1例自身抗LW的血清學(xué)鑒定及基因分析

黃嫻,吳麗娜,李彤彤,解金輝(天津市血液中心免疫血液學(xué)研究室,天津 300110)

Landsteiner-Wiener(LW)血型系統(tǒng)(ISBT016)包括3個抗原:LWa、LWb、LWab,均由細(xì)胞間黏附分子4(intercellular adhesion molecule 4,ICAM4)基因編碼。LWa和LWab為高頻抗原[1],LWb為低頻抗原,LWa和LWb是對偶抗原。LWa/LWb抗原多態(tài)性的分子基礎(chǔ)是299A>G單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致LW糖蛋白Gln100Arg氨基酸的替換[2]。雖然LW與RhD是不同的抗原,但對成人而言,LW表達(dá)量與RhD表達(dá)量呈正相關(guān),成人RhD陰性紅細(xì)胞的LW抗原表達(dá)少,因此抗LW 常被誤認(rèn)為抗D。但新生兒紅細(xì)胞上LW強表達(dá)[3],新生兒RhD陽性、陰性紅細(xì)胞與抗LW反應(yīng)均比成人紅細(xì)胞強,可以通過相關(guān)試驗加以區(qū)分。本實驗室鑒定1例自身抗LW并進行基因測序,報告如下。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本來源 患者,女,89歲,孕1產(chǎn)1,2004年因乳腺手術(shù)輸血,2022年入院診斷為淋巴瘤,血紅蛋白37 g/L,需輸注紅細(xì)胞,醫(yī)院因不規(guī)則抗體篩查陽性送檢血液樣本至天津市血液中心進行抗體鑒定和交叉配血。

1.2主要試劑與儀器 單克隆抗A、抗B及反定型ABO紅細(xì)胞(上海血液生物制品公司),IgM抗D、不規(guī)則抗體篩選紅細(xì)胞、16系譜細(xì)胞(荷蘭Sanquin公司),微柱凝膠卡(美國Bio-Rad公司),Rh分型試劑(德國CE公司),酸放散試劑(珠海貝索公司),DNA提取試劑盒(廣州美基生物公司),Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。孵育器、卡式離心機(美國Bio-Rad公司),離心機(日本KUBOTA公司),分光光度計(德國Implen公司),PCR儀(美國AB公司),電泳儀(美國Thermo Fisher公司),凝膠成像儀(北京東訊天地公司)。

1.3血清學(xué)檢測

1.3.1血型和直接抗球蛋白試驗 采用試管法對進行ABO、Rh分型,采用多抗卡進行直接抗球蛋白試驗,由于試劑限制未進行直接抗球蛋白分型。

1.3.2不規(guī)則抗體篩查與鑒定 采用鹽水法、微柱凝膠卡,結(jié)合木瓜酶處理、0.2 mol/L DTT處理細(xì)胞,參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》、《AABB技術(shù)手冊(第20版)》和試劑說明書操作。

1.3.3與新生兒紅細(xì)胞反應(yīng) 因未取得臍血,使用出生2 d的新生兒紅細(xì)胞,據(jù)報道新生兒RhD陰性紅細(xì)胞上的LW抗原數(shù)量多于成人[3]。為排除D變異型和Del干擾,本研究使用的所有RhD陰性成人紅細(xì)胞、新生兒紅細(xì)胞均使用3種不同廠家試劑確認(rèn),且Rh分型均為ccdee。

1.3.4吸收放散試驗 患者自身細(xì)胞放散:取患者壓積紅細(xì)胞,洗滌5次,按照試劑盒說明書進行酸放散。新生兒RhD陰性紅細(xì)胞吸收患者血清后放散:取O型、RhD陰性的新生兒壓積紅細(xì)胞與患者等體積的血清混勻,37 ℃溫育60 min,其間數(shù)次混勻使其充分吸收。離心后棄上清液, 洗滌5次,按照試劑盒說明書酸放散。用木瓜酶處理前后的O型RhD陽性、陰性成人紅細(xì)胞與放散液反應(yīng),采用微柱凝膠卡檢測。

1.3.5交叉配血試驗 患者血清與6份AB型RhD陽性紅細(xì)胞、2份AB型RhD陰性紅細(xì)胞,采用鹽水法、微柱凝膠卡、試管抗人球蛋白法進行主次側(cè)交叉配血。

1.4ICAM4基因測序 按照試劑盒說明書提取外周血基因組DNA。擴增和測序引物使用NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST程序設(shè)計,由Invitrogen公司合成,序列見表1。PCR擴增反應(yīng)總體積為50 μL,含模板DNA 1 μL,正向引物L(fēng)WF(10 μmol/μL)2 μL,反向引物L(fēng)WR(10 μmol/μL)2 μL,dNTP 4 μL, 10×PCR Buffer 5 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.6 μL。擴增程序:96 ℃預(yù)變性8 min;95 ℃ 20 s,75 ℃ 40 s,10個循環(huán);95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 2 min,30個循環(huán);72 ℃ 延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR產(chǎn)物,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察并鑒定產(chǎn)物的特異性。擴增產(chǎn)物純化后委托上海生工生物工程公司測序。序列比對和分析使用DNAMAN 軟件進行,與GenBank中的NG_007728.1序列比對,確定標(biāo)本的LW基因型。

