4種定量檢驗(yàn)項目線性范圍確認(rèn)方法的比較*

李洪雷,王丹晨,馬超超,徐二木,侯立安,夏良裕(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100730)

線性范圍(linear range)指使實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的最終分析結(jié)果為可接受的線性濃度范圍,此時非線性誤差應(yīng)低于允許誤差[1]。臨床實(shí)驗(yàn)室常采用平均斜率法[2]、線性稀釋回收法[2-3]、美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)的EP06-A指南[4]確定檢測項目的線性。2020年11月CLSI對EP06-A進(jìn)行修訂,頒布了EP06-Ed2[5]替代EP06-A,該版本推薦采用加權(quán)最小二乘法擬合預(yù)測值和檢測值之間的線性,而不再采用擬合多項式進(jìn)行線性驗(yàn)證。本研究以尿總蛋白定量分析項目為代表研究對象,將EP06-Ed2方法與EP06-A、平均斜率法、線性稀釋驗(yàn)證法進(jìn)行比較,為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇線性范圍確認(rèn)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集臨床檢測剩余尿液樣品用于本研究。收集尿總蛋白濃度超過試劑說明書檢測上限高值樣品(H)和尿總蛋白濃度接近檢測下限的低值樣品(L)。

1.2儀器與試劑 Beckman AU2700自動生化分析儀。尿總蛋白試劑盒(RANDOX公司,批號:408949)。檢測原理為焦酚紅比色法。按照制造商提供的說明書設(shè)置參數(shù),完成校準(zhǔn)和質(zhì)控,在實(shí)驗(yàn)開始前檢測質(zhì)控物,結(jié)果合格后開始實(shí)驗(yàn)。

1.3樣品制備

1.3.1線性初步評價樣品 選擇34 mg/L低濃度樣品(L)和5 510 mg/L高濃度樣品(H),按照體積比為10L、9L∶1H、8L∶2H、7L∶3H、6L∶4H、5L∶5H、4L∶6H、3L∶7H、2L∶8H、1L∶9H、10H制備11份樣品。從低到高各檢測3次,記錄結(jié)果。

1.3.2線性確定實(shí)驗(yàn)樣品 根據(jù)線性初步評價結(jié)果去掉明顯偏離直線的數(shù)據(jù)點(diǎn)后選擇臨床樣品中已測濃度為9 mg/L的低濃度樣品(L)和3 222 mg/L的高濃度樣品(H),按10L、9L∶1H、8L∶2H、7L∶3H、6L∶4H、5L∶5H、4L∶6H、3L∶7H、2L∶8H、1L∶9H、10H的比例制備11份樣品。

1.4線性范圍驗(yàn)證方法 分別采用EP06-Ed2、EP06-A、平均斜率法及線性稀釋回收法確定尿總蛋白的線性范圍。

1.4.1EP06-Ed2法確定線性 采用高、低濃度的樣品混合制備線性評估樣品,保證混合后的濃度在線性范圍內(nèi);線性范圍內(nèi)的每個樣品檢測3次取平均值;采用散點(diǎn)圖剔除離群值;每個濃度樣品檢測的平均濃度與預(yù)期濃度確定最佳的擬合直線回歸方程;每個濃度樣品的平均值與最佳擬合直線的擬合值的偏差均在線性允許偏差(allowable deviation from linearity,ADL)范圍內(nèi),則證明該線性可接受。

1.4.2EP06-A法確定線性 以樣品號為X,實(shí)測值的均值為Y,繪制散點(diǎn)圖。初步檢查數(shù)據(jù),剔除離群值,判斷重復(fù)性,進(jìn)行多項式回歸分析,并繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行評價。測量數(shù)據(jù)擬合為一次多項式(Y=b0+b1X)、二次多項式(Y=b0+b1X+b2X2)、三次多項式(Y=b0+b1X+b2X2+b3X3)。采用統(tǒng)計學(xué)計算每個非線性系數(shù)斜率的標(biāo)準(zhǔn)誤SEi,然后采用t檢驗(yàn),判斷非線性系數(shù)與0差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義,即P<0.05代表非線性系數(shù)與0差異有統(tǒng)計學(xué)意義。最終求得臨床可接受的最佳擬合多項式。

1.4.3平均斜率法確定線性

1.4.3.1線性初步評價 參考CLSI EP06-A[4]方案,將11份樣品按濃度由低到高依次編號,每個樣品重復(fù)測定3次。以樣品號為橫坐標(biāo)(X),該樣品號對應(yīng)的檢測結(jié)果的均值為縱坐標(biāo)(Y),繪制散點(diǎn)圖,根據(jù)分布情況目測離群值,初步判定檢測上限。

1.4.3.2平均斜率法確定線性 線性確認(rèn)樣品各重復(fù)測量3次,記錄結(jié)果。以預(yù)期值為X,實(shí)測值的均值為Y繪制散點(diǎn)圖,計算直線回歸方程Y=a+bX、相關(guān)系數(shù)(r)及回歸決定系數(shù)(R2)。若R2>0.995,斜率(b)的95%可信區(qū)間包含1,截距(a)的95%可信區(qū)間包含0,即可確定呈線性,若上述任何一項不滿足條件,則去掉最高點(diǎn)數(shù)據(jù)重新確定。

