的干擾效率大于99% (圖9)。RNAi試驗后死亡率統(tǒng)計實驗結果顯示(圖10), 陽性對照組的死亡率為50%, NC陰性對照組的死亡率為53.34%, 而實驗組的死亡率為93.34%, 結果表明實驗組死亡率顯著升高, 為陰性對照組的1.8倍(<0.05)。

2.6 PtToll6的下游接頭分子驗證

在敲降后, MyD88的表達也受到了抑制, 24 h至72 h之間幾乎不表達, 具有明顯的干擾效果, 而TRIF在24 h與72 h都呈上調趨勢(圖11)。

圖9 PtToll6基因干擾后的表達分析

注: 對照組為注射的序列打亂的雙鏈RNA, 實驗組為注射的干擾序列。下同

圖10 干擾后三疣梭子蟹在感染下的死亡率

圖11 接頭分子干擾后的相對表達量

3 討論

先天免疫是三疣梭子蟹等無脊椎動物抵抗外界病原入侵的重要防御機制, 主要由胚系基因所編碼的PRR所介導, 其中TLR是一種在病原入侵后發(fā)揮識別和清除功能的重要 PRR (Carty, 2010)。本實驗克隆了三疣梭子蟹基因的cDNA全長序列, 并預測了其編碼蛋白結構域。與已發(fā)表的5個三疣梭子蟹TLR基因相比,沒有LRR-CT (C端-LRR), LRR僅有8個, 是該物種中已知LRR數量最少的TLR基因(Zhou, 2015; 張杰, 2017)。LRR結構域發(fā)揮著TLR基因識別PAMPs的功能, 不同的LRR結構域賦予了TLR基因能特異性識別病原相關分子模式的能力(Johnson, 2003)。具有較少的LRR的特征可能與其識別特定的PAMPs相關。

三疣梭子蟹在肝胰腺中特異性地高表達, 這與已發(fā)表的其他三疣梭子蟹 TLR 基因主要在血淋巴、鰓組織等組織高表達不同(Zhou, 2015; 張杰, 2017)。肝胰腺是甲殼動物解毒代謝和免疫調節(jié)的主要組織(R?szer, 2014; Xu, 2020), 推測可能在該組織中發(fā)揮重要的免疫功能。為了明確所識別的PAMPs, 我們采用脂多糖、肽聚糖、Poly IC進行注射刺激, 發(fā)現3種PAMPs均能誘導顯著上調表達。值得注意的是對脂多糖的響應最為強烈, 在感染48 h后肝胰腺中的表達量上調上千倍, 表明脂多糖是主要識別的PAMPs。

副溶血弧菌屬于典型的革蘭氏陰性菌, 而脂多糖(又稱內毒素)是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜中的主要成分(于耕紅等, 2011; 霍詩天等, 2022)。為了探究TLR 6是否能夠識別含有脂多糖的副溶血弧菌, 本研究進行了梭子蟹人工感染副溶血弧菌的實驗。qPCR結果顯示在副溶血弧菌感染12 h后開始上調表達, 至24 h達到峰值, 表明其可以識別并響應該病原的入侵。為了進一步驗證其在抗副溶血弧菌中的功能, 我們采用RNAi技術成功敲降了的表達。對比不同組別人工感染副溶血弧菌的死亡率, 發(fā)現實驗組的死亡率顯著高于陰性對照組(1.8倍), 表明基因的確在抗副溶血弧菌中發(fā)揮了重要的免疫作用。

我們分析了敲降后下游兩種接頭分子的表達情況, 實驗發(fā)現MyD88與趨勢相同, 在24 h、48 h被抑制表達, 而TRIF的表達沒有被抑制。在副溶血弧菌感染實驗中, MyD88也與趨勢相同, 呈上調表達, 而TRIF則是下調趨勢。實驗結果說明,主要依賴MyD88途徑, MyD88是其下游通路的接頭分子。有研究表明, MyD88在副溶血弧菌感染中發(fā)揮了重要免疫功能, 如南美白對蝦()在用脂多糖、金黃色葡萄菌和WSSV等刺激后, LvMyD88上調表達, 在天然免疫中可能發(fā)揮了作用(Zhang, 2012)。在櫛孔扇貝(), 經過脂多糖、肽聚糖處理后, MyD88在原代培養(yǎng)的血細胞中也上調表達(Qiu, 2007)。本實驗中, MyD88同樣在副溶血弧菌感染下呈上調表達, 一定程度地參與了天然免疫進程。

4 結論

本實驗成功克隆了三疣梭子蟹基因cDNA全長序列并分析了該基因的功能結構域和物種進化關系。通過分析基因的組織表達、不同PAMPs刺激后的表達、病原感染下的表達特征以及RNAi后的死亡率, 探究了該基因在三疣梭子蟹天然免疫中的功能以及初步明確了其下游接頭分子。研究結果有助于全面解析三疣梭子蟹中TLR家族的免疫機制。

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Cloning ofgene inand its function in immunity

ZHANG Wei-Wei1, 2, LYU Jian-Jian2, LI Yu-Kun1, 2, CHU Fan-Zhi1, 2, GAO Bao-Quan2, LIU Ping2

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. National Key Laboratory of Marine Breeding and Sustainable Production, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

we cloned a new gene from theTLRs family and named it. The gene is 4 034 bp in length and encodes 977 amino acids.has a typical domain of Toll-like receptor, including LRR, transmembrane region, and intracellular TIR region. Phylogenetic tree analysis showed thatis clustered withof the same phylum Arthropoda. The tissue expression distribution show thatwas specifically over-expressed in hepatopancreas, followed by the intestinal tract, and then the heart. Using three types of PAMPs for injection stimulation, it was found thathad the strongest response to lipopolysaccharides, and the expression amount after 48 h of infection was thousands of times that of the control group, and it was speculated that it may be the pathogen-related molecular pattern mainly recognized bygene. The expression ofwas up-regulated at 12 h afterinfection and peaked at 24 h (up-regulated 9.02-fold). After RNAi knocked down, the expression of MyD88 was lowered, and the mortality rate ofwas significantly increased by 1.8 times that of negative control. This study showed thatgene could play an important role in resisting, and provided an important reference for the understanding the molecular mechanism of.

; toll-like receptors (TLRs); pattern recognition receptors (PRR); pathogen associated molecular patterns (PAMPs)

* 國家蝦蟹產業(yè)技術體系, CARS-48號; 國家自然科學基金項目, 42076116號; 中國水產科學研究院基本科研業(yè)務費, 2020TD46號。張偉偉, 碩士研究生, E-mail: 1362326629@qq.com

劉 萍, 研究員, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

2022-11-01,

2023-01-14

S917

10.11693/hyhz20221100285