人單核細(xì)胞株巨細(xì)胞病毒編碼miR-US25-1-3p過表達(dá)后蛋白質(zhì)組學(xué)變化分析*

周萬青,王成,丁小宇,牛冬梅,沈瀚,張春妮(.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京0008;.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京000;.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院檢驗(yàn)科, 南京 00)

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)在微小核糖核酸(miRNA)調(diào)控細(xì)胞靶蛋白的鑒定和量化研究中具有重要價(jià)值[1-2]。人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在人群中感染率極高,對(duì)于免疫受損人群危害極大,其參與疾病發(fā)生發(fā)展的病理功能尚不完全清楚,HCMV編碼miRNA可能發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞是HCMV主要感染和潛伏細(xì)胞,在病毒感染免疫中發(fā)揮多種功能[3]。基于人單核細(xì)胞細(xì)胞株(THP-1)為模型細(xì)胞,對(duì)miRNA作用蛋白靶點(diǎn)的研究目前已有報(bào)道,如miR-618通過下調(diào)THP-1細(xì)胞環(huán)腺苷酸調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白-19表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4];miR-203a-3p可靶向抑制THP-1中IL-24表達(dá),發(fā)揮抗炎作用[5]。同時(shí),THP-1細(xì)胞也是HCMV編碼miRNA功能研究重要細(xì)胞載體[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在HCMV激活感染人群外周血中有較高水平hcmv-miR-US25-1-3p表達(dá)[6],提示其可能在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用,但其作用靶點(diǎn)不明確。目前,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析HCMV miRNA作用單核細(xì)胞后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究尚未見報(bào)道。因此,本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag,TMT)標(biāo)記聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)對(duì)hcmv-miR-US25-1-3p過表達(dá)THP-1細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,通過生物信息學(xué)分析潛在靶基因及其參與炎癥、疾病及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面功能。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 THP-1人單核細(xì)胞株購自上海生物科學(xué)院細(xì)胞所。

1.2主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司),T100梯度PCR儀、Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Power Supplies Basic電泳儀(美國Bio-Rad公司),RIGOL L-3000高效液相色譜系統(tǒng)(北京普源精電科技公司),CV100真空離心濃縮儀(北京吉艾母科技公司),Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀(美國Thermo Scientific公司),G:BOXChemiXR5凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司),JY96-IIN超聲破碎儀(上海滬析實(shí)業(yè)公司);Trizol、Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司),cDNA第一鏈合成試劑盒、One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(SYBR Green)(大連TaKaRa公司),引物合成、mimics合成(廣州銳博生物科技公司),胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司),TRAIL抗體、RANTES抗體、GAPDH單克隆抗體、羊抗兔IgG-HR、羊抗小鼠IgG-HRP(武漢Proteintech公司),全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、western blot檢測(cè)試劑盒及相關(guān)試劑(上海碧云天生物技術(shù)公司);碘代乙酰胺(IAM)、尿素(美國Amresco公司),XBridge Peptide BEH 5 μm C18色譜柱(美國Waters公司),佛波酯(PMA)、甲酸(FA)(美國Sigma-Aldrich公司),TMT 10 plexTMIsobaric Label Reagent Set、牛血清白蛋白(美國Thermo Scientific公司),乙腈(美國J.T.Baker公司),氨水(日本W(wǎng)ako Pure Chemical Industries公司),胰蛋白酶(美國Promega公司),常規(guī)化學(xué)試劑(南京化學(xué)試劑公司)。

1.3hcmv-miR-US25-1-3p轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞 人THP-1細(xì)胞置于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素)中37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí),采用10 ng/mL濃度PMA刺激24 h;PBS洗滌并更換培養(yǎng)液。用120 μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋5 μL 20 μmol/L miRNA mimics、NC-mimics及空白對(duì)照,輕輕混勻,室溫孵育5 min;用120 μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋5 μL Lipofectamine 3000,輕輕混勻并室溫孵育5 min;將上述2種稀釋液輕輕混勻,室溫孵育20 min;加入含有750 μL完全培養(yǎng)基的上述培養(yǎng)細(xì)胞孔中,輕輕混勻,置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h;收集細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)hcmv-miR-US25-1-3p水平 采用Trizol提取細(xì)胞總RNA,并經(jīng)濃度和純度測(cè)定。采用cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA,按照RT-PCR Kit Ⅱ試劑說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL:DEPC水7 μL、2 × Real time PCR Master Mix(SYBR Green)10 μL、Primer MIX(10 μmol/L)2 μL、cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 40 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。通過儀器配套的分析軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果設(shè)定統(tǒng)一的閾值,分析獲得檢測(cè)的Cq值,采用相對(duì)定量2-ΔΔCq法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,其中ΔΔCq=(CqmiRNA-CqGAPDH)實(shí)驗(yàn)-(CqmiRNA-CqGAPDH)對(duì)照。

