長(zhǎng)沙地區(qū)血小板供者基因數(shù)據(jù)庫(kù)理論建模分析*

蔣義,陽(yáng)智芬,曹麗群,陳潔,楊妞,康甜,謝毓濱(長(zhǎng)沙血液中心輸血研究所,長(zhǎng)沙410001)

單采血小板輸注主要用于預(yù)防和治療血小板減少或血小板功能異常引起的出血,然而免疫性血小板無(wú)效輸注(platelet transfusion refractoriness,PTR)在長(zhǎng)期血小板輸注的患者中發(fā)生率為10%～70%,遠(yuǎn)高于其他輸血不良反應(yīng)的發(fā)生率[1]。免疫性PTR主要由人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)抗體及人類(lèi)血小板抗原(human platelet antigen,HPA)抗體引起,而HLA及HPA抗原具有遺傳多態(tài)性,在不同地區(qū)和不同人群中分布有所差異[2]。因此,建立本地區(qū)血小板供者已知HLA/HPA基因數(shù)據(jù)庫(kù),可為臨床提供與患者HLA/HPA相匹配的單采血小板,大大降低免疫性PTR的發(fā)生,提高臨床血小板輸注的有效性。目前,長(zhǎng)沙地區(qū)已建立了血小板供者已知HLA/HPA基因數(shù)據(jù)庫(kù),但建立多大的庫(kù)存規(guī)?？蓾M足本地區(qū)臨床基因匹配單采血小板的供應(yīng)尚在摸索實(shí)踐中,本研究通過(guò)對(duì)已知數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,探討建設(shè)規(guī)模與匹配程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 長(zhǎng)沙地區(qū)無(wú)親緣關(guān)系的單采血小板捐獻(xiàn)者1 029名,年齡18～45歲,所有志愿者均簽署加入血小板資料庫(kù)知情同意書(shū)。本研究已通過(guò)長(zhǎng)沙血液中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器與試劑 Ion Gene StudioTMS5二代測(cè)序儀,A24811 PCR儀、Q5熒光定量PCR儀及AllTypeTMNGS HLA分型試劑(美國(guó)賽默飛世爾科技公司),Epoch酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司),熒光PCR法HPA基因分型試劑盒(江蘇偉禾公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取外周血DNA,其濃度≥30 ng/μL,A260 nm/A280 nm值1.6～2.0。

1.3.2HPA基因分型 采用多重?zé)晒釶CR法,按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HPA-1～6、10、15及21的基因分型,針對(duì)HPA系統(tǒng)多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和熒光探針,利用Taq酶5′端外切的特性,分離探針上的淬滅熒光基團(tuán)和報(bào)告熒光基團(tuán),依據(jù)熒光強(qiáng)度直接分析產(chǎn)物情況。使用配套軟件(WeHelpReportV1.0.0.26),內(nèi)標(biāo)無(wú)異常,擴(kuò)增曲線呈典型S型且CT值<35判斷HPA基因相應(yīng)亞型陽(yáng)性。

1.3.3HLA基因分型 采用二代測(cè)序法,按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行HLA基因測(cè)序,測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使用配套TSV軟件分析基因型。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SHESIS軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)檢驗(yàn),HLA-A、B位點(diǎn)及HPA等位基因觀察頻率及理論頻率之間的比較采用χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為0.05。

采用直接計(jì)算法計(jì)算HLA-A、B位點(diǎn)及HPA等位基因頻率(allele frequency,AF):AF=(aa+ab/2)/總?cè)藬?shù),a、b等位基因。基因型頻率(genotype frequency,GF):GF=陽(yáng)性數(shù)(aa或ab或bb)/總?cè)藬?shù),采用MATLAB軟件評(píng)估血小板庫(kù)HLA、HPA表型匹配概率及最小庫(kù)容:如果用fi表示第i種表型的頻率,在由n個(gè)供者組成的血小板庫(kù)中,任何患者都能找到至少1例HLA表型或HPA表型相同供者的概率為P,P=∑fi×[1-(1-fi)n],i代表所有可能的表型[3]。P值與血小板庫(kù)中的供者數(shù)N以及表型頻率相關(guān),如果以N為橫坐標(biāo),以計(jì)算求得的P值為縱坐標(biāo),可得到一條P值隨N變化的曲線,通過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化可導(dǎo)出表型匹配概率曲線的回歸方程式,計(jì)算得到一定供者數(shù)情況下找到≥1例HLA表型匹配供者的概率及最小庫(kù)容。

