長(zhǎng)非編碼RNA HOXD-As2通路抑制直腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究

葉鵬程, 楊鈞淞, 唐 錦, 譚 淼, 吳東津, 魏壽江

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胃腸外一科,四川 南充 637000

在世界癌癥發(fā)病率與病死率排名中,直腸癌分別位于第3位與第4位[1]。每年有超過(guò)100萬(wàn)的直腸癌新病例,約70萬(wàn)患者死于直腸癌[2]。直腸癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種因素,包括癌基因的激活與抑癌基因的失活[3]。腫瘤抑制基因的突變對(duì)于非侵襲性疾病向侵襲性疾病的轉(zhuǎn)變至關(guān)重要。侵襲性直腸癌中的突變頻率與惡性腫瘤程度相關(guān)[4-5]。長(zhǎng)非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度>200 bp的RNA,沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)的能力[6]。與microRNA及其他小的非編碼RNA不同,LncRNA可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)調(diào)控下游的目標(biāo)基因[7]。LncRNA HOXD-As2位于2號(hào)染色體上,為homeobox D基因的反義鏈[8]。本研究旨在探討LncRNA HOXD-As2通路抑制直腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 直腸癌細(xì)胞HCT116購(gòu)自廣州群賢科技有限公司(貨號(hào):CH1101)。HT29細(xì)胞購(gòu)自廣州悅行生物科技有限公司(貨號(hào):T1028)。Trizol試劑購(gòu)自上海玻爾化學(xué)試劑有限公司(貨號(hào):B645504)。HOXD8抗體購(gòu)自廣州市魯誠(chéng)生物科技有限公司。上皮性鈣粘蛋白(E-Cadherin)抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司(貨號(hào):WLH4321)。神經(jīng)性鈣粘蛋白(N-Cadherin)抗體購(gòu)自廣州碩恒生物科技有限公司(貨號(hào):sc-59987)。基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9,MMP-9)抗體購(gòu)自廣州文奇生物科技有限公司(貨號(hào):ab38898)。蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)抗體購(gòu)自昆明皇寶商貿(mào)有限公司(貨號(hào):AA326)。雷帕霉素機(jī)械靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)抗體購(gòu)自北京依珊匯通科技有限公司(貨號(hào):mTOR001)。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)抗體購(gòu)自北京沃格東方科技有限公司(貨號(hào):PI3K001)。磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)抗體購(gòu)自廣州永諾生物科技有限公司(貨號(hào):YNKT099)。磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)抗體購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司(貨號(hào):05-1003)。磷酸化雷帕霉素機(jī)械靶蛋白(phosphorylated mechanistic target of rapamycin,p-mTOR)抗體購(gòu)自廣州沃亙生物科技有限公司(貨號(hào):OGCP-04-54)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 直腸癌細(xì)胞HCT116或HT29在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),加入10%胎牛血清,37℃培養(yǎng)箱。檢測(cè)前2 d,將HOXD8與LncRNA HOXD-As2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至HCT116或HT29細(xì)胞中。其中,轉(zhuǎn)染陰性設(shè)為對(duì)照組,轉(zhuǎn)染LncRNA HOXD-As2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒設(shè)為HOXD-As2組;轉(zhuǎn)染空載體Vector設(shè)為Vector組,轉(zhuǎn)染HOXD8過(guò)表達(dá)質(zhì)粒設(shè)為HOXD8組。

1.2.2 RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 采用Trizol試劑從直腸癌細(xì)胞HCT116或HT29中分離RNA,用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成cDNA。采用Power SYBR Green PCR Master Mix檢測(cè)HOXD8的mRNA表達(dá),以GAPDH作為內(nèi)源對(duì)照。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 含有HOXA-AS2推定靶點(diǎn)的HOXD8野生體(HOXD8-WT)序列片段被合成并插入pmirGLO載體中。使用QuikChange Ⅱ位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖挟a(chǎn)生HOXD8突變體(HOXD8-MT),突變位點(diǎn)為HOXA-AS2的結(jié)合位點(diǎn)。將含有HOXD8-WT的載體、HOXD8-MT的載體、HOXA-AS2過(guò)表達(dá)載體以及對(duì)照載體轉(zhuǎn)染至直腸癌細(xì)胞HCT116或HT29。轉(zhuǎn)染后48 h,使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)Renilla熒光素酶和螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性。相對(duì)熒光素酶的活性被標(biāo)準(zhǔn)化為Renilla熒光素酶的活性。

1.2.4 細(xì)胞活力與細(xì)胞增殖水平檢測(cè) 處理過(guò)的直腸癌細(xì)胞HCT116或HT29置于96孔板中24、48、72或96 h,采用0.5 mg/ml四氮唑鹽溶液培養(yǎng)3 h,然后用0.01 mmol/L氯化氫緩沖液后用細(xì)胞組織快速裂解液裂解細(xì)胞,用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處吸光度。將有指定轉(zhuǎn)染的直腸癌細(xì)胞HCT116或HT29置于6孔板中,每3 d更換1次培養(yǎng)基。2周后,采用0.4%結(jié)晶紫對(duì)甲醛固定的細(xì)胞進(jìn)行染色,然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移水平的檢測(cè) 將指定轉(zhuǎn)染的直腸癌細(xì)胞HCT116或HT29置于6孔板中,并通過(guò)吸管劃傷。24 h后,清除碎片,在顯微鏡下拍攝傷口寬度,并通過(guò)Image J軟件計(jì)算。在涂有Matrigel的Transwell試驗(yàn)室的上腔填充100 μl無(wú)胎牛血清DMEM中的直腸癌細(xì)胞HCT116或HT29懸浮液。將含有15%胎牛血清的DMEM(600 μl)放入下腔。48 h后,用0.1%水晶紫對(duì)下腔室中的甲醛固定細(xì)胞進(jìn)行染色,并在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6 免疫印跡 直腸癌細(xì)胞HCT116或HT29在細(xì)胞組織快速裂解液裂解和提取緩沖液中進(jìn)行裂解。酸性蛋白試劑盒被用來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解液中的蛋白濃度。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞裂解液,然后將蛋白質(zhì)樣品電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。采用5%牛血清白蛋白溶液阻斷膜,然后采用一級(jí)抗體過(guò)夜。采用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育后,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)膜上條帶的免疫活性。通過(guò)Image J軟件以β-actin為內(nèi)參計(jì)算條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與HOXD-As2組熒光素酶活性及相應(yīng)的mRNA、蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比,HOXD-As2組熒光素酶活性下降,而mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)情況增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與HOXD-As2組熒光素酶活性及mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)情況比較