表1 本研究中所用引物序列

1.5細(xì)胞蛋白提取、酶解脫鹽及標(biāo)記 按照1.3方法收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞并經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌3次。置冰上(8 mol/L尿素,裂解液與蛋白酶抑制劑體積比為50∶1)超聲裂解120 s;4 ℃、14 000×g離心20 min,收集上清液。取100 μg蛋白質(zhì),加入DTT至終濃度為10 mmol/L,37 ℃ 1 h,恢復(fù)室溫;加入IAM至終濃度為40 mmol/L,避光室溫反應(yīng)45 min;調(diào)節(jié)pH=8,按照蛋白質(zhì)和胰蛋白酶體積比50∶1加入胰蛋白酶,37 ℃過夜;次日,加入50 μL 0.1% FA終止反應(yīng);樣本經(jīng)XBridge Peptide BEH 5 μm C18柱子分離,收集流穿液并凍干。取出TMT試劑并解凍,加入41 μL乙腈,震蕩5 min,離心;將上述TMT試劑加入100 μg酶切樣本中,室溫1 h;加入氨水終止反應(yīng);混合標(biāo)記后的樣品,渦旋震蕩,離心至管底;真空冷凍離心干燥。

1.6LC-MS/MS分析 使用10 μL A液(100%質(zhì)譜水、0.1%甲酸)溶解凍干粉末,4 ℃、14 000×g離心20 min;取1 μg上清液樣品進(jìn)樣,液質(zhì)檢測(cè);使用Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀,Nanospray FlexTM(NSI)離子源,設(shè)定離子噴霧電壓為2.4 kV,離子傳輸管溫度為275 ℃,質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式,質(zhì)譜全掃描范圍為407～1 550 m/z,一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為60 000(200 m/z),自動(dòng)增益控制(automatic gain control, AGC)為3×106,C-trap最大注入時(shí)間為20 ms;選取全掃描中離子強(qiáng)度TOP40的母離子使用高能碰撞裂解方法碎裂,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè),二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為45 000(200 m/z),AGC為5×104,最大注入時(shí)間為86 ms,肽段碎裂碰撞能量設(shè)為32%,生成質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)。

1.7數(shù)據(jù)處理及蛋白質(zhì)注釋 采用Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.4軟件搜索Uniprot_ Pseudomonas syringae pv.tomato(2020.04.22 download)數(shù)據(jù)庫,對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO[7]、KEGG[8]和COG[9]注釋分析。將每個(gè)蛋白質(zhì)的兩個(gè)比較樣品對(duì)中的相對(duì)定量值進(jìn)行t檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)差異性。以差異倍數(shù)(FC)≥1.20,同時(shí)P≤0.05時(shí),篩選上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì);以FC≤1/1.20,同時(shí)P≤0.05時(shí),篩選下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)。對(duì)鑒定出差異表達(dá)蛋白質(zhì)(different expression protein,DEP)進(jìn)行GO、KEGG和COG注釋分析。

1.8western blot 按照1.3方法收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞,冷PBS洗2次;加入細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl,150 mmol/L NaCl,0.02% NaN3,1% NP-40,適量蛋白酶抑制劑)提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA法測(cè)定總蛋白濃度后取50 μg總蛋白進(jìn)行western blot分析。樣品電泳分離后,蛋白質(zhì)條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,1∶1 000稀釋一抗(兔抗人TRAIL、RANTES、兔抗人GAPDH抗體)孵育過夜;次日,按1∶2 000稀釋二抗反應(yīng)1.5 h。用TBST清洗條帶后加入熒光底物,采用G:BOXChemiXR5成像,并使用Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1hcmv-miR-US25-1-3p轉(zhuǎn)染效率 THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染hcmv-miR-US25-1-3p mimics、NC mimics后,提取細(xì)胞總RNA,并經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)各組hcmv-miR-US25-1-3p水平。結(jié)果顯示,hcmv-miR-US25-1-3p mimics組表達(dá)水平達(dá)138.72±5.85,高于NC組(1.1±0.05)和control組(1.00±0.06),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。表明hcmv-miR-US25-1-3p過表達(dá)THP-1細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

2.2蛋白質(zhì)組基本信息 轉(zhuǎn)染hcmv-miR-US25-1-3p mimics為實(shí)驗(yàn)組,轉(zhuǎn)染NC mimics為對(duì)照組,每組3個(gè)樣本。兩組樣本主成分分析(PCA)顯示,兩組間的總體差異性顯著,而組內(nèi)3個(gè)樣本間變異度較小,見圖1A。共鑒定3 254個(gè)蛋白質(zhì),經(jīng)過COG、KEGG和GO生物學(xué)重復(fù)和結(jié)果重疊,共有3 239個(gè)蛋白質(zhì)被量化。將3個(gè)注釋結(jié)果集合分析,見圖1B。