計(jì)算CREG(cross-reactive groups,交叉反應(yīng)組)各組頻率及不配合率:根據(jù)CREG血清學(xué)特點(diǎn),將HLA-A、B抗原分成9個(gè)組(1C、2C、4C、5C、6C、7C、8C、10C和12C)[4],CREG基因頻率為其對(duì)應(yīng)的HLA-A、B抗原頻率之和,CREG不配合概率(Punmatch,Pu),Pu=2xy(1-xy),x和y為CREG基因頻率。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn) 1 029名血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)捐獻(xiàn)者的HLA-A、B位點(diǎn),HPA基因型的觀察頻率與理論頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HLA-A:χ2=32.329,P=0.18;HLA-B:χ2=40.563,P=0.35;HPA:χ2=26.563,P=0.12,Pc>0.05),該研究對(duì)象HLA-A、B,HPA等位基因的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)HLA等位基因多態(tài)性 1 029名血小板捐獻(xiàn)者中,檢出HLA-A等位基因34個(gè)(見(jiàn)表1),其中頻率大于1%的13個(gè),最高的依次為A*11:01、A*24:02、A*02:07、A*02:01、A*33:03,累計(jì)頻率占A位點(diǎn)的75.02%;檢出HLA-B等位基因75個(gè)(見(jiàn)表2),其中頻率大于1%的19個(gè),最高的依次為B*40:01、B*46:01、B*13:01、B*58:01、B*15:02,累計(jì)頻率占B位點(diǎn)的51.11%;根據(jù)等位基因分布推出對(duì)應(yīng)抗原分布情況,見(jiàn)表3。檢出HLA抗原表型619種,其中頻率大于1%的6種,分別為A2-A11-B60-B46(2.33%)、A2-A2-B46-B46(1.46%)、A2-A11-B75-B46(1.46%)、A2-A33-B46-B58(1.36%)、A2-A24-B60-B46(1.07%)、A11-A11-B13-B60(1.07%)。

表2 HLA-B等位基因分布

表3 長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)HLA-A、B位點(diǎn)抗原分布

2.3長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)HPA等位基因多態(tài)性 1 029名血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)捐獻(xiàn)者HPA 1～6、10、15、21中,HPA-3和HPA-15雜合度較高,HPA 2a頻率為95.72%,HPA-1a、HPA-4a、HPA-5a、HPA-6a、HPA-10a、HPA-21a頻率均高于98%,未檢出HPA-10b,HPA基因型及等位基因頻率見(jiàn)表4。共檢出59種HPA表型,其中頻率大于1%的13種,最常見(jiàn)的表型為HPA 1aa-2aa-3ab-4aa-5aa-6aa-10aa-15ab-21aa(20.89%),其次為HPA 1aa-2aa-3aa-4aa-5aa-6aa-10aa-15ab-21aa(15.45%)和HPA 1aa-2aa-3ab-4aa-5aa-6aa-10aa-15aa-21aa(10.79%)。

表4 長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)HPA基因型分布

2.4長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)HLA、HPA表型匹配概率 HLA和HPA表型匹配概率(P)與庫(kù)容(N)的關(guān)系見(jiàn)表5,當(dāng)庫(kù)容為1 065人,80%的患者可以在長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)找到至少1名HLA-A、B位點(diǎn)表型一致的供者;當(dāng)庫(kù)容為2 127人,匹配概率為95%;目前庫(kù)容為1 029人,匹配概率為79.25%。當(dāng)庫(kù)容為207人的時(shí)候,95%的患者在長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)找到至少1名HPA表型一致的供者。血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)人數(shù)與HLA及HPA表型匹配概率擬合曲線圖見(jiàn)圖1。

圖1 血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)人數(shù)與HLA及HPA表型匹配概率曲線

表5 HLA和HPA表型匹配概率(P)與庫(kù)容(N)的關(guān)系

2.5長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)CREGs不配合率 長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)CREGs頻率見(jiàn)表6,HLA-A抗原CREG表位發(fā)生的1C與2C不配合的概率(44.31%)最高;1C與10C、2C與10不配合率分別為38.24%、36.20%。HLA-B抗原CREG表位發(fā)生的7C與5C不配合的概率(33.12%)最高;5C與12C、7C與12C不配合率分別為26.24%、24.25%。Broad CREG中4C與6C的不配合概率為42.24%;4C與8C、8C與10C不配合率分別為6.61%、10.01%。

