異常血紅蛋白Q-Thailand合并缺失型β-地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室分析*

張蕾,黎杏蘋,李博紅,尹珊珊,馮晴,吳維青(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心,廣東深圳 518017)

血紅蛋白病是一組常見的遺傳性血液病,其中珠蛋白鏈分子結(jié)構(gòu)異常者為異常血紅蛋白病,珠蛋白鏈合成量減少者為地中海貧血(簡(jiǎn)稱“地貧”)。目前廣泛實(shí)施的地貧防控措施是根據(jù)血常規(guī)和血紅蛋白組分表型的篩查結(jié)果[1],通過DNA檢測(cè)進(jìn)行基因分型確診,從而對(duì)夫婦雙方均為同型地貧基因攜帶的高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷,防止重型地貧患兒的出生。

異常血紅蛋白Q-Thailand(HbQ-Thailand)是中國(guó)南方地區(qū)常見的異常血紅蛋白之一[2],1958年由Vella等[3]在1個(gè)中國(guó)人家庭中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[4-5]。HbQ-Thailand是由于HBA1基因第74密碼子上發(fā)生GAC>CAC(HBA1: c.223G>C)突變,導(dǎo)致所編碼的天門冬氨酸變成谷氨酸,血紅蛋白毛細(xì)管電泳檢測(cè)有其特異圖譜,表現(xiàn)為Z7區(qū)出現(xiàn)高比例的可疑HbQ-Thailand帶、在Z1區(qū)出現(xiàn)HbQA2帶。研究顯示,HbQ-Thailand常與α-地貧-α4.2缺失連鎖遺傳[6]。β-地貧基因以點(diǎn)突變?yōu)橹?亦包含HBB基因大片段缺失[7]。缺失型β-地貧的血液學(xué)表型表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血,并以HbF明顯增高為顯著特征,而血紅蛋白毛細(xì)管電泳檢測(cè)的HbF也位于Z7區(qū),與HbQ-Thailand帶重疊。本研究報(bào)道2個(gè)HbQ-Thailand雜合子中檢出缺失型β-地貧基因的病例,分析總結(jié)其血液學(xué)參數(shù)表型特征,為此類復(fù)雜血紅蛋白病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、臨床診斷和遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 來我院進(jìn)行地貧篩查者2例:患者1,女性,30歲,就診日期2019年10月10日;患者2,女性,27歲,就診日期2019年2月13日。2例患者的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)為輕度小細(xì)胞低色素性貧血,毛細(xì)管血紅蛋白電泳結(jié)果均于Z7區(qū)出現(xiàn)高比例的可疑HbQ-Thailand帶、在Z1區(qū)出現(xiàn)HbQA2帶,即呈現(xiàn)HbQ-Thailand特征圖譜。2位研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本采集與處理 采集患者靜脈血2管(EDTA-K3抗凝,每管2 mL),一管用于血常規(guī)及血紅蛋白電泳檢測(cè),另一管4 ℃保存用于基因檢測(cè)。

1.3血液學(xué)分析 用XS-800i全血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex公司)及配套試劑進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè),以獲取紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、紅細(xì)胞平均體積(mean corpuscular volume,MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)等血液學(xué)表型參數(shù)。用SebiaCapillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳儀(法國(guó)Sebia公司)及配套試劑進(jìn)行血紅蛋白組分分析。

1.4常見地貧基因突變檢測(cè) 用Lab-Aid824核酸提取儀及配套試劑(廈門致善公司)從抗凝全血中提取基因組DNA(gDNA)。采用缺失型α、非缺失型α和β點(diǎn)突變地貧基因檢測(cè)試劑盒(深圳亞能生物公司)檢測(cè)中國(guó)人群常見的3種缺失型α-地貧基因(--SEA/、-α4.2/、-α3.7/),3種α非缺失型α-地貧基因(αCSα/、αWSα/、αQSα/),17種β-地貧基因(HBB:c.126_129delCTTT、c.52A>T、c.130G>T、c.216 _217insT、c.92+1G>T、c.92+ 5G>C、c.316-197C>T、c.-78A>C、c.-79A>G、c.-80T>C、c.-82C>A、c.-11_-8delAAAC、c.2T>G、c.45_46insG、c.84_85insC、c.79G>A、c.94delC)。