注:A,兩組樣本主成分分析(PCA);B,蛋白質(zhì)功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Venn圖;nc,陰性對(duì)照無義序列RNA mimics組;mim,hcmv-miR-US-25-1-3p mimics組。

2.3差異表達(dá)蛋白篩選及聚類分析 利用t檢驗(yàn)分析兩樣本間顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì),篩選出差異蛋白65個(gè),其中上調(diào)蛋白質(zhì)17個(gè),下調(diào)蛋白質(zhì)48個(gè),見表2。以兩組樣本FC求取log2對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以t檢驗(yàn)顯著性檢驗(yàn)P值的負(fù)對(duì)數(shù)-log2(Pvalue)為縱坐標(biāo),采用軟件ggplot2,以FC閾值≥1.20或者≤1/1.20、P≤0.05,可得火山圖,見圖2A。采用heatmap.3和RColorBrewer軟件,繪制差異蛋白熱圖?？梢?差異表達(dá)蛋白聚類可明確區(qū)分兩組樣本,見圖2B。

注:A,差異蛋白火山圖;B,差異蛋白聚類圖;紅色代表上調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì);綠色代表下調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì);黑色代表未有顯著變化蛋白質(zhì)。

表2 差異表達(dá)蛋白定量結(jié)果

2.4差異蛋白功能注釋及富集分析 GO注釋分析顯示,差異蛋白參與抗病毒作用、免疫反應(yīng)、趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)信號(hào)通路、Ⅰ型干擾素反應(yīng)、NF-κB信號(hào)通路;具有細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、清道夫受體活性、抗原結(jié)合、錳離子結(jié)合、蛋白質(zhì)同構(gòu)化活性等。KEGG通路分析顯示,差異表達(dá)蛋白主要參與炎癥反應(yīng)中各種信號(hào)通路、代謝過程、細(xì)胞及遺傳信息功能,以及腫瘤、病毒性心肌炎、非酒精性脂肪肝、原發(fā)性免疫缺陷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多種病毒原蟲及細(xì)菌感染、阿爾茨海默病、亨廷頓病等多種疾病。其中,下調(diào)蛋白主要參與流感病毒等病毒和細(xì)菌感染、亨廷頓病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、NF-κB等信號(hào)通路、細(xì)胞因子介導(dǎo)信號(hào)通路等;上調(diào)蛋白主要參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫病、膀胱癌等腫瘤、多種病毒原蟲及細(xì)菌感染、NF-κB等信號(hào)通路、細(xì)胞因子介導(dǎo)信號(hào)通路等。COG注釋分析顯示,差異蛋白參與生理功能包括:能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換;細(xì)胞周期調(diào)控、分化、染色體分區(qū);核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;酶分子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成;轉(zhuǎn)錄;復(fù)制、重組和修復(fù);翻譯后修飾、分子伴侶;無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)。其中,下調(diào)蛋白主要參與翻譯后修飾、分子伴侶;細(xì)胞周期調(diào)控、分化、染色體分區(qū);碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成,等。而上調(diào)蛋白主要參與酶分子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;轉(zhuǎn)錄;翻譯后修飾、分子伴侶。

2.5hcmv-miR-US25-1-3p對(duì)靶蛋白表達(dá)調(diào)控驗(yàn)證 為驗(yàn)證蛋白組學(xué)結(jié)果,通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),TRAIL和RANTES蛋白在HCMV感染過程中發(fā)揮重要作用,據(jù)此被選定為驗(yàn)證靶蛋白。經(jīng)RNAhybrid對(duì)hcmv-miR-US25-1-3p與TRAIL和RANTES的mRNA 3′-UTR預(yù)測(cè),其結(jié)合自由能分別為-22.1 kcal/mol和-22.3 kcal/mol,見圖3。進(jìn)一步western blot結(jié)果顯示,過表達(dá)hcmv-miR-US25-1-3p可顯著抑制TRAIL和RANTES蛋白表達(dá),見圖4。

圖3 hcmv-miR-US25-1-3p與候選靶基因的mRNA 3′-UTR預(yù)測(cè)