表6 長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)CREGs頻率

3 討論

估計(jì)HLA-Ⅰ匹配供者的血小板捐獻(xiàn)者庫(kù)的大小,通常需要準(zhǔn)確計(jì)算HLA表型頻率,了解人群中HLA表型的分布情況[5-6]。長(zhǎng)沙地區(qū)HLA A/B抗原表型相對(duì)集中,13種HLA-A頻率大于0.01,累計(jì)頻率75.02%,19種HLA-B頻率大于0.01,累計(jì)頻率的51.11%。本研究中統(tǒng)計(jì)的HLA等位基因多態(tài)性、高頻表型與文獻(xiàn)中長(zhǎng)沙地區(qū)HLA等位基因多態(tài)性及表型報(bào)道接近[7],結(jié)合Hardy-Weinberg平衡結(jié)果可知長(zhǎng)沙地區(qū)獻(xiàn)血人群群體遺傳穩(wěn)定,更利于后續(xù)建庫(kù)尋找相合供者。

HPA系統(tǒng)中對(duì)偶抗原不配合的比例越高,產(chǎn)生HPA抗體的機(jī)會(huì)越多,造成PTR的可能性越大[8-9]。作為供者,患者產(chǎn)生HPA同種免疫性抗體后,有效的供者應(yīng)與患者具有相同的HPA-aa或bb純合子基因型。本研究結(jié)果可見(jiàn),長(zhǎng)沙地區(qū)除HPA-3、15雜合較高外,其余98%以a基因?yàn)橹?說(shuō)明長(zhǎng)沙地區(qū)人群HPA系統(tǒng)組合分布相對(duì)集中,找到上述HPA系統(tǒng)相符供者基因庫(kù)容也相對(duì)較小。

計(jì)算長(zhǎng)沙地區(qū)單采血小板捐獻(xiàn)者HLA-A、B等位基因頻率,表型頻率并推導(dǎo)出最大限度滿足等待血小板輸注患者需求庫(kù)容。根據(jù)本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),在不考慮ABO血型的情況下,理論預(yù)測(cè)長(zhǎng)沙地區(qū)血小板供者資料庫(kù)庫(kù)容為1 029人,約有79.25%的患者能在該庫(kù)中找到≥1名HLA-A、-B表型匹配的供者。當(dāng)庫(kù)容為207人的時(shí)候,95%的患者在長(zhǎng)沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫(kù)找到至少1名HPA表型一致的供者。

精準(zhǔn)匹配與輸注對(duì)臨床應(yīng)用而言卻更加縮小了供體選擇范圍,針對(duì)患者存在抗HLA的情形,可利用不完全相合供、受體即交叉反應(yīng)組CREG抗原相合、HLA-Matchmaker表位匹配法等[10]。故了解本地區(qū)單采血小板捐獻(xiàn)者CREGs基因頻率及表位不配合率對(duì)供者的選擇和減少因CREG抗原免疫產(chǎn)生CREG抗體所導(dǎo)致的PTR具有重要意義[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)HLA-A抗原CREG表位的1C與2C、HLA-B抗原CREG表位的7C與5C,Broad CREG的4C與6C的不配合概率均較高,在臨床血小板輸注時(shí)選擇供者應(yīng)予以關(guān)注。

抗原已知型血小板供者庫(kù)的建立可為各類(lèi)免疫性血小板減少患者快速找抗原相配合血小板供者[12-13]。在未能找到抗原陰性相合患者時(shí),可結(jié)合CREG特異性分析。理論上庫(kù)容越大,找到供者的可能性就越大,但也需考慮建庫(kù)成本和效益,當(dāng)庫(kù)容量達(dá)到一定大小時(shí),增加供者獲得的效益將降低[14]。實(shí)際工作中,因選擇的獻(xiàn)血者在需要的規(guī)定時(shí)間內(nèi)無(wú)法捐獻(xiàn)[1],比如仍在獻(xiàn)血間隔期,暫時(shí)無(wú)合適時(shí)間、失去聯(lián)系等;另外ABO血型匹配、臨床患者對(duì)血小板制品的需求時(shí)間緊迫,無(wú)法等候配合血小板各流程所需時(shí)間,因此配合需要考慮患者有多次需求和供者的及時(shí)性問(wèn)題,國(guó)外學(xué)者有建議理論庫(kù)容選擇至少有5個(gè)以上完全兼容供者[15]。因此,我們?cè)诤罄m(xù)血小板配型的臨床應(yīng)用時(shí),結(jié)合ABO血型匹配性,在擴(kuò)大有效庫(kù)容的同時(shí)將進(jìn)一步驗(yàn)證理論建模的適用性和匹配概率的符合性。