1.5Sanger測(cè)序 HbQ-Thailand是由于α1珠蛋白基因發(fā)生點(diǎn)突變。據(jù)此,特異性擴(kuò)增HBA1基因序列并進(jìn)行Sanger測(cè)序分析。擴(kuò)增及測(cè)序的上游引物(F)為5′-GGAGGGTGGAGACGTCCTG-3′,下游引物(R)為5′-CAAAGACCACGGGGGTACG-3′。將測(cè)序結(jié)果與HBA1基因參考序列進(jìn)行對(duì)比分析,以確定突變堿基及突變位置。

1.6跨越斷裂點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)(Gap-PCR)檢測(cè)β珠蛋白基因缺失 采用缺失型β-地貧基因檢測(cè)試劑盒(Gap-PCR法,深圳亞能生物公司),按操作說明檢測(cè)Gγ+(Aγδβ)0型、Taiwanese型及SEA-HPFH型β-地貧基因缺失。

2 結(jié)果

2.1血液學(xué)表型結(jié)果 如表1和圖1所示,2例患者均表現(xiàn)為MCV和MCH降低的小細(xì)胞低色素表型特征;血紅蛋白毛細(xì)管電泳結(jié)果顯示Z7區(qū)條帶(Hb或Hb Variants)明顯增高,且于Z1區(qū)出現(xiàn)異常帶。此血紅蛋白特異性圖譜提示很可能為HbQ-Thailand變異體,須進(jìn)一步基因檢測(cè)確認(rèn)。

注:A為患者1;B為患者2;均出現(xiàn)Z7區(qū)(HbF或Hb Variant)明顯增高,且于Z1區(qū)檢出變異體。C為正常樣本;D為β-地貧基因缺失雜合子樣本。

表1 2例患者血液學(xué)表型結(jié)果

2.2常見地貧基因突變檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)地貧基因檢測(cè)常規(guī)試劑盒,2例患者均只檢出α-地貧基因-α4.2缺失。按表型與基因型一致的診斷原則,此病例的基因型結(jié)果與其表型特征不符,提示需進(jìn)一步檢測(cè)其他少見或罕見珠蛋白基因突變以明確診斷。

2.3Sanger測(cè)序檢測(cè)結(jié)果 血紅蛋白毛細(xì)管電泳結(jié)果提示為異常血紅蛋白HbQ-Thailand特征性圖譜,經(jīng)α1珠蛋白基因測(cè)序,2例患者均驗(yàn)證為HBA1:c.223G>C(p.74 Asp>His)的HbQ-Thailand異常血紅蛋白變異雜合子。測(cè)序結(jié)果見圖2。

2.4β-地貧基因缺失突變檢測(cè)結(jié)果 缺失型β-地貧基因檢測(cè)試劑盒(Gap-PCR法)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:患者1為β-地貧基因Taiwanese缺失雜合,患者2為β-地貧基因Gγ+(Aγδβ)0缺失雜合。此基因型結(jié)果與Z7區(qū)HbF明顯增加的表型特征相符。見圖3。

注:190 bp為內(nèi)參條帶,250 bp為正常條帶,330 bp是Gγ+(Aγδβ)0型缺失突變條帶,420 bp是SEA-HPFH型缺失突變條帶,670 bp是Taiwanese型缺失突變條帶。1,DL 2000 DNA Marker;2,Gγ+(Aγδβ)0缺失雜合陽性質(zhì)控;3,SEA-HPFH缺失雜合陽性質(zhì)控;4,Taiwanese型缺失雜合質(zhì)控;5,正常樣本;6,患者1樣本(Taiwanese型缺失雜合);7,患者2樣本[Gγ+(Aγδβ)0型缺失雜合]。

