長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5在糖尿病腎病進(jìn)展中作用機(jī)制研究

李 楊, 徐 曼, 潘妙霞, 陳劍妹, 王玉川, 蔡興莉

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 腎病風(fēng)濕科,海南 海口 570208

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)為糖尿病的并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1]。DN病理改變的重要特征為系膜細(xì)胞增殖,腎小球系膜的細(xì)胞外基質(zhì)堆積、基底膜增厚、系膜區(qū)擴(kuò)張,從而發(fā)展為腎小球硬化[2-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)為長(zhǎng)度>200 bp的轉(zhuǎn)錄本,且不具有任何明顯的蛋白質(zhì)編碼能力[5]。LncRNAs可以影響不同的細(xì)胞功能,參與多種生理和病理過程[6-11]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(long non-coding RNAs growth arrest-specific transcript 5,LncRNA GAS5)可通過與Yes關(guān)聯(lián)蛋白結(jié)合,促進(jìn)其磷酸化和降解,從而抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展[12]。LncRNA GAS5在DN患者的血清中表達(dá)下調(diào),并參與DN進(jìn)展[13]。本研究旨在探討LncRNA GAS5在DN進(jìn)展中的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組 5周齡大鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;人腎小球系膜細(xì)胞(human mesangial cell,HMC)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;TRIzol RNA試劑購(gòu)自Invitrogen公司;SYBR Premix Ex Taq GC試劑盒購(gòu)自TAKARA公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司;雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司;沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1)、GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(cell counting kit-8,CCK-8)試劑購(gòu)自TargetMol公司。

1.2 研究方法

1.2.1 體外DN模型構(gòu)建 腎小球系膜細(xì)胞于高糖(25 mmol/L)Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)中培養(yǎng),模擬建立DN細(xì)胞模型,分為L(zhǎng)ncRNA GAS5干擾組、LncRNA GAS5過表達(dá)組與陰性對(duì)照組。

1.2.2 外泌體的分離鑒定、攝取實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞上層清液,去除雜質(zhì)與細(xì)胞碎片后于濾器中(0.22 μmol/L)過濾,在電鏡銅網(wǎng)上涂20 μl外泌體懸液,于室溫條件下放置10 min,采用30 μl磷鎢酸(20 mg/ml)復(fù)染1 min,于透射電鏡下觀察、拍照記錄。

1.2.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè) 利用TRIzol提取總RNA,采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR Premix Ex Taq GC試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)。基因的Ct值通過FAST7500系統(tǒng)檢測(cè),標(biāo)準(zhǔn)化后,計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 通過裂解液充分裂解細(xì)胞,所得樣品于4℃條件下離心15 min并收集上層清液。加入上樣緩沖液后,將蛋白樣品放置于100℃蜂窩爐中進(jìn)行變性。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜,采用5%脫脂奶粉封閉,并于4℃條件下孵育一抗過夜。采用Tris緩沖液-聚山梨醇酯20(tris buffered saline with tween 20,TBST)洗滌聚偏二氟乙烯膜后,加入相應(yīng)種屬二抗,于室溫下孵育2 h,在凝膠成像儀中檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)LncRNA GAS5、miRNA以及靶基因mRNA結(jié)合位點(diǎn),利用軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,構(gòu)建LncRNA GAS5野生型和突變型雙熒光素酶載體。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h,參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作說明檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.6 DN模型 選取10只健康的5周齡大鼠為研究對(duì)象。將大鼠分為模型組與對(duì)照組,每組各5只。模型組采用高脂高糖喂養(yǎng)1個(gè)月,一次性腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素,72 h后檢測(cè)血糖>16.7 mmol/L為模型誘導(dǎo)成功。對(duì)照組飲食正常,腹腔注射同等劑量的生理鹽水。獲取模型組與對(duì)照組大鼠腎組織,檢測(cè)LncRNA GAS5的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 DN中LncRNA GAS5表達(dá)情況 模型組腎組織樣本LncRNA GAS5表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1a)。模型組血清外泌體中LncRNA GAS5表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1b)。模型組HMC細(xì)胞中LncRNA GAS5表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1c)。模型組HMC細(xì)胞上清外泌體中LncRNA GAS5表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1d)。

圖1 DN中LncRNA GAS5表達(dá)情況(a.腎組織樣本;b.血清外泌體樣本;c.HMC細(xì)胞樣本;d.HMC細(xì)胞上清外泌體樣本)

2.2 LncRNA GAS5過表達(dá)抑制DN纖維化進(jìn)程 LncRNA GAS5過表達(dá)組HMC細(xì)胞增殖水平低于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2a～c)。LncRNA GAS5過表達(dá)組HMC細(xì)胞遷移能力低于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2d)。LncRNA GAS5過表達(dá)組HMC細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白、α(I)膠原表達(dá)均低于陰性對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2e)。

圖2 LncRNA GAS5過表達(dá)抑制DN纖維化進(jìn)程[a.在HMC細(xì)胞中過表達(dá)LncRNA GAS5;b.CCK-8檢測(cè)HMC細(xì)胞增殖情況;c.平板克隆檢測(cè)HMC細(xì)胞生長(zhǎng)情況;d.Transwell檢測(cè)HMC細(xì)胞遷移情況;e.qRT-PCR檢測(cè)HMC細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白、α(I)膠原表達(dá)情況]

