53例開放性手部及前臂外傷厭氧菌感染臨床及病原學(xué)特征

蘇玉,孫麗穎,劉穎(北京積水潭醫(yī)院.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,.手外科,北京100035)

感染是手和前臂開放性外傷主要的并發(fā)癥之一,引起感染的常見菌包括金黃色葡萄球菌、多殺巴斯德菌、鏈球菌屬等[1]。厭氧菌感染的獨(dú)立分析研究極少,可能與厭氧培養(yǎng)、病原學(xué)鑒定的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求高有關(guān)。雖然大多數(shù)厭氧菌毒力較弱,患者的初始癥狀隱匿,但是如診治不及時(shí),可發(fā)生屈指肌腱鞘炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎,導(dǎo)致手部功能障礙[2]。少數(shù)毒力極強(qiáng)的厭氧菌(如A型產(chǎn)氣莢膜梭菌等梭菌屬細(xì)菌)延診可導(dǎo)致創(chuàng)傷性氣性壞疽,致使患者截肢甚至危及生命[2-3]。所以對于手部和前臂開放性外傷發(fā)生的感染,厭氧菌的分析研究十分必要。本研究對53例手部及前臂厭氧菌感染患者的臨床和病原學(xué)資料進(jìn)行了回顧性分析,并對厭氧菌藥敏結(jié)果進(jìn)行分析,為開放性手部及前臂創(chuàng)傷相關(guān)的厭氧菌感染提供診斷和治療依據(jù)。

1 對象和方法

1.1研究對象 回顧性分析2015年1月—2021年12月就診于北京積水潭醫(yī)院的開放性手部和前臂外傷患者,納入全部術(shù)中取材送檢發(fā)現(xiàn)至少存在1種厭氧菌感染者,并排除3 d內(nèi)使用抗菌藥物治療的患者和術(shù)中送檢標(biāo)本數(shù)少于3份的患者,共53例患者納入分析。術(shù)前消毒程序遵守醫(yī)院骨科標(biāo)準(zhǔn)消毒程序(GB 15982-2012)。收集性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、受傷原因、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等臨床數(shù)據(jù),以及病原學(xué)鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則并且通過本院倫理委員會審查(批文號:202102-10)。

53例患者年齡范圍5～83歲,中位年齡56歲;男性41例,女性12例;有基礎(chǔ)疾病(糖尿病、高血壓)患者14例;受傷原因?yàn)橹苯踊蜷g接咬傷(動物咬傷、人咬傷、牙簽刺傷等)共39例,利器傷、機(jī)械傷或車禍傷14例;感染指標(biāo)中,白細(xì)胞升高(>9.50×109/L)31例,中性粒細(xì)胞百分比升高(>75%)30例;根據(jù)臨床表現(xiàn),局部感染表現(xiàn)(紅腫、流膿、竇道形成)49例,發(fā)生感染部位壞死4例。

1.2主要儀器與試劑 MALDI-TOF質(zhì)譜儀(德國布魯克公司),SimpliAmp PCR儀(美國ABI公司);CDC厭氧菌血瓊脂培養(yǎng)基(2015-2020年購于天津市金章科技公司,2021年購于江門市凱林貿(mào)易有限公司),厭氧環(huán)境指示劑(法國生物梅里埃公司),DNeasy PowerLyzer細(xì)菌DNA提取試劑盒(德國Qiangen公司),PCR預(yù)混液(賽默飛世爾公司),甲硝唑和莫西沙星藥敏試條(意大利Liofilchem公司),亞胺培南等其他藥敏試條(中國溫州康泰生物公司),引物合成(上海生工生物公司),PCR產(chǎn)物測序(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)。

