球磨改性的氟化石墨烯/玻璃離子水門汀的力學(xué)性能、抗菌效果和生物相容性研究

孫莉 趙忠芳 司慶宗

1972 年,Wilson等[1]將玻璃離子水門汀(GICs)引入牙科行業(yè),因?yàn)樗芘c牙體組織形成化學(xué)性粘結(jié),具有釋氟性及好的生物相容性[2],而得到廣泛應(yīng)用。然而,GICs在力學(xué)性能方面的局限性也限制的其應(yīng)用,尤其在一些受力區(qū)域[3]。為了克服 GICs的缺點(diǎn),學(xué)者們研究出強(qiáng)度高于GICs的樹脂改性GICs[4]。此外,不同的填料,如金屬[5]和生物活性玻璃[6],也被添加至GICs中改善其力學(xué)性能。

近年來(lái),納米技術(shù)帶動(dòng)了技術(shù)革命。Moshaverini等[7]研究發(fā)現(xiàn),納米粒子占據(jù)了GICs顆粒之間的空隙,充當(dāng)增強(qiáng)材料提高材料的力學(xué)性能。Dowling等[8]和Chalissery等[9]分別將納米二氧化鈦和納米氧化鋯添加至GICs中,發(fā)現(xiàn)其力學(xué)性能和抗菌效果增強(qiáng)。

石墨烯及其衍生物具有優(yōu)異的力學(xué)性能,生物相容性和良好的抗菌性能[10]等,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極好的應(yīng)用前景。Dubey等[11]研究發(fā)現(xiàn),石墨烯加入生物活性硅酸鈣水門汀中可以提高材料的硬度。Sun等[12]將1 mg/mL的氧化石墨烯(graphene oxide,GO)與鈦結(jié)合,顯示出優(yōu)異的細(xì)胞粘附和抗菌特性。作為石墨烯的一種新型的衍生物,氟化石墨烯(FG)具有類似石墨烯的機(jī)械強(qiáng)度[13],還具有氟基材料的特性。C-F鍵的強(qiáng)極性被認(rèn)為可以誘導(dǎo)生物反應(yīng)[14]。界面作用力和氟的共同作用使FG表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌良好的抗菌性能[15]。FG的C-F鍵通過(guò)與界面基體的共價(jià)和非共價(jià)相互作用,有效地克服了石墨烯在復(fù)合材料中的團(tuán)聚效應(yīng)[16]。基于這些研究,可以合理地假設(shè),在不影響生物相容性的前提下,FG可能有助于增強(qiáng)GICs的機(jī)械和抗菌性能。

本研究擬用FG增強(qiáng)傳統(tǒng)型的GICs,評(píng)估復(fù)合材料的力學(xué)性能、抗菌性和細(xì)胞毒性,為提高GICs的力學(xué)性能和抗菌作用的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料 氧化石墨烯(GO,南京新豐),Fuji II GICs(而至,日本),金黃色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 25923)和大腸桿菌(E.coli,ATCC 25922)、L929細(xì)胞(武漢Procell);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,美國(guó));CCK-8試劑盒(日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所,日本)。

1.1.2 主要儀器 電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(INSTRON,美國(guó)),掃描電鏡(JEOL,日本),維氏硬度計(jì)(Matsuzawa,日本),酶標(biāo)儀(Bio-tek,美國(guó))。

1.2 FG的制備

水熱法制備FG[17]。已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)中已制得FG[18]。

1.3 GICs/FG復(fù)合材料試件制備

在GICs粉中按質(zhì)量比分別加入不同質(zhì)量的FG(FG質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、1%、2%和4%)球磨法混勻。將此混合物按照廠家說(shuō)明書的要求粉液質(zhì)量比為2∶1與GICs液體混合、調(diào)拌。按照實(shí)驗(yàn)要求制作不同尺寸的試樣。測(cè)試前,試樣依次用400、800目、1200目砂紙打磨、拋光。

基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)情況確定了GICs中加入FG的質(zhì)量分?jǐn)?shù),實(shí)驗(yàn)共計(jì)分4 組:對(duì)照組GICs(不含F(xiàn)G),實(shí)驗(yàn)組分別含1%、2%和4%FG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的FG。為了便于實(shí)驗(yàn)組描述,分別于GICs、1%FG/GICs、2%FG/GICs、4%FG/GICs表示。

1.4 表征

1.4.1 FG和FG/GICs復(fù)合材料的表征 前研究中已對(duì)FG進(jìn)行TEM形貌分析、Raman圖譜分析和XPS成分分析[18,24]。SEM觀察FG/GICs復(fù)合材料的形貌。將對(duì)GICs/FG復(fù)合材料試件固定于細(xì)銅片后真空鍍膜,電鏡下觀察GICs/FG復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4.2 FG/GICs復(fù)合材料的力學(xué)性能測(cè)試 力學(xué)性能測(cè)試按照表1所示的方法和要求。