注:* ,P<0.05;** ,P<0.01。

3 討論

病毒感染可引起宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化,進(jìn)而影響細(xì)胞正常生理功能,基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究病毒感染宿主細(xì)胞后差異蛋白表達(dá)譜有助于進(jìn)一步揭示病毒與宿主細(xì)胞的相互作用及病毒的致病機(jī)制[10]。HCMV在人群中有極高的潛伏感染率,其在感染過程中通過編碼多種miRNA作用于病毒或宿主細(xì)胞基因,發(fā)揮調(diào)節(jié)病毒和宿主細(xì)胞功能[11]。本課題組前期研究揭示HCMV激活感染患者外周血中hcmv-miR-US25-1-3p水平顯著高表達(dá)[6],但對(duì)于其參與病毒感染及臨床相關(guān)疾病的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。因此,為探討hcmv-miR-US25-1-3p作用靶基因及其參與病毒感染及宿主疾病發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制,本研究采用TMT聯(lián)合LC-MS/MS蛋白組學(xué)技術(shù)[12-13]進(jìn)行hcmv-miR-US25-1-3p過表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞蛋白的影響及可能靶基因篩選、驗(yàn)證探討,發(fā)現(xiàn)hcmv-miR-US25-1-3p可明顯影響THP-1細(xì)胞蛋白表達(dá),且差異表達(dá)蛋白參與病原體感染等病理過程,其中免疫相關(guān)TRAIL和RANTES蛋白經(jīng)western blot驗(yàn)證,可明顯受hcmv-miR-US25-1-5p調(diào)控,表明二者可能是HCMV感染及相關(guān)病理過程中發(fā)揮重要作用的靶基因。

RANTES為受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子,屬于趨化因子CC家族(CCL5),其受體包括CC趨化因子受體(C-C motif chemokine receptor,CCR)1、3、4和5,其中CCR5親和力最高。CCL5/CCR5軸下游通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶、NF-κB、低氧誘導(dǎo)因子、RAS-ERK-MEK、JAK-STAT、TGF-β-SMAD,涉及細(xì)胞增殖、血管再生、凋亡、侵襲、分化、轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)[14-16]。研究發(fā)現(xiàn),CCL5/CCR5參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等自身免疫病,在動(dòng)脈粥樣硬化、肝炎、腫瘤及各種病原體感染如新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促進(jìn)疾病進(jìn)程功能[15]。由此可見,CCL5/CCR5參與炎癥、腫瘤、病毒感染和免疫反應(yīng)。在HCMV感染過程中,病毒通過編碼pUL21.5蛋白以高親和力選擇性結(jié)合RANTES,阻斷RANTES與其細(xì)胞受體的結(jié)合,在宿主抗病毒感染過程中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[17];既往研究顯示,HCMV亦可通過編碼hcmv-miR-UL148d靶向RANTES并降低RANTES表達(dá)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[18]。本研究發(fā)現(xiàn)hcmv-miR-US25-1-3p同樣可靶向RANTES分子,提示其同樣可抑制免疫細(xì)胞反應(yīng)性,達(dá)到抑制宿主對(duì)病毒的殺傷,維持病毒潛伏狀態(tài)。有研究顯示,阻斷CCL5/CCR5可能通過抑制炎性細(xì)胞因子來減輕由單純皰疹病毒1型引起的異常性疼痛和痛覺過敏,并有望成為單純皰疹病毒1型感染導(dǎo)致皰疹相關(guān)疼痛的治療靶點(diǎn)[19]。而本研究結(jié)果則提示hcmv-miR-US25-1-3p通過作用RANTES并使其下調(diào),進(jìn)而促進(jìn)病毒潛伏、免于宿主細(xì)胞殺傷。

TRAIL為Apo2配體/TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Apo2 ligand/TNF related apoptosis-inducing ligand,Apo2L/TRAIL),又名TNFSF10,屬TNF家族成員,多種免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞在一定的刺激下可表達(dá)[20]。TRAIL作為免疫效應(yīng)分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,參與感染過程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自身免疫病等[21-23]。TRAIL在病毒感染發(fā)生過程中發(fā)揮抗病毒功能。HCMV通過編碼hcmv-miR-US25-1-3p作用TRAIL分子并使其表達(dá)降低,使得宿主細(xì)胞殺傷病毒感染細(xì)胞能力降低,有利于病毒的免疫逃逸。

本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討hcmv-miR-US25-1-3p作用靶點(diǎn)及其參與疾病分子機(jī)制。通過GO、COG和KEGG注釋及功能預(yù)測(cè)研究發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)蛋白主要參與感染相關(guān)炎癥、抗病毒等。hcmv-miR-US25-1-3p可能通過作用TRAIL和RANTES并使其表達(dá)下調(diào),進(jìn)而促進(jìn)病毒潛伏、免于宿主細(xì)胞殺傷。為進(jìn)一步揭示HCMV miRNA在病毒感染過程中功能發(fā)揮提供一定依據(jù),并為尋找抗病毒治療靶點(diǎn)研究提供新的方向。本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué),可直觀展示miRNA作用基因的蛋白質(zhì)水平。但是,病毒感染是一個(gè)復(fù)雜的過程。HCMV在潛伏向激活轉(zhuǎn)變中存在很多miRNA的表達(dá)增加,而僅采取體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式給予其中一個(gè)miRNA仍存在片面性,miRNA與蛋白質(zhì)間靶向關(guān)系的多樣性仍有待后續(xù)深入評(píng)估。