1.3標(biāo)本采集和厭氧培養(yǎng) 標(biāo)本采集及厭氧培養(yǎng)操作流程遵循美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)M56-A[4]。至少采集患者術(shù)中感染組織樣本3份,立刻送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行需氧、微需氧、厭氧培養(yǎng),覆蓋普通細(xì)菌、微需氧菌、真菌及專性厭氧菌。對于厭氧培養(yǎng),接收厭氧標(biāo)本后立即接種于CDC厭氧菌血瓊脂培養(yǎng)基,置于35～37 ℃的厭氧袋。至少經(jīng)過48 h初代培養(yǎng)(產(chǎn)氣莢膜梭菌16～18 h),觀察初代培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落,并進(jìn)行革蘭染色,對疑似厭氧菌的菌落進(jìn)行2次耐氧試驗(yàn),以排除兼性厭氧菌。2次耐氧試驗(yàn)為陰性的細(xì)菌確定為專性厭氧菌。大于或等于3份樣本中生長同一種菌確定為致病菌。

1.4細(xì)菌鑒定 用MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行厭氧菌和非厭氧菌鑒定,操作依據(jù)儀器說明書,鑒定分值≥2.0的菌株結(jié)果可信,分值在1.700～1.999的菌株使用16S rRNA基因測序復(fù)核。僅發(fā)現(xiàn)部分微小小單孢菌或小韋榮球菌需作測序復(fù)核,從上述細(xì)菌培養(yǎng)平皿刮取菌落,用pH 8.0 TE緩沖液配制1.5×107CFU/mL菌液濃度,取300 μL菌液使用商品化試劑盒進(jìn)行DNA提取;引物設(shè)計(jì)參照GenBank中微小小單胞菌3119B株(序列號:NR_036934.1)等18株微小小單胞菌序列、小韋榮球菌DMS2008株(序列號:NR_074980.1)等10株小韋榮球菌序列,以及參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[5-6],采用Primer Premier 5.0和Clustal FW1.8軟件輔助設(shè)計(jì),正向引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物:5′-ACGGMTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL,包括DNA模板2 μL,20 μmol/L正、反向引物各1 μL,2×PCR預(yù)混液12.5 μL,無核酸酶水8.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性7 min;94 ℃變性1 min,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物及原引物外送測序,經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳、純化回收目的片段后使用ABI 3730xl測序儀雙向測通,測序結(jié)果使用DNASTAR Lasergene v7.1組件處理:EditSeq查看序列;SeqMan拼接序列;微小小單胞菌、小韋榮球菌序列用MegAlign分別與序列NR_036934.1和序列NR_074980.1進(jìn)行比對,其間所需序列格式轉(zhuǎn)換采用SeqVeter1.4。

1.5抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 用E-test法測定最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)M11-A8選擇藥物種類[7],包括甲硝唑、阿莫西林/克拉維酸、亞胺培南、美羅培南、莫西沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松。使用商品化的含有不同濃度的藥敏試條,實(shí)驗(yàn)操作遵循參考文獻(xiàn)[4,7],將試條與厭氧菌進(jìn)行35～37 ℃厭氧培養(yǎng),42～48 h后讀取MIC值。結(jié)果判定參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)M11-A8[7]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Excel 2017和SPSS 26.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料采用M(P25,P75)表示;計(jì)數(shù)資料以n(%)表示。

2 結(jié)果

2.1感染類型 53例患者可細(xì)分為6種感染類型:1種厭氧菌感染的病例較少,僅有6例(占11.3%);2種厭氧菌感染的4例(占3.8%);3種厭氧菌感染的3例(占5.7%);1種厭氧菌+1種非厭氧菌感染最多,共28例(占52.8%);1種厭氧菌+2種非厭氧菌9例(占17.0%);2種厭氧菌+2種非厭氧菌的3例(占5.7%)。53例患者中存在2種及以上細(xì)菌感染的共47例(占88.7%)。

2.2厭氧菌種類分布 53例患者共分離出26種66株厭氧菌,其中,革蘭陰性桿菌12種36株,革蘭陽性球菌5種15株,革蘭陽性芽胞桿菌6種8株,革蘭陰性球菌1種5株,革蘭陽性桿菌2種2株。見表1。

表1 26種66株厭氧菌種類及分布

2.3受傷原因與厭氧菌種類的關(guān)系 受傷原因?yàn)橹苯踊蜷g接咬傷的患者中,共分離出19種50株厭氧菌,占厭氧菌總株數(shù)的75.8%,其中39株為革蘭陰性菌,11株為革蘭陽性菌;從利器傷、機(jī)械傷或車禍傷患者中分離出11種16株厭氧菌,占24.2%,其中14株為革蘭陽性菌,2株為革蘭陰性菌。見表2。