表1 力學(xué)性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)參數(shù) (n=10)

1.4.3 抗菌性測(cè)試 選用薄膜密貼法,S.aureus和E.coli作為測(cè)試菌株。每組6 個(gè)試樣,尺寸為10 mm×10 mm×2 mm。試樣表面滅菌后滴加50 μL測(cè)試菌液(106CFU/mL),貼覆PE膜。置于相對(duì)濕度大于90%、37 ℃培養(yǎng)24 h。用20 mL PBS反復(fù)沖洗試樣表面和PE膜?；旌暇鶆?倍比稀釋。取100 μL接種于培養(yǎng)基,空白對(duì)照組中為100 μL原始菌液,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次求平均值。抑菌率R的計(jì)算公式:R=(N0-Nx)/N0×100%。N0表示空白對(duì)照組的菌落數(shù)量,Nx表示各組的菌落數(shù)量,抗菌實(shí)驗(yàn)方法見圖1。

圖1 抗菌實(shí)驗(yàn)方法示意圖

1.4.4 細(xì)胞毒性測(cè)定(CCK-8) 將制備好的4組FG/GICs試樣制成片狀滅菌后置于96 孔板中。L929細(xì)胞在含10%的胎牛血清的DMEM中復(fù)蘇,3 次傳代后,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化,制成2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。每孔100 μL接種于放置各組試樣的96 孔板中培養(yǎng)?？瞻捉M加入細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL,37 ℃培養(yǎng)。1、3和5 d后移除試樣和培養(yǎng)液,加入新鮮培養(yǎng)液,用CCK-8試劑盒按說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量吸光度(A)。

細(xì)胞相對(duì)增殖率(%)為=[(A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組)/A陰性對(duì)照組]× 100%。

根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增值率判斷試樣細(xì)胞毒性,見表2。

表2 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)分級(jí)

1.5 結(jié)果評(píng)價(jià)

采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey HSD來(lái)確定各組材料之間測(cè)試性能的顯著差異。顯著性水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)FG/GICs復(fù)合材料的表征

電鏡下可見FG在GICs中分散均勻,未見明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。所有試樣的斷口表面均有裂紋和氣孔,但實(shí)驗(yàn)組的比對(duì)照組中孔隙少(圖2)。

圖2 復(fù)合材料斷面的SEM圖像

2.2 FG/GICs復(fù)合材料的力學(xué)性能

FG的加入使FG/GICs的Hv,CS和DTS增加。實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組(P<0.05)(除1%FG/GICs組的CS外)。組間比較,1%FG/GICs,2%FG/GICs組的Hv,2%FG/GICs(c),4%FG/GICs組的DTS無(wú)明顯差異(P>0.05)。其中,2%FG/GICs表現(xiàn)出最佳的性能(圖3)。

圖3 4 組復(fù)合材料的維氏顯微硬度、壓縮強(qiáng)度和徑向拉伸強(qiáng)度比較(不同標(biāo)注表示兩組之間的差異,P<0.05)

GICs對(duì)S.aureus和E.coli能發(fā)揮一定的抗菌作用,而實(shí)驗(yàn)組的抗菌效果更強(qiáng)(P<0.05)。隨著FG的添加量的增加,復(fù)合材料對(duì)S.aureus和E.coli抗菌效果增強(qiáng)(圖4～5)。

圖4 4 組復(fù)合材料抗菌性能測(cè)定的S.aureus和 E. coli菌落生長(zhǎng)情況

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:培養(yǎng)1 d時(shí),各組細(xì)胞相對(duì)增值率相比差異無(wú)顯著性意義(P>0.05);培養(yǎng)3、5 d時(shí),4%FG/GICs組細(xì)胞相對(duì)增值率低于其他組(P<0.05)(圖5)。根據(jù)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)分級(jí),不同組試樣與L929細(xì)胞培養(yǎng)1、3和5 d天均無(wú)細(xì)胞毒性(圖5)見。因此認(rèn)為FG/GICs對(duì)細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性,具有良好的生物相容性。

圖5 各組復(fù)合材料的菌落計(jì)數(shù)、抗菌率、細(xì)胞毒性(不同標(biāo)注表示兩組之間的差異,P<0.05)

3 討 論

本研究利用GO水熱反應(yīng)制備了FG[18],用球磨法制備了FG/GICs復(fù)合材料。在掃描電鏡下可以看到FG均勻分散在GICs中,未見FG團(tuán)聚。因?yàn)镕G中C-F鍵的存在,通過(guò)與界面基體的共價(jià)和非共價(jià)相互作用,有效地克服了石墨烯的團(tuán)聚效應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)中掃描電鏡顯示所有的樣品中都有小氣孔,實(shí)驗(yàn)組氣孔更少。隨著FG含量增高,形成更加均勻的斷面。FG占據(jù)GICs顆粒之間的空隙,當(dāng)裂紋形成時(shí),它可以吸收斷裂能量從而阻止裂紋的傳播[18]。