2 結(jié)果

2.1血型和直接抗球蛋白試驗 患者血型為AB,CCDee。直接抗球蛋白試驗陽性2+s。

2.2抗體篩查 患者血清在鹽水介質(zhì)中抗篩陰性,在微柱凝膠卡中與RhD陽性的1、2號細(xì)胞凝集強度2+,與RhD陰性的3號細(xì)胞弱凝集w+,木瓜酶處理后凝集有所增強,0.2 mol/L DTT處理后均陰性,提示抗體對應(yīng)的抗原可能被DTT破壞。

2.3抗體鑒定 譜細(xì)胞結(jié)果顯示患者血清中的抗體呈抗D格局,在微柱凝膠卡中與RhD陽性的細(xì)胞凝集強度2+,與RhD陰性的細(xì)胞弱凝集w+。結(jié)合抗體篩查試驗0.2 mol/L DTT可破壞抗原抗體反應(yīng),疑似抗LW抗體。

2.4與新生兒紅細(xì)胞反應(yīng) 結(jié)果見表2,患者血清與新生兒RhD陽性、陰性紅細(xì)胞反應(yīng)凝集強度均強于成人RhD陰性紅細(xì)胞。

表2 患者血清與新生兒紅細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果

2.5吸收放散試驗 自身細(xì)胞放散液、新生兒RhD陰性紅細(xì)胞吸收患者血清后放散液,均與酶處理成人RhD陽性紅細(xì)胞反應(yīng)強于RhD陰性紅細(xì)胞,且新生兒RhD陰性紅細(xì)胞吸收患者血清后放散液反應(yīng)略強于自身細(xì)胞放散液。說明患者血清中的抗體可被新生兒RhD陰性紅細(xì)胞吸收,符合抗LW抗體特征,不同于抗D。

2.6交叉配血及輸血 患者血清與6份AB型RhD陽性紅細(xì)胞反應(yīng),主側(cè)鹽水法均陰性,微柱凝膠卡和試管抗人球法均陽性2+,與2份AB型RhD陰性紅細(xì)胞反應(yīng)主側(cè)鹽水法均陰性,微柱凝膠卡和試管抗人球法均呈弱陽性w+。為緩解患者貧血狀況,1周內(nèi)給予3次AB型RhD陰性紅細(xì)胞進行輸注,3次輸注后,患者血紅蛋白由37 g/L升至70 g/L,未發(fā)現(xiàn)輸血不良反應(yīng)。

2.7ICAM4基因測序結(jié)果 將標(biāo)本外顯子1、2、3的測序結(jié)果與參考序列對比,結(jié)果顯示第299位核苷酸為A純合子(圖1),該患者LW血型基因型為LWa/LWa。外顯子1～3其他位點與參比序列完全一致,未發(fā)現(xiàn)基因突變。

圖1 LW基因外顯子部分序列

3 討論

LW糖蛋白是細(xì)胞間黏附分子,也可與Rh蛋白、帶3蛋白在紅細(xì)胞膜上形成復(fù)合物。抗LW的譜細(xì)胞格局與抗D類似,抗體鑒定時可采取相關(guān)試驗予以區(qū)分:(1)DTT能破壞LW抗原肽鏈上的3個二硫鍵從而破壞LW抗原,但不能破壞D抗原[4]。(2)RhD陰性的成人紅細(xì)胞不含D 抗原,但含有少量LW抗原。(3)與成人紅細(xì)胞不同,RhD陽性和RhD陰性的新生兒紅細(xì)胞及臍血,均含有較多的LW抗原。有文獻(xiàn)報道RhD陰性的成人紅細(xì)胞可吸收抗LW[5],本研究采用新生兒RhD陰性的紅細(xì)胞吸收,與成人RhD陰性紅細(xì)胞相比,新生兒RhD陰性紅細(xì)胞LW抗原量更多,吸收效果更好?？蓪⒎派⒁号c新生兒紅細(xì)胞反應(yīng),凝集應(yīng)更強。(4)據(jù)報道,LW抗原不會被木瓜酶、無花果酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶破壞,但可被鏈酶蛋白酶破壞[6]。本實驗結(jié)果顯示木瓜酶對反應(yīng)有所增強,與文獻(xiàn)[7]結(jié)果相符,有條件時可采用鏈酶蛋白酶處理。另外,由于本研究采用測序方法檢測患者LW基因型為LWa/LWa,推測患者LW血型為常見的LW(a+b-),不是產(chǎn)生同種抗LW的LW(a-b-)血型。進一步佐證本例抗LW為自身抗體,而非同種抗體。

抗LW在自身免疫性溶血性貧血患者體內(nèi)常見,絕大多數(shù)為自身抗體,多為IgG抗體,通常認(rèn)為臨床意義不大,僅有1例報道自身抗LW引起新生兒溶血癥[8]。對于含有抗LW的自身免疫性溶血性貧血,有長期體內(nèi)紅細(xì)胞存活研究和案例顯示[9-10],選擇RhD 陰性紅細(xì)胞安全有效;也有文獻(xiàn)[5]報道RhD陰性血稀缺時可篩選凝集最弱的RhD陽性紅細(xì)胞輸注。本例患者確診淋巴瘤,直接抗球蛋白試驗陽性,其自身抗體具有特異性,與RhD陽性紅細(xì)胞主側(cè)凝集均較強,選擇含有較少LW抗原的RhD陰性紅細(xì)胞可以降低抗LW抗體對紅細(xì)胞可能造成的破壞,臨床反饋輸注有效。