表2 受傷原因與厭氧菌種類分布

2.4非厭氧菌種類與分布 53例患者中,共分離出22種49株非厭氧菌,依次為咽峽炎鏈球菌9株、糞腸球菌5株、中間鏈球菌4株、表皮葡萄球菌3株、陰溝腸桿菌3株、肺炎克雷伯菌3株、多殺巴斯德菌2株、產(chǎn)酸克雷伯菌2株、星座鏈球菌2株、金黃色葡萄球菌2株、銅綠假單胞菌2株、大腸埃希菌2株、弗氏檸檬酸桿菌1株、緩癥鏈球菌1株、雷氏普羅威登斯菌1株、門多撒假單胞菌1株、嗜水氣單胞菌1株、停乳鏈球菌1株、圖列茨放線菌1株、魏氏檸檬酸桿菌1株、無乳鏈球菌1株、血鏈球菌1株。

2.5主要革蘭陰性厭氧桿菌的藥物敏感性試驗(yàn) 5種23株非擬桿菌群的革蘭陰性厭氧菌包括中間普雷沃7株、具核梭桿菌6株、小韋榮球菌5株和產(chǎn)黑普雷沃菌5株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,其中22株菌對亞胺培南、美羅培南及甲硝唑的MIC值≤0.5 μg/mL,21株菌對哌拉西林/他唑巴坦的MIC值≤0.5 μg/mL,20株菌對阿莫西林/棒酸、莫西沙星的MIC值≤0.5 μg/mL,16株菌對頭孢曲松的MIC值≤0.5 μg/mL。見表3。

表3 5種23株非擬桿菌群的革蘭陰性厭氧菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

其次對5株脆弱擬桿菌的藥敏結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)4株對甲硝唑的MIC值≤0.5 μg/mL,3株菌對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦的MIC值≤0.5 μg/mL,2株菌對阿莫西林/棒酸、莫西沙星的MIC值≤0.5 μg/mL,對頭孢曲松的MIC值≥1 μg/mL。見表4。

表4 5株脆弱擬桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

3 討論

本研究共培養(yǎng)出厭氧菌26種,非厭氧菌22種,厭氧菌和非厭氧菌的混合感染占75.5%,說明同時(shí)進(jìn)行厭氧菌和非厭氧菌的培養(yǎng)和鑒定具有重要臨床意義。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌種類與受傷原因直接相關(guān)。直接或間接咬傷是發(fā)生厭氧菌感染的主要原因,其中革蘭陰性菌占比較高,主要為人或動物口腔來源的厭氧菌(如中間普雷沃菌、具核梭桿菌、產(chǎn)黑普雷沃菌等);而來源于外部環(huán)境的厭氧菌中革蘭陽性菌占比高(如梭菌屬的厭氧菌、海氏嗜胨菌、厭氧消化鏈球菌等)。受傷原因可對判斷感染部位的細(xì)菌種類起到重要的參考作用。

革蘭陰性厭氧桿菌是本研究中主要出現(xiàn)的厭氧菌類型。在分析主要革蘭陰性厭氧桿菌的藥敏結(jié)果時(shí),因擬桿菌群易產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,所以將脆弱擬桿菌進(jìn)行單獨(dú)分析[8]。革蘭陰性厭氧菌首選抗菌藥物依次為甲硝唑、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦。但因混合感染比例高,細(xì)菌種類復(fù)雜,如單純使用甲硝唑不能覆蓋所有病原菌種類,更建議使用超廣譜抗菌藥物。對于非擬桿菌群的厭氧菌,頭孢曲松的MIC值更低,而擬桿菌群的MIC值更高,說明頭孢曲松更適用于非擬桿菌群的厭氧菌感染治療。

手部和前臂的厭氧菌感染并不罕見,但文獻(xiàn)報(bào)道極少,本研究為開放性手部及前臂創(chuàng)傷相關(guān)的厭氧菌感染提供診斷和治療依據(jù)。本研究來自單中心數(shù)據(jù),未來尚需擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行多中心研究。