GICs是一種脆性材料,易因?yàn)椴牧现械臍饪缀土鸭y而失效。Nomoto等[19]認(rèn)為,GICs基質(zhì)中的孔隙率可能是影響材料力學(xué)性能的重要因素之一。有研究發(fā)現(xiàn),1%的石墨烯的加入使羥基磷灰石的顯微硬度提高了30%[20],在硅酸鹽水門汀中添加GO可使其力學(xué)性能大大提高[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與GICs相比,實(shí)驗(yàn)組的的顯微硬度、壓縮強(qiáng)度和徑向拉伸強(qiáng)度均有明顯提高。原因是:一方面,FG具有較高力學(xué)性能[17];另一方面,石墨烯材料的小尺寸效應(yīng)[22]使之填充于GICs大分子之間的間隙,FG的二維結(jié)構(gòu)和高比表面積使其與基體發(fā)生機(jī)械鎖結(jié),由于彈性模量的差異,當(dāng)斷裂發(fā)生時(shí),載荷從基體轉(zhuǎn)移到FG上[20]。這種現(xiàn)象可以用裂紋分解機(jī)制[23]解釋。該機(jī)理包括裂紋橋接、裂紋拔出、裂紋偏轉(zhuǎn)和裂紋尖端屏蔽四個(gè)方面[23]。此外,FG為GICs粉液結(jié)合提供更多結(jié)合位點(diǎn),使反應(yīng)更充分。但是FG的添加量必須限定在一定的范圍內(nèi),否則會(huì)影響GICs的聚合。

繼發(fā)齲是導(dǎo)致修復(fù)材料壽命有限的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn),GICs的抗菌作用來(lái)源于其釋放氟離子擾亂細(xì)菌的定植和生物膜的形成,抑制糖酵解從而影響細(xì)菌的代謝,以及固化時(shí)的酸性環(huán)境[24]。本研究中,抗菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GICs自身對(duì)于S.aureus和E.coli具有一定的抗菌作用。石墨烯材料的抗菌機(jī)制來(lái)源于以下幾個(gè)方面:首先,石墨烯材料鋒利的邊緣破壞細(xì)菌胞膜,內(nèi)容物外露,導(dǎo)致細(xì)菌死亡。第二,石墨烯覆蓋于細(xì)菌的表面,將其與外界隔離,細(xì)菌缺乏營(yíng)養(yǎng)和呼吸活動(dòng)而喪失活力[25]。再之,石墨烯產(chǎn)生活性氧引起細(xì)菌的氧化應(yīng)激,造成損傷甚至死亡[26]。Zhao等[27]研究發(fā)現(xiàn)GO 以濃度依賴性方式對(duì)浮游和生物膜形式的變形鏈球菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌作用。本研究將實(shí)驗(yàn)菌液與不同組FG/GICs接觸培養(yǎng),抗菌測(cè)試結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組對(duì)S.aureus和E.coli均有更強(qiáng)的抑制作用。而且,FG/GICs復(fù)合材料對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus的抗菌效果更強(qiáng),這很大程度上受細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響[28]。作為石墨烯的衍生物之一,FG具有類似GO的抗菌作用。另一方面,石墨烯類材料能與聚合物基質(zhì)結(jié)合,在復(fù)合材料上形成親水表面,該表面吸引水分子形成水合層[29]。此水合層將會(huì)對(duì)微生物在材料表面的粘附和定植造成抑制[30]。

醫(yī)用材料應(yīng)用于臨床必須具有良好的生物相容性。研究發(fā)現(xiàn),石墨烯材料通過(guò)不同的暴露途徑在許多組織和器官中積累,并進(jìn)一步引起毒性,表現(xiàn)為損傷或功能障礙[31]。也有學(xué)者[32]研究發(fā)現(xiàn)氟化石墨烯對(duì)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出良好的黏附作用。本研究中,在共培養(yǎng)的第5天,相比于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞相對(duì)增值率較低;在第3和第5 天,4% FG/GICs組的細(xì)胞相對(duì)增值率下降較多。但不同組試樣與L929細(xì)胞培養(yǎng)1、3和5 d的細(xì)胞相對(duì)增值率均在80%以上。因此,一定劑量的FG添加至GICs中不會(huì)影響其生物相容性。

綜上,在不影響生物相容性的前提下,在傳統(tǒng)型GICs中加入一定量的FG,可以提高其硬度,壓縮強(qiáng)度,拉伸強(qiáng)度,表現(xiàn)出對(duì)S.aureus和E.coli更強(qiáng)的抗菌效果,為拓寬GICs的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。