2.2 LncRNA HOXD-As2對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移影響 與對(duì)照組相比,HOXD-As2組直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移水平及N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)均下降,E-cadherin蛋白表達(dá)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 LncRNA HOXD-As2對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移影響(a.不同時(shí)間點(diǎn)HCT116與HT29細(xì)胞活力水平;b.LncRNA HOXD-As2對(duì)細(xì)胞增殖水平影響;c.LncRNA HOXD-As2對(duì)細(xì)胞侵襲水平影響;d.LncRNA HOXD-As2對(duì)細(xì)胞遷移水平影響;e.LncRNA HOXD-As2對(duì)細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin與MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)情況影響)

2.3 LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移影響 與對(duì)照組相比,HOXD-As2組直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29中HOXD8的mRNA與蛋白表達(dá)水平均顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Vector組相比,HOXD8組直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移水平及N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著下降,E-cadherin蛋白表達(dá)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移影響(a.不同時(shí)間點(diǎn)LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對(duì)細(xì)胞活力水平;b.LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對(duì)細(xì)胞增殖水平;c.LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對(duì)細(xì)胞侵襲水平;d.LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對(duì)細(xì)胞遷移水平;e.LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對(duì)細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)情況)

2.4 LncRNA HOXD-As 對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移機(jī)制影響 HOXD-As2組直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR水平均低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HOXD8組直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR水平均低于Vector組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 LncRNA HOXD-As對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移機(jī)制影響(a.過(guò)表達(dá)LncRNA HOXD-As2對(duì) 細(xì)胞p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR相對(duì)表達(dá)水平影響;b.過(guò)表達(dá)HOXD8對(duì)細(xì)胞p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR相對(duì)表達(dá)水平影響)

3 討論

腫瘤作為一種多基因疾病,其主要機(jī)制為細(xì)胞逃避正常的生長(zhǎng)控制進(jìn)行自主增殖;同時(shí),通過(guò)原癌基因的激活或腫瘤抑制基因的突變或缺失而表現(xiàn)出一定的侵襲性[9]。癌癥的發(fā)生存在許多調(diào)節(jié)因素,這些調(diào)節(jié)因子可以控制癌基因或抑癌基因的表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)展作用。LncRNA作為一類(lèi)沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)的能力的RNA,其在人體中可以通過(guò)調(diào)控各種細(xì)胞因子、促凋亡和抗凋亡基因等信號(hào)分子的表達(dá),控制細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。LncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[10]。HOXD-AS2作為Homeobox D基因的反義鏈,主要定位于人染色體2q31.1,長(zhǎng)度為692 bp。有研究報(bào)道,LncRNA HOXD-AS2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá),并與神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級(jí)和預(yù)后不良[11]。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn),LncRNA HOXD-AS1可以通過(guò)抑制HOXD3誘導(dǎo)的整聯(lián)蛋白β3轉(zhuǎn)錄激活和MAPK/AKT信號(hào)通路來(lái)調(diào)控大腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,但具體機(jī)制并不清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,HOXD-As2組直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移水平及N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)均下降,E-cadherin蛋白表達(dá)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示,LncRNA HOXD-As2可能通過(guò)調(diào)控E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白表達(dá)參與直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。有研究報(bào)道,LncRNA HOXD-AS2的表達(dá)下降通過(guò)靶向HOXD8促進(jìn)胃癌進(jìn)展[13]。在膠質(zhì)瘤中,LncRNA HOXD-AS2的下調(diào)通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[14]。Homeobox基因作為發(fā)育調(diào)節(jié)基因,在胚胎發(fā)育過(guò)程中給予細(xì)胞位置信息[15]。有研究報(bào)道,HOX基因參與肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌以及黑色素瘤腫瘤的發(fā)展[16-17]。在直腸癌中,與原發(fā)組織相比,HOXD8的表達(dá)在臨床癌癥組織中特別是在轉(zhuǎn)移灶中被下調(diào)[18]。本研究結(jié)果顯示,與Vector組相比,HOXD8組直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29的細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移水平及N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著下降,E-cadherin蛋白表達(dá)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示,LncRNA HOXD-As2可能通過(guò)與靶基因HOXD8相互作用,抑制PI3K/Akt通路影響直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。這可能是由于PI3K/AKT信號(hào)通路作為人體中調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵通路,激活PI3K/AKT信號(hào)通路可明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[19-20]。

綜上所述,LncRNA HOXD-As2通過(guò)與靶基因HOXD8相互作用,上調(diào)HOXD8的mRNA與蛋白表達(dá)水平,抑制PI3K/Akt通路,降低直腸癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移水平。