2.3 LncRNA GAS5負(fù)向調(diào)控miR-135a-5p表達(dá) StartBase v2.0預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-135a-5p與LncRNA GAS5具有靶向關(guān)系(圖3a)。在HMC細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染GAS5-WT、miR-135a-5p后,LncRNA GAS5過表達(dá)組熒光素酶活性低于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),共轉(zhuǎn)染GAS5-MUT和miR-135a-5p后,熒光素酶活性無明顯改變(圖3b)。與Ago2抗體結(jié)合后,LncRNA GAS5過表達(dá)組富集水平高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3c)。LncRNA GAS5過表達(dá)組生物素化的miR-135a-5p吸附物中LncRNA GAS5富集水平高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3d)。敲減或過表達(dá)LncRNA GAS5后,LncRNA GAS5過表達(dá)組HMC細(xì)胞中miR-135a-5p表達(dá)水平相應(yīng)高于或低于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3e、f)。

圖3 LncRNA GAS5負(fù)向調(diào)控miR-135a-5p表達(dá)(a.StartBase v2.0預(yù)測(cè)miR-135a-5p與LncRNA GAS5結(jié)合;b.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-135a-5p與LncRNA GAS5結(jié)合;c.Ago2抗體檢測(cè)LncRNA GAS5富集情況;d.生物素檢測(cè)LncRNA GAS5富集情況;e.LncRNA GAS5敲低HMC細(xì)胞中miR-135a-5p表達(dá);f.LncRNA GAS5過表達(dá)組HMC細(xì)胞中miR-135a-5p表達(dá))

2.4 MiR-135a-5p負(fù)向調(diào)控SIRT1表達(dá) 經(jīng)TargetScanHuman 8.0預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),SIRT1為miR-135a-5p的靶點(diǎn)之一(圖4a)。在HMC細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染SIRT1-WT、miR-135a-5p后,LncRNA GAS5過表達(dá)組熒光素酶活性低于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而共轉(zhuǎn)染SIRT1-MUT、miR-135a-5p后,熒光素酶活性無明顯改變(圖4b)。過表達(dá)或敲減miR-135a-5p后,SIRT1的mRNA、蛋白表達(dá)水平均相應(yīng)低于或高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4c～4d)。敲減或過表達(dá)LncRNA GAS5后,LncRNA GAS5過表達(dá)組HMC細(xì)胞中SIRT1表達(dá)水平相應(yīng)低于或高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4e、f)。

圖4 MiR-135a-5p負(fù)向調(diào)控SIRT1表達(dá)(a.TargetScanHuman 8.0預(yù)測(cè)miR-135a-5p與SIRT1潛在結(jié)合位點(diǎn);b.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-135a-5p與SIRT1結(jié)合;c.過表達(dá)/敲減miR-135a-5p的 HMC細(xì)胞中SIRT1的mRNA表達(dá)水平;d.過表達(dá)/敲減miR-135a-5p的 HMC細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)水平;e.敲減 /過表達(dá)LncRNA GAS5的 HMC細(xì)胞中SIRT1的mRNA表達(dá)水平;f.敲減/過表達(dá)LncRNA GAS5的 HMC細(xì)胞中SIRT1的蛋白表達(dá)水平)

2.5 LncRNA GAS5通過miR-135a-5p/SIRT1調(diào)控DN纖維化進(jìn)程 感染miR-135a-5p或轉(zhuǎn)染siSIRT1后,LncRNA GAS5過表達(dá)組對(duì)HMC細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白、α(I)膠原表達(dá)抑制作用均弱于陰性對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

3 討論

DN的重要病理特征之一為系膜細(xì)胞異常增殖,其過程復(fù)雜,具體機(jī)制尚不清楚[14]。外泌體是由細(xì)胞分泌的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡,廣泛分布于體液中,其可參與細(xì)胞周期、血管生成以及組蛋白修飾等過程,且可用于多種疾病的診斷[15-16]。LncRNA通過調(diào)控下游miRNA參與包括DN在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展,且可作為DN潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[17-18]。有研究報(bào)道,miR-135a可通過調(diào)節(jié)人轉(zhuǎn)化受體電位陽離子通道亞家族C成員1促進(jìn)DN患者的腎纖維化過程[19]。此外,在大鼠DN模型中,抑制miR-135a也可減小腎的纖維化程度[20]。

本研究結(jié)果顯示,模型組腎組織與血清外泌體中LncRNA GAS5表達(dá)水平低于對(duì)照組,且HMC細(xì)胞內(nèi)及上清外泌體中LncRNA GAS5表達(dá)水平同樣低于對(duì)照組。這提示,外泌體LncRNA GAS5具有作為DN檢測(cè)標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),LncRNA GAS5過表達(dá)組HMC細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白、α(I)膠原表達(dá)均低于陰性對(duì)照組。這提示,過表達(dá)LncRNA GAS5可以抑制高糖條件下HMC細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和纖維化,LncRNA GAS5可作為DN的潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),敲減或過表達(dá)LncRNA GAS5后,HMC細(xì)胞中miR-135a-5p表達(dá)水平相應(yīng)高于或低于陰性對(duì)照組,而SIRT1表達(dá)水平低于或高于陰性對(duì)照組。這表明,LncRNA GAS5通過靶向miR-135a-5p可以促進(jìn)DN發(fā)病過程中的HMC增殖、遷移和纖維化因子的分泌,而特異性抑制該信號(hào)通路或可達(dá)到治療DN的目的。

綜上所述,LncRNA GAS5可通過miR-135a-5p/SIRT1軸調(diào)控DN的進(jìn)展,為闡明DN進(jìn)展的分子機(jī)制提供重要線索。