1.4.4線性稀釋回收法 根據(jù)高、低樣品配制的比例關(guān)系,計算每個樣品的理論值,將試劑檢測結(jié)果作為實(shí)測值,以理論值作為X,實(shí)測值作為Y,進(jìn)行直線回歸分析,若R2≥0.975,b的95%可信區(qū)間包含1(b與1差異無統(tǒng)計學(xué)意義),a的95%可信區(qū)間包含0(a與0差異無統(tǒng)計學(xué)意義),則可判斷為線性,然后計算稀釋回收率,可接受范圍為90%～110%,則可確定實(shí)驗(yàn)所選的濃度即為線性范圍。若上述任何一項不滿足條件,則去掉最高點(diǎn)數(shù)據(jù)重新確定。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 用Excel2016和MedCalc15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1線性初步評價結(jié)果 線性評價散點(diǎn)圖見圖1。目測從第6個樣品(實(shí)測濃度為3 308 mg/L)開始,測量結(jié)果偏低,初步判斷線性上限在3 300 mg/L。

圖1 線性初步評價散點(diǎn)圖

2.2EP06-Ed2法確定線性[5]目測法觀察離群值:尿總蛋白重復(fù)檢測濃度及相對濃度(relative concentrations,RCs)散點(diǎn)圖顯示所有重復(fù)檢測結(jié)果均包括在線性范圍內(nèi),故不需要剔除離群值。不精密度驗(yàn)證:每個樣品重復(fù)檢測3次,重復(fù)性以CV表示,為0.3%～6.2%。采用加權(quán)最小二乘法(weighted least squares regression,WLS)計算線性。自變量(X)為期望值,因變量(Y)為檢測值,WLS權(quán)重為R/Var(R為重復(fù)檢測次數(shù),Var為方差),方程為Y=1.025X+0.72,R2為0.999。尿總蛋白線性范圍計算結(jié)果見表1。ADL均在±10%以內(nèi)。最終確定線性范圍為9～3 222 mg/L。

表1 尿總蛋白線性范圍計算結(jié)果

2.3EP06-A法確定線性 一次多項式、二次多項式、三次多項式結(jié)果及擬合曲線見表2。EP06-A方法評價二次、三次多項式與直線回歸的偏差結(jié)果見表3。二次多項式與一次多項式的百分偏差為-103.2%～2.4%,三次多項式與一次多項式的百分偏差為-70.3%～0.4%。二次多項式、三次多項式與一次多項式的差值顯示均為低濃度偏差較大,最終確定線性范圍為331～3 222 mg/L。

表2 尿總蛋白EP06-A評價多項式擬合結(jié)果

表3 EP06-A方法評價二次、三次多項式與直線回歸的偏差(11個點(diǎn))

2.4平均斜率法確定線性 線性初步評價結(jié)果顯示,回歸方程為Y=35.4+1.0X,R2為0.999,r為0.999 6(95%CI:0.998 4～0.999 9),a為35.4(95%CI:-6.2～76.9),b為1.0(95%CI:0.99～1.03)。確定線性范圍為9～3 222 mg/L。

2.5線性稀釋回收法 9～3 222 mg/L之間的11份樣品的檢測結(jié)果同平均斜率法?；貧w方程為Y=35.4+1.0X,R2為0.999,r為0.999 6(95%CI:0.998 4～0.999 9),a為35.4(95%CI:-6.2～76.9),b為1.0(95%CI:0.99～1.03),確定為線性。每個濃度樣品的稀釋回收率結(jié)果見表4,回收率在100%～106.4%,稀釋偏差在0%～6.4%,最終確定線性范圍為9～3 222 mg/L。

表4 線性稀釋回收法確定線性范圍的每個濃度樣品稀釋回收率結(jié)果

3 討論

非配套檢測系統(tǒng),即由實(shí)驗(yàn)室選擇不同廠商生產(chǎn)的分析儀器和試劑組合而成的自建檢測系統(tǒng),在國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多。ISO 15189要求對自建檢測系統(tǒng)性能進(jìn)行確認(rèn),證明其性能滿足臨床要求后方可應(yīng)用于臨床檢測工作中[6]。線性范圍是反映檢測系統(tǒng)性能的一項關(guān)鍵指標(biāo),其確認(rèn)方法有多種,常用的有EP06-A、平均斜率法、線性稀釋回收法[7]。2020年CLSI以EP06-Ed2替代EP06-A,國內(nèi)對該方法與評價較少,本研究對上述4種方法進(jìn)行比較研究,可為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇線性范圍確認(rèn)方法提供參考。

線性范圍確認(rèn)過程的第一步為目測法初步評價,通過研究可發(fā)現(xiàn)該方法比較簡單,容易識別非線性數(shù)據(jù)點(diǎn),是確定后續(xù)研究高濃度水平樣品選擇的依據(jù)。

本研究采用EP06-Ed2、平均斜率法、線性稀釋回收法確定的尿總蛋白的線性范圍均為9～3 222 mg/L,而EP06-A法確定的線性范圍為331～3 222 mg/L。EP06-A法的線性范圍下限明顯高于另外3種方法,存在很大的偏差,這是該方法的重大缺陷。由本研究可見,新發(fā)布的EP06-Ed2已經(jīng)對此進(jìn)行修正,采用最小加權(quán)二乘法和臨床可接受性偏差分析方法避免這個問題。EP06-A統(tǒng)計過程中要進(jìn)行數(shù)個多項式的回歸分析及數(shù)據(jù)擬合分析,對于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作人員而言,統(tǒng)計過程太過復(fù)雜,不易掌握。采用最小加權(quán)二乘法取代了EP06-A的多項式回歸方法,簡化了方法的同時也提供了一種相對簡單的分析方法,更便于臨床實(shí)驗(yàn)室工作人員的掌握與應(yīng)用。相對于EP06-A和EP06-Ed2,平均斜率法、線性稀釋回收法操作簡單,不需要復(fù)雜的統(tǒng)計過程,結(jié)果滿足常規(guī)工作需求,適于臨床實(shí)驗(yàn)室選擇采用。