2.5患者樣本確定基因型 綜合以上DNA分析檢測(cè)結(jié)果,患者1的基因型為異常血紅蛋白HbQ-Thailand雜合,合并α-地貧-α4.2缺失雜合和β-地貧Taiwanese型缺失雜合(αα/-α4.2,βTaiwanese/βN);患者2為HbQ-Thailand雜合,合并α-地貧-α4.2缺失雜合和β-地貧Gγ+(Aγδβ)0型缺失雜合(αα/-α4.2,βGγ+(Aγδβ)0/βN)。

3 討論

目前廣泛實(shí)施的地貧分子篩查通用方案是通過血常規(guī)和血紅蛋白組分進(jìn)行表型分析,對(duì)表型篩查陽性者進(jìn)行基因分型而明確診斷。除小部分靜止型外,地貧基因攜帶者的紅細(xì)胞參數(shù)表現(xiàn)為MCV<80 fL和/或MCH<27 pg的小細(xì)胞低色素的表型特征[7-8]。血紅蛋白組分分析的HbA2>3.5%和HbF>2%特征常提示為β-地貧基因攜帶。另外,血紅蛋白組分分析中出現(xiàn)其他異常條帶即提示異常血紅蛋白的可能。簡(jiǎn)言之,紅細(xì)胞參數(shù)和血紅蛋白組分的表型特征為地貧和異常血紅蛋白病的進(jìn)一步基因確診提供最重要的線索和依據(jù)。

此研究中2例患者的血紅蛋白組分分析結(jié)果均顯示Z7區(qū)高比例、Z1區(qū)Hb QA2異常帶的HbQ-Thailand特征性毛細(xì)管電泳結(jié)果,也均檢出連鎖遺傳的α-地貧-α4.2缺失,與已報(bào)道的HbQ-Thailand一致[9-10]。HbF明顯增高是β-地貧基因缺失的典型特征,而血紅蛋白組分毛細(xì)管電泳檢測(cè)的HbF和HbQ-Thailand為Z7區(qū)重疊。Z7區(qū)條帶的高比例雖然提示為HbQ-Thailand,但也有可能包含HbF增高的β-地貧基因缺失。本研究的2例患者樣本中均檢出β-地貧基因缺失突變,由此證實(shí)高比例HbQ-Thailand掩蓋了同時(shí)明顯增高的HbF。此結(jié)果也提示,當(dāng)血紅蛋白組分毛細(xì)管電泳分析出現(xiàn)Z7區(qū)高比例,則有必要采用其他方法(如血紅蛋白高效液相色譜法、瓊脂糖凝膠電泳法)對(duì)HbF和HbQ-Thailand進(jìn)行甄別,或同時(shí)進(jìn)行β-地貧基因缺失檢測(cè)以防漏檢。

本研究中2例患者的血液學(xué)表型均無貧血癥狀(Hb正常),僅表現(xiàn)為MCV、MCH輕度降低,降低程度也小于單純的β-地貧基因缺失雜合子[4,11-12],這很可能是β-地貧基因缺失合并α-地貧-α4.2缺失,從而在一定程度上緩解了α-/β-珠蛋白失衡。另外,患者1為未涉及δ(HBD)基因的β-地貧Taiwanese型缺失,HbA2(α2δ2)增高;而患者2為涉及δ(HBD)基因的β-地貧Gγ+(Aγδβ)0型缺失,故HbA2不增高。

HbQ-Thailand是中國(guó)南方人群中較為多見的血紅蛋白病類型[2],但是關(guān)于HbQ-Thailand合并β-地貧基因缺失的報(bào)道不多。本研究結(jié)果提示,很可能是當(dāng)前臨床上廣泛使用的血紅蛋白毛細(xì)管電泳結(jié)果中Z7區(qū)的HbQ-Thailand與HbF重疊,導(dǎo)致β-地貧基因缺失的漏檢。本研究還有待通過更多樣本進(jìn)一步分析總結(jié),為此類復(fù)雜血紅蛋白病的遺傳咨詢和基因診斷提供參考和指導(dǎo)。